PMP柱前衍生HPLC法測(cè)定八月瓜果皮多糖中單糖組成

劉永玲，趙建國(guó)，趙治兵，劉向煉，劉元鳳，李觀龍，謝國(guó)芳

（1.貴陽學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550005；3.華潤(rùn)雪花啤酒（黔南）有限公司，貴州 黔南 551200；4.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025）

八月瓜[Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz]屬木通科藤本植物，為藥食兩用資源，成熟的八月瓜沿腹線自然開裂，又稱“野香蕉”、“八月炸”等。八月瓜果實(shí)營(yíng)養(yǎng)豐富，其果實(shí)、種子、莖和根在中藥中的應(yīng)用已有至少2 000 年的歷史[1]，有舒肝理氣、活血止痛、除煩利尿和抗菌消炎等功效[2-3]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和醫(yī)學(xué)發(fā)展價(jià)值。隨著八月瓜大量種植的推廣，加之其深加工方式的局限性，其果皮成為一種副產(chǎn)物大量被丟棄而污染環(huán)境，因此從八月瓜果皮中探索其他活性物質(zhì)具有重要的意義和價(jià)值。八月瓜果皮的研究多集中于果膠和皂苷類化合物[4-5]，越來越多的學(xué)者期望從果皮中探索其他活性成分，Luo 等[6]發(fā)現(xiàn)八月瓜果皮提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性，可為天然抗氧化劑的開發(fā)提供基礎(chǔ)，Zhang 等[7]通過酸提法得到的三葉木通果皮提取物可用作一種新型環(huán)保、高效的緩蝕劑。針對(duì)八月瓜中多糖的研究?jī)H限于總糖的測(cè)定，如李秀彤等[8]測(cè)得八月瓜鮮果中總糖含量為15.78%，相較于常見的16 種水果處于較高水平；張孟琴等[9]研究發(fā)現(xiàn)三葉木通果皮中總糖含量高達(dá)32.61%。目前，深入分析八月瓜果皮多糖中單糖組成的研究鮮見報(bào)道。

多糖作為天然藥物資源中一種重要的活性物質(zhì)，在抗氧化、抗病毒、抗凝血、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[10-11]，研究其單糖組成、糖苷鍵類型及連接順序等結(jié)構(gòu)特征成為多糖開發(fā)利用的關(guān)鍵[12]。目前，常見的單糖檢測(cè)方法有薄層色譜法、離子色譜法、氣相色譜法和液相色譜法，但都存在一定的局限性，如薄層色譜法靈敏度低、分離度和重現(xiàn)性差，僅用于簡(jiǎn)單多糖的定性分析[13]；離子色譜法雖然靈敏度和分離度相對(duì)較高，但其使用的氫氧化鈉易使糖類分解和異構(gòu)化[14]；氣相色譜法復(fù)雜的衍生化操作易產(chǎn)生副衍生物，造成多峰、重疊峰等現(xiàn)象[15]；液相色譜法可用示差檢測(cè)器和蒸發(fā)光檢測(cè)器，但其價(jià)格昂貴，其中示差檢測(cè)器平衡時(shí)間較長(zhǎng)，基線波動(dòng)大[16]，不宜使用梯度洗脫條件[17]，蒸發(fā)光散射器對(duì)糖含量少的樣品靈敏度低，對(duì)糖的分離和定量分析產(chǎn)生影響[18]。而衍生高效液相色譜法是通過柱前或柱后衍生，以提高無紫外或弱紫外吸收單糖的分離選擇性和檢測(cè)靈敏度，其中柱后衍生成本高、不常用，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）柱前衍生結(jié)合高效液相色譜法反應(yīng)條件溫和，不會(huì)導(dǎo)致立體異構(gòu)，具有較高的檢測(cè)靈敏度，比其他方法更具實(shí)用性[19-20]。

本研究采用柱前衍生高效液相色譜法建立八月瓜果皮多糖中6 種單糖含量的測(cè)定方法，通過主成分分析對(duì)貴州不同主產(chǎn)地八月瓜果皮多糖中的單糖進(jìn)行差異分析，旨為八月瓜果皮的開發(fā)利用及果皮多糖的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10 批八月瓜樣品分別采自貴州省不同產(chǎn)地，經(jīng)貴陽學(xué)院楊碧仙教授鑒定為八月瓜[Akebia trifoliate（Thunb.）Koidz]的果實(shí)，于4 ℃采樣箱運(yùn)回貴州省果品加工工程技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室。挑選果皮顏色均一、炸裂開口度占比為整個(gè)果實(shí)2/3 的八月瓜果實(shí)采收，每批選取成熟果實(shí)10 個(gè)。果皮和果肉分離，果皮于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。樣品信息見?。

