核酸適配體在食品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用研究進展

李美芬，袁 月，馬 瑞

（云南孚爾質(zhì)量檢驗檢測有限公司，云南昆明 650000）

隨著人們生活水平不斷提高，動物性產(chǎn)品的需求量也在不斷增加[1]，獸藥殘留問題也越來越受重視。獸藥殘留主要包括抗生素類藥物殘留、激素類藥物殘留、抗病毒藥物殘留及抗寄生蟲類藥物殘留等[2]。獸藥殘留可能引起過敏反應(yīng)、增加細菌耐藥性、擾亂腸道微生物菌群平衡、污染環(huán)境，甚至有致突變、致癌和致畸作用[3-5]。因此，必須高度重視動物性食品獸藥殘留的檢測，切實加強食品安全監(jiān)管。核酸探針法檢測獸藥殘留是一種靈敏、快速、可靠的檢測技術(shù)，目前已有越來越多的學(xué)者致力于該方法的探究。本文對核酸適配體在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用研究進展進行簡要介紹，期望為動物性食品獸藥殘留的監(jiān)管和檢測技術(shù)的深入研究提供一定的參考。

1 核酸適配體

核酸適配體（Aptamer，Apt）是一種通過體外配體指數(shù)富集系統(tǒng)進化技術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）從人工構(gòu)建的寡核苷酸文庫中篩選出來的一段長度為20 ～60 nt 的單鏈寡核苷酸序列[6]。當(dāng)Apt 與靶物質(zhì)共存時，靶物質(zhì)能夠誘導(dǎo)Apt 由自由構(gòu)象折疊成特有的三維空間結(jié)構(gòu)，如莖環(huán)、發(fā)夾、G-四鏈體等[7-9]，并通過堿基對的堆積作用、靜電作用[10]、氫鍵作用[11-12]、范德華力[13]等與靶物質(zhì)特異性結(jié)合[14]，具有親和力高、特異性強、靶分子范圍廣、易于制備和修飾、穩(wěn)定性與可復(fù)性好等優(yōu)勢[15-17]。由此，核酸適配體在食品安全控制、分析化學(xué)、分子生物學(xué)以及環(huán)境檢測等方面被廣泛應(yīng)用[18]。

獲得親和性高的單一適配體序列是Apt 技術(shù)的核心。SELEX 技術(shù)是目前最常用的Apt 篩選手段，通常是從一個1014～1015庫容量的隨機寡核苷酸文庫中篩選與靶物質(zhì)特異性結(jié)合且具有高親和力的Apt，包括單鏈DNA 文庫合成、單鏈RNA 文庫制備、孵育、分離、轉(zhuǎn)化、擴增、單鏈DNA 次級文庫制備7 個步驟，經(jīng)1 ～25 輪的篩選，即可能得到Apt[19-20]。

2 核酸適配體在食品中獸藥殘留檢測的應(yīng)用

憑借Apt 的優(yōu)勢，其在動物源食品的獸藥殘留檢測發(fā)展快速。檢測方法主要有納米比色法、熒光分析法、化學(xué)發(fā)光分析法、電化學(xué)傳感器檢測法以及表面增強拉曼散射檢測法。

2.1 納米比色法

納米比色法是基于納米顆粒表面性質(zhì)改變后，顏色會發(fā)生變化而建立的一種分析方法，主要有納米金、納米銀等材料[21]。金納米顆粒（Au Nanoparticles， AuNPs）具有高消光系數(shù)和良好的光學(xué)效應(yīng)，近年來在分析檢測領(lǐng)域受到相關(guān)人員的青睞[22]。納米金比色法最早由Mirkin 等提出，主要分析方法有兩類：①基于納米材料的光學(xué)特性顯色，依據(jù)靶物質(zhì)觸發(fā)AuNPs 聚集，導(dǎo)致波長紅移，可通過紫外可見光譜或肉眼進行測定；②基于酶催化的顯色，AuNPs 替代有機分子作為模擬酶催化反應(yīng)中的底物，提高穩(wěn)定性[23-25]。

