超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定全麥粉中的赭曲霉毒素A

唐德紅，張 季，張冰雪，任 偉，張丹丹，劉 沖

（遵義市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測院，貴州遵義 563000）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是食物中最常見的霉菌毒素之一[1]，是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級代謝產(chǎn)物[2-4]，廣泛存在于各種食物中。其中，谷物及其副食品是赭曲霉毒素A 的主要來源，其具有較強(qiáng)的肝毒性、腎毒性及免疫毒性，并可能致癌、致畸、致突變[5-8]，被認(rèn)為是僅次于黃曲霉毒素類的真菌毒素類致癌物[9-13]。因此，防止污染赭曲霉毒素A 的食品直接進(jìn)入人類食物鏈，加強(qiáng)對赭曲霉毒素A的檢測具有重要意義。

近年來，用于分析食品中赭曲霉毒素A 的方法有高效液相熒光檢測法、薄層色譜測定法、酶聯(lián)免疫吸附法和高效液相色譜質(zhì)譜法等，其中高效液相熒光檢測法較為常用，但該方法限制條件嚴(yán)苛，影響結(jié)果的因素較多，且實(shí)測樣品全麥粉基質(zhì)較為復(fù)雜。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，HPLCMS/MS）兼具液相色譜和質(zhì)譜的特點(diǎn)，其靈敏度高、定量限低、選擇性強(qiáng)、精密度高，且具有較好的分離能力。在數(shù)據(jù)定量過程中，該方法可排除樣品中的假陽性結(jié)果，進(jìn)一步確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

全麥粉是小麥加工制成的具有純籽粒營養(yǎng)的面粉，外層麩皮含有大量的粗纖維、抗性淀粉和低聚糖，對糖尿病患者身體健康尤為有利，可能會改善糖循環(huán)、降低血糖指數(shù)、血脂水平[14-16]，生活中可作為大多數(shù)烘焙食品的原料。全麥粉作為國家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則中的重點(diǎn)品種，赭曲霉毒素A 為其必檢項目，其主要來源于種植培育階段、收割存儲過程，受病害蟲、溫濕度、生長環(huán)境土壤氣候影響[17]，容易在作物發(fā)生霉變后產(chǎn)生，及時發(fā)現(xiàn)能有效減少其對人體的危害。

《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中赭曲霉毒素A 的測定》（GB 5009.96—2016）對谷物類、豆類、酒類、咖啡類等的限量值及相關(guān)要求進(jìn)行了規(guī)定，但由于小麥粉粒徑較細(xì)，經(jīng)原料直接粉碎后麩皮含量高、顏色深，基質(zhì)復(fù)雜，常規(guī)的凈化方法處理雜質(zhì)不完全，受基質(zhì)影響較大導(dǎo)致回收率低。基于此，本實(shí)驗(yàn)在國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，以未知濃度的考核樣品、質(zhì)控樣品為研究對象，選擇比較不同的免疫親和柱，鑒于赭曲霉毒素A 本身的特性優(yōu)化不用的洗脫溶劑，結(jié)合高靈敏度的超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra High Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS），建立快捷高效準(zhǔn)確的分析方法，為實(shí)際生活中測定全麥粉中赭曲霉毒素A 提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全麥粉樣品購自國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院，分別為全麥粉A、全麥粉B、全麥粉C，全麥粉陰性樣品、質(zhì)控樣品。

1.2 儀器

1.3 試劑

赭曲霉毒素A（OTA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（1.9 μg·mL-1，國家糧食局科學(xué)研究院）；赭曲霉毒素A 穩(wěn)定同位素（[13C]-OTA）標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 μg·mL-1，奧地利Romer公司）；乙腈、甲醇均為質(zhì)譜級（美國天地有限公司）；乙酸（色譜純，天津市科密歐試劑有限公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 PBS 緩沖溶液的配制