表1 八月瓜樣品信息Table 1 Sample information of Akebia trifoliate

L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖對(duì)照品（純度均≥98%）、透析袋[MD77-（8000-14000）]：北京索萊寶科技有限公司；D-甘露糖（純度≥99%）：西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；D-阿拉伯糖（純度≥99%）：北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院有限公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）、三氯乙酸（分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；甲酸銨（色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯仿、無水乙醇、丙酮（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-20A 型）、SHIMADZU-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：日本島津公司；臺(tái)式低速離心機(jī)（TD4 型）：湖南赫西儀器裝備有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-52A 型）：上海亞榮生化儀器廠；超聲波清洗器（KQ-500 型）：昆山市超聲儀器有限公司；勻漿機(jī)（JJ-2B 型）：金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；打漿機(jī)（WBL-2501B 型）：廣東美的生活電器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取L-鼠李糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸對(duì)照品，分別置于5 mL 容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度線，混勻，配制D-甘露糖（1.624 mg/mL）、L-鼠李糖（2.000 mg/mL）、D-半乳糖醛酸（2.162 mg/mL）、D-葡萄糖（2.002 mg/mL）、D-半乳糖（1.886 mg/mL）、D-阿拉伯糖（1.890 mg/mL）的對(duì)照品儲(chǔ)備液，放置4 ℃冰箱備用。準(zhǔn)確吸取適量各對(duì)照品儲(chǔ)備液至容量瓶中，甲醇定容，配制系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。

1.3.2 八月瓜果皮多糖的制備

1.3.2.1 樣品處理

10 批貴州不同產(chǎn)地的八月瓜果皮用料理機(jī)打漿，勻漿機(jī)勻漿，分裝于保鮮盒中備用。

1.3.2.2 八月瓜果皮多糖的提取

稱取1.3.2.1 的八月瓜果皮漿適量，按料液比1 ∶20（g/mL）加入95%乙醇，于80 ℃下超聲提取30 min，過濾后棄去濾液除去部分單糖，濾渣重復(fù)超聲2 次。所得濾餅按料液比1 ∶20（g/mL）加入蒸餾水，90 ℃水浴1 h，趁熱過濾，收集濾液，殘?jiān)貜?fù)上述操作2 次，合并濾液。將濾液濃縮至原體積的1/3 后采用Sevage 法[21]脫去蛋白，收集上清液并轉(zhuǎn)移至透析袋中，將透析完的多糖溶液加入4 倍體積的無水乙醇使多糖沉淀，4 ℃靜置過夜12 h，抽濾，依次用無水乙醇、丙酮各淋洗3次，真空冷凍干燥后即得八月瓜果皮多糖。

1.3.2.3 八月瓜果皮多糖的水解

稱取八月瓜果皮多糖4.0 mg 于15 mL 具塞試管，加入2 mol/L 三氟乙酸溶液5 mL，氮?dú)夥饪诤笥?00 ℃水解6 h，取出后冷卻至室溫，70 ℃水浴蒸干，加入2 mL甲醇水浴蒸干，重復(fù)3 次以除盡多余的三氟乙酸，加3 mL 甲醇溶解，即得八月瓜果皮多糖水解液，備用。

1.3.2.4 對(duì)照品及樣品溶液的衍生化

分別取1.3.1 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.3.2.3 的八月瓜果皮多糖水解液0.5 mL 于刻度試管中，分別加入0.3 mol/L NaOH 溶液0.5 mL 混勻，加0.5 mol/L PMP-甲醇溶液0.5 mL，混勻后70 ℃水浴60 min，室溫冷卻后加入0.3 mol/L HCl 溶液0.5 mL 中和NaOH，加氯仿2 mL，充分萃取后棄去氯仿層，重復(fù)3 次以除去過量的PMP，上清液過0.45 μm 微孔膜備用。

1.3.3 高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測(cè)條件

色譜條件：SHIMADZU-C18 色譜柱；乙腈（A）-0.05 mol/L 甲酸銨溶液（B）梯度洗脫（0～10 min：18%A；10～20 min：18%～20% A；20～40 min：20% ～23% A；40～60 min：23% A），檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速1 mL/min。分別對(duì)衍生后的對(duì)照品及八月瓜樣品進(jìn)行HPLC 分析，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中6 種單糖的含量及比例。