張萬方等[26]建立了一種納米金核酸適配體雜交鏈式反應(yīng)放大比色法快速檢測動物源性食品中氨芐青霉素的殘留量，通過Apt 與氨芐青霉素結(jié)合，引發(fā)適配體與發(fā)夾型DNA 探針的級聯(lián)交叉互補放大效應(yīng)，使其與AuNPs 表面的負電產(chǎn)生排斥作用，引起AuNPs 在高鹽濃度下發(fā)生聚集，吸收光譜發(fā)生紅移，該方法最低檢測限可達10 nmol·L-1，檢測回收率在92.30%～103.27%。錢成等[27]首次利用Apt 修飾的AuNPs 設(shè)計出邏輯開關(guān)組，通過Apt、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪控制AuNPs 的聚集和分散，同時快速檢測牛奶中的三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪，三聚氰胺的檢出限為85 μg·L-1，環(huán)丙氨嗪的檢出限為9.0 μg·L-1。ZHOU 等[28]利用Apt 與AuNPs 結(jié)合的比色法測定氟喹諾酮類藥物氧氟沙星，線性范圍為72.2 ～144.4 ng·L-1，檢出限為1.2 ng·L-1，具有較高的特異性，成本低、操作簡單。但由于納米顆粒的聚集行為容易受溫度、鹽濃度等的影響，可能出現(xiàn)假陽性，導(dǎo)致檢測體系不穩(wěn)定，而使用模擬酶催化的比色法可以避免這種問題。例如HUANG 等[29]將核酸適配體特異性識別結(jié)合的特性與DNA zyme 功能化納米探針催化顯色原理相結(jié)合，建立了一種新型比色生物傳感器，并將其用于檢測奶粉中氯霉素殘留，該實驗將過氧化氫酶模擬物及適配體互補探針cDNA 與AuNPs 結(jié)合，構(gòu)建新的納米金探針，過氧化氫酶模擬物能催化H2O2，使3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethylbenzidine TMB）氧化并產(chǎn)生比色信號，研究發(fā)現(xiàn)奶粉樣品中加標(biāo)回收率在92.0%～104.0%，相對標(biāo)準偏差＜2.7%，檢測信號大大增強。趙晨等[30]在采用AuNPs 比色法檢測水產(chǎn)品中孔雀石綠的研究中，也建立了一種基于十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl trimethyl ammonium BromideCTAB）抑制AuNPs 過氧化物模擬酶活性的可視化檢測方法，檢測范圍在0.01 ～2.00 μmol·L-1，檢出限為1.8 nmol·L-1；同時以磁性Fe3O4納米顆粒（Fe3O4NPs）過氧化物模擬酶為催化劑，催化H2O2，氧化TMB 顯示藍色，根據(jù)DNA 適配體對Fe3O4NPs 模擬酶催化活性的抑制作用以及靶物質(zhì)孔雀石綠與DNA 適配體結(jié)合的特異性，對靶物質(zhì)的檢測范圍為0.1 ～1.0 μmol·L-1，檢出限為9.5 nmol·L-1。對比發(fā)現(xiàn)，AuNPs 模擬酶催化法檢出限更低，可用于物質(zhì)的微量檢測。