準(zhǔn)確稱量8.0 g 氯化鈉，1.2 g 磷酸氫二鈉，0.2 g 磷酸二氫鉀，0.2 g 氯化鉀，加適量水超聲使其完全溶解，加水定容至1 L。洗脫液由98 mL 甲醇和2 mL 冰乙酸混合而成。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密移取OTA 標(biāo)準(zhǔn)溶液、同位素內(nèi)標(biāo)液適量，用乙腈分別稀釋成濃度為95 ng·mL-1、20 ng·mL-1的中間儲備液，于-20 ℃冰箱中儲存。臨用時移取中間儲備液適量，用乙酸-甲醇溶液配制濃度分別為0.475 ng·mL-1、0.950 ng·mL-1、1.900 ng·mL-1、4.750 ng·mL-1和9.500 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個標(biāo)準(zhǔn)系列的溶液內(nèi)標(biāo)含量均為1 ng·mL-1，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4.3 樣品制備

準(zhǔn)確稱取5 g 試樣，加入一顆陶瓷均質(zhì)子，準(zhǔn)確加入20 mL 提取液（乙腈∶水=60 ∶40），置于渦旋振蕩器，2 500 r·min-1提取30 min，11 000 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確移取上清液2 mL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)儲備液（濃度0.1 μg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液），再加入13 mL PBS 溶液稀釋，混勻，11 000 r·min-1離心5 min。取出免疫親和柱，恢復(fù)至室溫。將免疫親和柱連接于注射器下，以每秒1 ～2 滴的流速使稀釋液通過免疫親和柱，用20 mL 水淋洗，棄去全部流出液，用剪去尖端的洗耳球抽干小柱，濾紙擦拭干親和柱內(nèi)壁水珠。準(zhǔn)確加入2.0 mL 冰乙酸-甲醇洗脫液，收集全部洗脫液于試管中，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，進(jìn)樣分析。陰性樣品、質(zhì)控樣品處理方法同上。

1.4.4 儀器條件

小型緊湊化是高功率脈沖驅(qū)動源的一個重要發(fā)展方向[1-4]，能夠產(chǎn)生近似方波脈沖的Marx發(fā)生器受到了廣泛關(guān)注[5-8]。一般將傳統(tǒng)Marx發(fā)生器中的電容器改為脈沖形成網(wǎng)絡(luò)，可使發(fā)生器輸出近似方波脈沖，再將各級脈沖形成網(wǎng)絡(luò)以Marx發(fā)生器的形式進(jìn)行疊加，即可達(dá)到增加輸出功率、大幅減小脈沖驅(qū)動源體積的目的。

（1）色譜條件。色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：A 相為乙腈，B 相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，洗脫程序：0 ～1.0 min，70%B；1.0 ～2.5 min，70%B→40%B；2.5 ～4.0 min，40%B→0%B；4.0 ～5.0 min，0%B；5.0 ～6.0 min，0%B→40%B；6.0 ～8.0 min，70%B。

（2）質(zhì)譜條件。離子源為帶有Agilent 噴射流技術(shù)的電噴霧離子源；干燥氣溫度：250 ℃；干燥氣流量：11 L·min-1；噴嘴電壓：35 psi；鞘氣溫度：350 ℃；鞘氣流量：12 L·min-1；電噴霧電壓為4 000 V；采用正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測條件的優(yōu)化

分別在正離子模式和負(fù)離子模式下，選擇Q1 MS1 全掃描模式進(jìn)行母離子掃描，獲得在對應(yīng)模式下的質(zhì)荷比，利用Q3 MS2 碎片離子掃描模式，尋找二級質(zhì)譜碎片離子。在優(yōu)化過程中，發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式下母離子響應(yīng)較低，且碎片離子較少，所以選擇正離子模式分析，選擇響應(yīng)最高的兩個碎片分別作為定量離子和定性離子。碰撞能以5 V 為間隔，從15 V 調(diào)至50 V，優(yōu)化碰撞能，觀察被測組分出峰時間，確保圖譜由12 ～15 個采集點(diǎn)構(gòu)成，確定駐留時間，最后采用多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行檢測，相關(guān)定量及定性檢測離子條件見表1。