1.3.4 單糖含量的計(jì)算

將6 種單糖的峰面積均值帶入相應(yīng)的線性方程，計(jì)算出相應(yīng)的濃度，按下列公式計(jì)算八月瓜果皮多糖中單糖。

式中：Wi為八月瓜果皮多糖樣品中各單糖的含量，mg/g；Ai為各單糖的峰面積；a 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b 為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；V 為樣品溶液的體積，mL；m 為八月瓜多糖樣品的質(zhì)量，mg。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0、Microsoft Excel 2019、GraphPad Prism 7.0 等軟件對(duì)數(shù)據(jù)和圖像進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍

將1.3.1 單糖對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：含D-甘露糖50.50 μg/mL、L-鼠李糖50.00 μg/mL、D-半乳糖醛酸480.00 μg/mL、D-葡萄糖240.00 μg/mL、D-半乳糖100.00 μg/mL、D-阿拉伯糖104.00 μg/mL，對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行等倍逐級(jí)稀釋，分別按1.3.2.4 方法進(jìn)行柱前衍生化HPLC 分析，選擇線性范圍合適的5 個(gè)混和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度；擬合峰面積（y）和進(jìn)樣濃度（x，μg/mL）作回歸曲線，結(jié)果如表2 所示。

表2 6 種單糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍Table 2 Standard curves and linear ranges of six monosaccharides

由表2 可知，6 種單糖的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9980，線性關(guān)系良好。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

精密稱取八月瓜果皮多糖4.5 mg，按照1.3.2 方法進(jìn)行水解和衍生化，衍生樣品于4 ℃保存，每隔2 h 進(jìn)行HPLC 分析，共6 針，結(jié)果顯示D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值依次為1.85%、2.21%、2.57%、1.62%、2.97%、2.88%，表明衍生化樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

精密量取1.3.2.3 的八月瓜果皮多糖水解液0.5 mL于10 mL 具塞試管中，平行6 份，按照1.3.2.4 方法進(jìn)行柱前衍生化HPLC 分析，記錄峰面積值，計(jì)算得到D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖峰面積的RSD 值依次為2.14%、2.87%、2.33%、2.67%、2.56%、2.81%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 精密度試驗(yàn)結(jié)果

精密量取1.3.1 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL 于10 mL具塞試管中，然后按照1.3.2.4 方法進(jìn)行柱前衍生化HPLC 分析，重復(fù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算6 次所得單糖峰面積的RSD 值，D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖面積的RSD 值依次為1.44%、0.97%、0.86%、1.52%、1.03%、1.37%，說明該方法精密度良好。

2.1.5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

取3 份已知濃度的水解供試品溶液0.5 mL，每份平行3 次，分別加入0.5、1.0、1.5 倍質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2.4 方法進(jìn)行柱前衍生化HPLC 分析，依據(jù)各單糖峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of spiked recovery

由表3 可知，八月瓜果皮多糖中6 種單糖的加標(biāo)回收率為92.58%～100.02%，結(jié)果表明，該方法適用于八月瓜果皮多糖中D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖含量的測(cè)定。

2.2 八月瓜果皮多糖樣品組分分析

2.2.1 八月瓜果皮多糖水解物的衍生化HPLC 分析

八月瓜果皮多糖經(jīng)衍生化處理，HPLC 檢測(cè)，確定了八月瓜果皮多糖中含有6 種單糖成分，樣品中各目標(biāo)化合物均能實(shí)現(xiàn)基線分離，分離度良好。6 種單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC 色譜圖見圖1，八月瓜果皮多糖溶液的HPLC 色譜圖見圖2。

圖1 6 種單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed six monosaccharide standards

圖2 八月瓜果皮多糖溶液的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of the polysaccharide solution of Akebia trifoliate peel

2.2.2 八月瓜果皮多糖的單糖組成及含量結(jié)果

10 批貴州不同產(chǎn)地的八月瓜果皮按照1.3.2 和1.3.3 方法制備、進(jìn)樣分析，10 批樣品多糖中單糖含量和物質(zhì)的量比結(jié)果見表4 和表5。