2.2 熒光分析法

熒光分析法是基于熒光物質(zhì)在一定的激發(fā)波長下能夠發(fā)射熒光的原理，通過檢測熒光強度的變化，對測定物質(zhì)進行定性或定量分析的一種方法，具有高靈敏度、低背景值和良好選擇性等優(yōu)點，在生命醫(yī)學(xué)、化學(xué)、食品安全控制和環(huán)境檢測等各種檢測領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用[31]。Apt 本身不產(chǎn)生熒光，需要在反應(yīng)體系中引入熒光基團、熒光淬滅劑、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）和熒光內(nèi)濾效應(yīng)（Inner Filter Effect，IFE），引起熒光信號強度的變化。熒光基團包括熒光蛋白、熒光燃料、量子點、金屬納米粒子、碳點和納米材料等具有熒光性能的有機物、無機物和納米材料。許多納米材料除了本身有熒光效應(yīng)，也能作為熒光淬滅劑，還具有吸附單鏈核酸分子的能力，如氧化石墨烯（Graphene Oxide，GO）、納米金顆粒、金屬納米顆粒（Metal Nanoparticles，MNPs）、上轉(zhuǎn)換納米顆粒（Up-Conversion Nanoparticles，UCNPs）、碳納米管（Carbon Nanotubes，CNTs）、二氧化錳納米片和各種納米復(fù)合材料等。FRET 是當(dāng)熒光供體和熒光受體的距離足夠近時，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[32]。

熒光分析法根據(jù)Apt 的標(biāo)記分為標(biāo)記型檢測法和非標(biāo)記型檢測法兩類。其中，標(biāo)記型檢測法具有靈敏度高、響應(yīng)快速、可標(biāo)記的熒光物質(zhì)多等優(yōu)點，具有多重和實時檢測能力[33]，尤其引入新型納米熒光材料時，熒光檢測能力大大提升。如ZHANG等[34]用核殼上轉(zhuǎn)換納米粒子（Core-Shell Upconversion Nanoparticles，CSUNPs）作為熒光供體，GO 作為熒光受體，構(gòu)建了一個基于適配體的CSUNPs-GO 熒光共振能量轉(zhuǎn)移平臺，以檢測食品中恩諾沙星殘留量，結(jié)果表明，溶液中恩諾沙星檢測限為0.47 ng·mL-1，商業(yè)奶粉樣品中的恩諾沙星檢測限為1.59 ng·mL-1。宋亞寧等[35]用溶劑熱法合成具有時間分辨特性的熒光納米材料NaYF 4:Ce/Tb，并基于分子對接輔助設(shè)計培氟沙星（Pefloxacin，PEF）適配體的互補鏈，納米金與發(fā)光納米材料分別修飾在適配體、互補鏈上，通過堿基互補配對誘導(dǎo)2 種納米材料間發(fā)生時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移，構(gòu)建生物傳感PEF 的新型檢測方法，在最佳條件下，測得牛奶中獸藥殘留PEF 加標(biāo)回收率為73.81%～99.86%，檢測限為0.15 μg·kg-1。LIU等[36]采用UCNPs 作為信號源和Apt 作為特定識別元件構(gòu)建了檢測恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR）的熒光生物傳感器，通過形成具有背景熒光信號的雙鏈結(jié)構(gòu)雜交探針（UCNPs-cDNA/Apt-Fe3O4），ENR 能夠優(yōu)先與Apt-Fe3O4特異性結(jié)合，破壞部分雙鏈結(jié)構(gòu)，釋放出UCNPs-cDNA，降低熒光強度，再進行磁分離，檢測雜交探針上未釋放的UCNPs 的熒光強度，最后測得ENR 回收率為85.1%～98.5%，檢出限為0.06 ng·mL-1，實現(xiàn)了高靈敏度檢測。