表1 赭曲霉毒素A 及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件

2.2 赭曲霉毒素A 免疫親和柱的選擇

在實(shí)驗(yàn)過程中，同時選擇了A、B、C 3 個不同生產(chǎn)廠家的具有相同柱容量和柱體積的免疫親和柱進(jìn)行凈化測定，測定的原理均為基于抗原抗體反應(yīng)，赭曲霉毒素A 抗體連接在柱內(nèi)凝膠上，樣品中赭曲霉毒素A 抗原經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢通過赭曲霉毒素A 免疫親和柱，在柱內(nèi)與抗體結(jié)合，之后洗滌免疫親和柱除去沒有被結(jié)合的其他物質(zhì)，用洗脫液洗脫赭曲霉毒素A，注入UPLC-MS/MS 儀器中檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，廠家A 的免疫親和柱回收率相對偏低，且批間穩(wěn)定性差異較大，廠家B 和廠家C 的免疫親和柱回收率均為85%以上，綜合考慮成本價格，最終選擇廠家B 的免疫親和柱進(jìn)行本次實(shí)驗(yàn)。

廠家A 回收率偏低的原因有以下幾點(diǎn)：①由于赭曲霉毒素A 中含有保護(hù)凝膠和抗體的PBS 溶液，只能陸路運(yùn)輸，運(yùn)送時間較長，無法確保整個運(yùn)輸過程中的溫度與赭曲霉毒素A要求的儲藏溫度一致，可能導(dǎo)致回收率偏低；②免疫親和柱的柱空白，即免疫親和柱自身本底可能會干擾赭曲霉毒素A 的測定，從而影響回收率；③免疫親和柱內(nèi)抗體對有機(jī)溶劑的耐受性，樣品經(jīng)提取過濾，會用一定體積倍數(shù)的PBS 溶液稀釋，使其有機(jī)溶劑的含量在10%以下，以避免對抗體的破壞。

2.3 洗脫溶劑的選擇

在GB 5009.96—2016 的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了洗脫液和洗脫液體積，采用標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的洗脫液甲醇和含2%冰乙酸的甲醇進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液時回收率更高，可能與赭曲霉毒素A 自身結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)相關(guān)。此外，本文進(jìn)一步優(yōu)化了洗脫液的體積，分別采用1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、3.0 mL 的含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液，對加標(biāo)的全麥粉陰性樣品進(jìn)行洗脫，結(jié)果表明洗脫液體積為2.0 mL 時，回收率高于85%，洗脫液體積為1.0 mL 和3.0 mL 時，赭曲霉毒素A 回收率均偏低，可能是洗脫不完全或洗脫雜質(zhì)的增加干擾了質(zhì)譜的響應(yīng)，最終依據(jù)實(shí)驗(yàn)具體過程和操作選擇2.0 mL 含2%冰乙酸的甲醇作為洗脫液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性

精密稱取陰性樣品5 g，按1.4.3 項下方法操作處理樣品后，進(jìn)樣分析，獲得陰性樣品色譜圖（圖1）；將一定濃度對照品溶液加入5 g 陰性樣品中，同樣按“1.4.3”項下方法操作，進(jìn)樣分析，獲得含對照樣品色譜圖（圖2）；取待測樣品5 g，依法操作待測樣品色譜圖（圖3）。結(jié)果顯示，全麥粉中內(nèi)源性物質(zhì)對待測物的測定無干擾。

圖2 對照樣品中OTA 及其同位素內(nèi)標(biāo)MRM 色譜圖

圖3 實(shí)測樣品中OTA 及其同位素內(nèi)標(biāo)MRM 色譜圖

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限、定量限

取陰性樣品5 g，分別依次加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，按1.4.3 項下操作處理后進(jìn)樣分析，以待測物的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比（A/Ai）為縱坐標(biāo)，各待測物濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，赭曲霉毒素在0.475 ～9.500 ng·mL-1具有良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)r為0.999 9，線性方程為Y=1.298X-0.043。全麥粉中赭曲霉毒素A 以3 倍信噪比確定檢出限為0.68 μg·kg-1、10 倍信噪比確定定量限為2.27 μg·kg-1。GB 5009.96—2016 中規(guī)定了全麥粉中赭曲霉毒素A 的檢出限和定量限分別為1.0 μg·kg-1和3.0 μg·kg-1，因此本方法檢出限和定量限滿足檢測需求。