表4 10 批貴州不同產(chǎn)地八月瓜果皮多糖中6 種單糖含量Table 4 Content of 6 monosaccharides of Akebia trifoliate peel polysaccharides in 10 batches from different regions in Guizhou mg/g

表5 八月瓜果皮多糖中單糖物質(zhì)的量比（n=3）Table 5 Molar ratio of monosaccharides in Akebia trifoliate peel polysaccharides（n=3）

由表4 和表5 可知，10 批八月瓜果皮多糖中均含有D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-阿拉伯糖，其含量分別為2.21～11.23、1.67～12.42、51.84～212.84、22.44～73.23、4.85～30.30、6.14～60.01 mg/g，各單糖組分含量存在明顯差異，其中D-半乳糖醛酸含量最高，D-葡萄糖次之。6 種單糖組分平均物質(zhì)的量比為D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-半乳糖∶D-阿拉伯糖=1.18 ∶1.00 ∶23.25 ∶11.73 ∶3.51 ∶5.88。

續(xù)表5 八月瓜果皮多糖中單糖物質(zhì)的量比（n=3）Continue table 5 Molar ratio of monosaccharides in Akebia trifoliate peel polysaccharides（n=3）

2.2.3 主成分分析

將10 批樣品中的D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖的含量作為提取特征，導(dǎo)入SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表6 和表7 所示。

表6 特征值及累計(jì)方差貢獻(xiàn)率Table 6 Eigenvalue and cumulative variance contribution rate

表7 主成分載荷矩陣Table 7 Load matrix of principal components

由表6、表7 可知，從八月瓜果皮多糖的6 個(gè)單糖組分中提取出了2 個(gè)特征值大于1 的主成分，前兩個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為86.463%，成分1 主要反映D-半乳糖醛酸、D-甘露糖和D-阿拉伯糖含量為主要影響因子，成分2 主要反映D-葡萄糖含量為主要影響因子。

樣品主成分得分、綜合得分及其排序見表8。

表8 樣品主成分得分、綜合得分及其排序Table 8 Scores，comprehensive scores，and ranking of principal components

由表8 可知，相對(duì)于主成分1 產(chǎn)地為安順（Q2）的八月瓜多糖得分最高，相對(duì)于主成分2 產(chǎn)地為黔西谷里（Q9）的八月瓜多糖得分最高，綜合得分排序由高到低依次為Q2、Q7、Q6、Q3、Q8、Q1、Q5、Q10、Q9、Q4，且單糖綜合排序?yàn)檎档拇硇詷悠稱2、Q7、Q6、Q3 的產(chǎn)地位于貴州省東南方向，這可能是因?yàn)樘欠值姆e累與產(chǎn)地的日照、晝夜溫差等因素有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究建立柱前衍生HPLC 法同時(shí)測(cè)定了八月瓜果皮多糖中D-甘露糖、L-鼠李糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖的含量，并對(duì)貴州省10 批不同產(chǎn)地的八月瓜樣品檢測(cè)分析，確定單糖成分及其物質(zhì)的量比。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所建立的柱前衍生HPLC 方法可靠、適用性強(qiáng)，適用于八月瓜果皮多糖中6 種單糖的定性和定量分析。經(jīng)HPLC 檢測(cè)10 批樣品中均含有6 種待測(cè)單糖，各單糖含量及組成比例有明顯差異，6 種單糖組分平均物質(zhì)的量比為D-甘露糖∶L-鼠李糖∶D-半乳糖醛酸∶D-葡萄糖∶D-半乳糖∶D-阿拉伯糖=1.18 ∶1.00 ∶23.25 ∶11.73 ∶3.51 ∶5.88。10 批樣品經(jīng)主成分分析發(fā)現(xiàn)D-半乳糖醛酸和D-葡萄糖含量明顯高于其他4 種單糖，主成分得分經(jīng)排序發(fā)現(xiàn)安順（Q2）、長(zhǎng)順（Q7）、銅仁（Q6）和麻江（Q3）產(chǎn)地的單糖綜合排序?yàn)檎?，這些產(chǎn)地基本位于貴州省的東南方向，推測(cè)主成分的含量與產(chǎn)地的氣候環(huán)境有相關(guān)性。后期研究中，將對(duì)不同產(chǎn)地八月瓜果皮單糖組分在果實(shí)發(fā)育過程中的積累變化進(jìn)行進(jìn)一步研究，考察糖分的積累是否與產(chǎn)地不同而有不同的趨勢(shì)。