雖然標(biāo)記型檢測方法的檢測靈敏度更高，但是需要對探針進行化學(xué)合成標(biāo)記，過程煩瑣、耗時，非標(biāo)記型檢測模式則相對簡便，無須使用化學(xué)試劑進行復(fù)雜的標(biāo)記及最后的分離純化[37]。劉若冰等[38]利用AccuBlue 熒光染料和Apt 的特點，建立一種基于Apt 快速檢測動物源性食品中獸藥殘留恩諾沙星的非標(biāo)記型熒光分析方法，結(jié)果表明，3 種動物源性食品（奶粉、蝦肉、牛肉）加標(biāo)回收率在76.54%～98.79%，方法的特異性、穩(wěn)定性和重復(fù)性均良好。YAN 等[39]利用非標(biāo)記氧氟沙星（Ofloxacin，OFL）的Apt、AuNPs 和羅丹明B 構(gòu)建一種熒光生物傳感器，Apt 包裹住AuNPs，在高濃度鹽溶液中保持分散狀態(tài)，能有效降低羅丹明B 的熒光強度；當(dāng)OFL 與Apt 結(jié)合，脫離Apt 的AuNPs 形成聚集狀態(tài)，聚合的AuNPs 無法猝滅羅丹明B 的熒光強度，使得熒光強度增強。該研究發(fā)現(xiàn)牛奶樣品線性范圍為7.2 ～108.3 ng·L-1，檢出限為1.7 ng·L-1。許景月等[40]建立了一種熒光非標(biāo)記型核酸適配體傳感器，雞肝樣品中多巴胺測定回收率在91.4%～103.5%，相對偏差為0.9%～2.3%。劉寧寧等[41]利用非標(biāo)記型傳感器檢測四環(huán)素，通過四環(huán)素Apt 序列進行優(yōu)化，獲得具有G-四鏈體形成雙價Apt 序列，G-四鏈體結(jié)構(gòu)可以激發(fā)硫代黃素T（ThT）熒光；當(dāng)引入四環(huán)素后，四環(huán)素與Apt 序列結(jié)合，破壞G-四鏈體形成條件，ThT 熒光不能被有效激發(fā)，根據(jù)熒光變化作為輸出信號，測得在10 ～1×103nmol·L-1線性關(guān)系良好，R2在0.99 以上，檢測限為96 pmol·L-1，特異性強、耗時短、操作簡便，可在20 min 內(nèi)完成快速檢測。

綜合近幾年相關(guān)學(xué)者對熒光生物傳感器的研究，發(fā)現(xiàn)其具有靈敏度高、檢測時間短、選擇性好、干擾少等優(yōu)點，但在低濃度的靶物質(zhì)和實際樣品的檢測中仍存在重現(xiàn)性、精確度都較低的問題[42]，因此需要繼續(xù)改進方法，以便實現(xiàn)更穩(wěn)定、更靈敏的快速檢測。

2.3 化學(xué)發(fā)光分析法

化學(xué)發(fā)光（Chemiluminescence，CL），指發(fā)光物質(zhì)自身電子從激發(fā)態(tài)躍遷到基態(tài)所產(chǎn)生的發(fā)光，不需要使用外部光源或光學(xué)系統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)，與熒光分析法相比可以有效避免光漂白效應(yīng)，其檢測信號由光子數(shù)決定，具有靈敏度高、儀器簡單、校準范圍寬、操作簡便以及檢測時間短等優(yōu)點。如YAO 等[43]利用卡那霉素Apt、磁珠（Magnetic Bead，MBs）、AuNPs 構(gòu)建了一種基于化學(xué)發(fā)光傳感器檢測卡那霉素的方法，將通過酰胺化的卡那霉素Apt 固定在MBs 上，Apt 互補探針cDNA 與AuNPs 結(jié)合，形成雙鏈結(jié)構(gòu)雜交探針（AuNPs-cDNA/Apt-MBs），當(dāng)體系存在卡那霉素時，與Apt 結(jié)合，釋放cDNA，富集的AuNPs 催化H2O2分解，魯米諾被氧化后發(fā)出藍光，研究發(fā)現(xiàn)該傳感器檢測限為0.035 nmol·L-1。HAO 等[44]利用碘苯酚（P-Iodophenol，PIP）構(gòu)建了一個基于競爭的ABEI（乙基異魯米諾）-H2O2-PIP 化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)，用以檢測牛奶樣品中氯霉素殘留。該系統(tǒng)先將生物素化的氯霉素適配體的磁性納米粒子作為捕獲探針，連有乙基異魯米諾的金納米結(jié)構(gòu)作為信號探針，氯霉素與探針競爭性地與適配體結(jié)合，探針結(jié)合適配體后催化H2O2分解，氧化PIP 發(fā)光，該方法檢測限為0.01 ng·mL-1，線性范圍為0.01 ～0.20 μg·L-1。但由于化學(xué)發(fā)光分析法的信號探針制備相當(dāng)費時耗力，發(fā)展受到限制，在動物性獸藥殘留的研究報道相對較少。