2.4.3 精密度

取陰性樣品5 g，分別加入3 個不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制含赭曲霉毒素A 的低、中、高3 個濃度（質(zhì)量濃度依次為0.95 ng·mL-1、1.90 ng·mL-1、4.75 ng·mL-1）的質(zhì)量控制（Quality Control，QC）樣品，按1.4.3 項下操作處理后進(jìn)樣分析，每個濃度平行配制6 樣本，于1 d 連續(xù)測定考察日內(nèi)精密度，每次均制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將QC 樣品經(jīng)儀器檢測所得A/Ai代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算QC 樣品的濃度，并與QC 樣品理論濃度比較，得出該方法的精密度。如表2 所示，精密度RSD ＜2%，提示該方法精密度良好，符合標(biāo)準(zhǔn)分析方法要求。

表2 赭曲霉毒素 A 的精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4.4 回收率

精密稱取陰性樣品5 g，分別添加赭曲霉毒素A至理論濃度為2.37 μg·kg-1、4.75 μg·kg-1、9.50 μg·kg-1，考察3 種濃度下該方法的加標(biāo)回收，按1.4.3 項下樣品前處理條件進(jìn)行處理并測定，每個添加濃度3 個平行樣品，計算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。由表3 可知，平均回收率在85.62%～99.42%，RSD在1.92%～4.66%，表明提取回收率良好，可用于全麥粉樣品中赭曲霉毒素A 的測定。

表3 赭曲霉毒素 A 的方法回收率（n=3）

2.5 質(zhì)控樣品的測定

精密稱取質(zhì)控樣品5 g，按1.4.3 項進(jìn)行樣品前處理，然后進(jìn)樣分析測定，測得質(zhì)控樣品含量為2.62 μg·kg-1，該結(jié)果在質(zhì)控樣值允許范圍內(nèi)[（3.1±0.676）μg·kg-1]，表明方法可用于全麥粉質(zhì)控樣品中赭曲霉毒素A 的測定。

2.6 全麥粉中赭曲霉毒素A 的測定

分別準(zhǔn)確稱取國家糧食和物資儲備局科學(xué)研究院糧油質(zhì)量安全研究所研制的全麥粉中赭曲霉毒素A（低、中、高）3 濃度水平質(zhì)控樣品5 g，每份稱取6個平行，按優(yōu)化好的前處理方法提取凈化后，進(jìn)樣分析檢測，結(jié)果如表4 所示。3 個樣品含量分別為（2.15±0.07）μg·kg-1、（4.20±0.14）μg·kg-1、（8.26±0.18）μg·kg-1，且6 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的RSD 較小，提示該方法重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高，可用于較為復(fù)雜基質(zhì)中赭曲霉毒素A 的測定。

表4 樣品中赭曲霉毒素A 的測定結(jié)果

3 結(jié)論

赭曲霉毒素A 是廣泛存在的具有較強(qiáng)毒性的真菌毒素，對人類健康有潛在風(fēng)險，建立健全高效準(zhǔn)確快速的檢驗(yàn)方法，有利于保障食品安全。本研究在現(xiàn)行檢測赭曲霉毒素A 的國家標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了前處理方法，采用同位素內(nèi)標(biāo)法處理樣品，以減少實(shí)驗(yàn)誤差，消除基質(zhì)效應(yīng)及離子化干擾，提高檢測結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確度；同時結(jié)合UPLC-MS/MS方法進(jìn)行分析檢測，較常用的液相色譜而言，不僅可以保留時間定性，同時能夠滿足定量離子、定性離子同時出峰，且與標(biāo)準(zhǔn)品一致，且離子豐度比達(dá)到要求，優(yōu)化后的方法有效避免了假陽性結(jié)果，能夠保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，由于全麥粉色澤較深，麩皮細(xì)膩，選擇免疫親和柱法凈化，樣品更清潔，可減少復(fù)雜的基質(zhì)干擾，但免疫親和柱本質(zhì)為抗原抗體特異性結(jié)合，因此確保親和柱的有效性至關(guān)重要。結(jié)合最終結(jié)果可知，本方法可為全麥粉中赭曲霉毒素A 的快速準(zhǔn)確分析檢測提供參考，可為人們的健康安全提供保障。