2.4 電化學(xué)傳感器檢測法

電化學(xué)適配體生物傳感器是將核酸適配體固定在電極上，根據(jù)適配體與靶分子結(jié)合后引起電化學(xué)信號改變來實現(xiàn)靶分子測定的一種新型生物傳感檢測裝置，具有成本低、特異性高、選擇性強以及響應(yīng)速度快等優(yōu)點，在食品檢測中越來越受到關(guān)注。

FENG 等[45]建立了一種可同時檢測孔雀石綠和氯霉素的“雙電勢”新型電化學(xué)發(fā)光適配體傳感器，通過對陽極修飾，連接魯米諾-納米金粒子，增強發(fā)光信號，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，魚類樣品中孔雀石綠和氯霉素檢測限分別為0.03 nmol·L-1和0.07 nmol·L-1。CHEN 等[46]采用電化學(xué)適配體傳感器檢測氯霉素時發(fā)現(xiàn)，通過利用納米金屬有機骨架（Nano Metal Organic Skeleton，NMOF）包封金屬離子并固定cDNA 作為信號標(biāo)簽，得出該方法檢測限低至0.19 pmol·L-1，同時線性范圍為0.002 ～100.000 nmol·L-1。馮榮榮等[47]構(gòu)建了兩種電化學(xué)適配體生物傳感器，一種將納米金/石墨烯修飾到電極表面，靈敏度高，檢測牛奶中卡那霉素時，線性范圍為1.0 ～10 000.0 pmol·L-1，檢出限為0.3 pmol·L-1；另一種基于核酸外切酶Ⅲ輔助循環(huán)放大技術(shù)設(shè)計了一種檢測鏈霉素的核酸適配體電化學(xué)傳感器，線性范圍為0.1 ～1 000.0 pmol·L-1，檢出限為0.03 pmol·L-1。ZHANG 等[48]研究電化學(xué)傳感器測定牛奶樣品中四環(huán)素時，根據(jù)適配體與目標(biāo)分子結(jié)合前后構(gòu)象變化引起的電信號變化，測得四環(huán)素線性范圍在0.1 ～100.0 ng·mL-1，檢出限為1 ng·mL-1。王賽等[49]在研究四環(huán)素測定時，利用核酸適配體作為識別元件，以四環(huán)素為靶分子，在新型集成式絲網(wǎng)印刷表面構(gòu)建電化學(xué)傳感器，通過DNA 自組裝構(gòu)建了四面體納米結(jié)構(gòu)，輔助適配體的定向固定，研究得出四環(huán)素線性范圍為0.01 ～1 000.00 ng·mL-1，檢測限為0.009 47 ng·mL-1，可實現(xiàn)微量、高靈敏度快速檢測。趙亞男等[50]建立了電化學(xué)核酸適配體傳感器用于檢測四環(huán)素殘留，以絲網(wǎng)印刷電極為基底電極，以具有電化學(xué)活性或催化活性的功能金屬有機框架材料為信號介質(zhì)和Apt 固定載體，構(gòu)建了新型的免標(biāo)記電化學(xué)傳感器，實現(xiàn)了對草魚、鮮蝦、牛奶中四環(huán)素的測定。

2.5 表面增強拉曼散射檢測法

表面增強拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering，SERS）是一種基于目標(biāo)分析物分子吸附在經(jīng)過特殊處理、具有納米結(jié)構(gòu)的金屬材料（如金、銀等）或非金屬材料（半導(dǎo)體、石墨烯、量子點等）表面，產(chǎn)生極強的拉曼增強效應(yīng)的分子振動光譜技術(shù)[2,51]。部分基底材料可以使拉曼散射強度增強1010～1015倍[52]。因此SERS 具有檢測速度快、靈敏度高，能同時進行多重檢測等獨特的優(yōu)勢，近年來在食品安全分析領(lǐng)域受到關(guān)注。

核酸適配體SERS 技術(shù)是以Apt 修飾納米顆粒，作為SERS 檢測的探針，增強檢測體系的特異性。YAN 等[53]在檢測氯霉素的研究中以納米金粒子為SERS 增強基底，制備了熒光染料Cy5-適配體-納米金粒子識別探針，Cy5-適配體結(jié)合氯霉素形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，與納米金粒子分離，使得SERS 信號強度顯著降低，實現(xiàn)了乳樣品中氯霉素（Chloramphenicol，CAP）殘留的高靈敏度檢測，檢測限為0.19 ng·L-1，回收率為96.6%～110.2%。WU 等[54]將四聚體金納米粒子和土霉素-DNA 適配體及其3 個不同類型部分互補的寡核苷酸序列整合到SERS 基底上開發(fā)了一種適配體傳感器，構(gòu)建了對土霉素具有高親和力的環(huán)境，以探測牛奶中的土霉素殘留，結(jié)果發(fā)現(xiàn)檢出限為0.003 ng·mL-1。JIANG 等[55]以Au@Ag NPs 為SERS活性基底，以硫醇為拉曼報告分子，采用銀殼包裹的AuNPs-適配體作為識別探針，對未經(jīng)處理的全脂牛奶中卡那霉素檢出限可達0.90 pg·mL-1。JIANG 等[56]采用4-巰基苯甲酸作為拉曼報告分子，制備的Au@Ag NPs 新型適配體傳感器用于牛奶中卡那霉素的檢測，檢出限為142 pg·mL-1。表明該活性基底在實際牛奶樣品檢測中具有很好的靈敏性和選擇性。而FANG 等[57]采用Au NPs@Si 作為活性基底，構(gòu)建SERS-適配體傳感器對牛奶中的氯霉素殘留進行檢測，濃度降至1.5 pmol·L-1，靈敏度相對較低。費雪蓮等[58]建立了同時檢測牛奶中環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺SERS-適配體傳感器，適配體與環(huán)丙氨嗪和三聚氰胺結(jié)合后，控制納米銀在適配體表面還原，形成Cyr/Mel-DNA-Ag NPs復(fù)合物，以增強拉曼效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適檢測條件下，環(huán)丙氨嗪線性檢測范圍在0.10 ～0.65 mg·L-1，檢測下限為13.6 μg·L-1；三聚氰胺線性檢測范圍在0 ～0.5 mg·L-1，檢出限為43.5 ug·L-1，可為快速檢測牛奶中獸藥殘留提供參考?？傊?，SERS 結(jié)合適配體檢測動物性食品中的獸藥殘留應(yīng)用廣泛，檢測效果好，將在獸藥殘留檢測中有更好的發(fā)展前景。

3 結(jié)語

近年來，食品安全問題頻發(fā)，影響了社會大眾的身心健康和國民經(jīng)濟的良性發(fā)展，其中動物性食品中獸藥殘留給食品安全造成極大的威脅?；诤怂徇m配體檢測動物性食品中獸藥殘留發(fā)展迅速，檢測結(jié)果準確，且靈敏度高。但在高質(zhì)量的適配體篩選、優(yōu)質(zhì)納米材料的開發(fā)合成、檢測體系的穩(wěn)定性、信號增強放大方法的探究以及多目標(biāo)檢測系統(tǒng)的設(shè)計等方面還需重點研究。核酸適配體作為抗體替代識別探針，涉及多學(xué)科理論方法和技術(shù)手段，隨著科學(xué)技術(shù)的進步以及檢測體系的不斷完善，相信該技術(shù)在動物食品獸藥殘留檢測中的應(yīng)用將會更加深入，發(fā)展前景良好。