Sigma-1受體在神經(jīng)病理性疼痛大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

莫少娥　劉可鵬　傅文　謝酬勤　郁冬玲　陳實(shí)　藍(lán)雨雁

摘要：目的 探討sigma-1受體（sig-1R）對(duì)神經(jīng)病理性疼痛（NP）大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。方法 將鞘內(nèi)置管成功的SPF級(jí)雄性SD大鼠24只按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S組）、NP模型組（C組）、sig-1R抑制劑BD1047干預(yù)組（B組），每組8只。C組和B組采用坐骨神經(jīng)慢性擠壓性損傷法建立NP模型。術(shù)后第4、5、6天，S組和C組鞘內(nèi)注射生理鹽水20 μL，B組鞘內(nèi)注射BD1047（120 μmol/L）20 μL，1次/d。于術(shù)前1 d及術(shù)后第1、3、5、7天檢測(cè)術(shù)側(cè)足機(jī)械縮足反應(yīng)閾（MWT）。采用Westen blot和免疫熒光染色法檢測(cè)背根神經(jīng)元（DRG）sig-1R、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（BIP）、轉(zhuǎn)錄活化因子4（ATF4）、C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達(dá)情況；采用HE染色法觀(guān)察DRG形態(tài)大小及病理改變；采用透射電鏡觀(guān)察DRG內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變。結(jié)果 與S組比較，C組大鼠術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)術(shù)側(cè)足MWT明顯下降，DRG病理?yè)p傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞明顯加重，sig-1R、BIP、ATF4、CHOP表達(dá)均上調(diào)（P＜0.05）；與C組比較，B組大鼠術(shù)后第5、7天MWT升高，DRG病理?yè)p傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞減輕，sig-1R、BIP、ATF4、CHOP表達(dá)均下調(diào)（P＜0.05）。結(jié)論 sig-1R參與了大鼠神經(jīng)病理性疼痛的過(guò)程，其機(jī)制可能與抑制DRG內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)痛；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；免疫球蛋白重鏈；sigma-1受體；背根神經(jīng)元

中圖分類(lèi)號(hào)：R614，R745文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221491

The role of sigma-1 receptor in endoplasmic reticulum stress in neuropathic pain rats

MO Shaoe， LIU Kepeng， FU Wen， XIE Chouqin， YU Dongling， CHEN Shi， LAN Yuyan

Department of Anesthesiology， the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021， China

Corresponding Author E-mail： blueyuyan@163.com

Abstract： Objective To investigate the role of sigma-1 receptor （sig-1R） in endoplasmic reticulum stress in neuropathic pain （NP） rats. Methods Twenty-four SPF male SD rats with successful sheath tube were divided into the sham operation group （group S）， the neuropathic pain model group （group C） and the BD1047 intervention group （group B） according to random number table， with 8 rats in each group. Chronic crush injury of sciatic nerve was used to establish NP model. On the 4th， 5th and 6th day after operation， normal saline 20 μL was injected intrathecally in the group S and the group C， and BD1047 （120 μmol/L） 20 μL was injected intrathecally in the group B once a day. The mechanical foot withdrawal response threshold （MWT） of the surgical side foot was measured on the first day before operation and on the first， 3rd， 5th and 7th day after operation. Western blot assay and immunofluorescence staining were used to detect the expression levels of sig-1R， glucose-regulated protein （BIP）， activating transcription factor 4 （ATF4） and C/EBP-homologous protein （CHOP） in dorsal root neurons （DRG）. HE staining was used to observe the morphological size and pathological changes of DRG. Changes of endoplasmic reticulum in DRG were observed by scanning electron microscopy. Results Compared with the group S， intraoperative parapodum MWT was significantly decreased （P＜0.05）， and pathological injury and endoplasmic reticulum destruction of DRG were significantly aggravated. Expressions of sig-1R， BIP， ATF4 and CHOP were up-regulated in the group C after CCI （P＜0.05）. Compared with the group C， the MWT was increased on the 5th and 7th day after CCI in the group B （P＜0.05）， and the expressions of sig-1R， BIP， ATF4 and CHOP were down-regulated （P＜0.05）. The pathological injury of DRG was improved. Conclusion sig-1R are involved in the neuropathic pain in rats， and the mechanism may be related to the inhibition of endoplasmic reticulum stress in dorsal root neurons.

Key words： neuralgia; endoplasmic reticulum stress; immunoglobulin heavy chains; sigma-1 receptor; dorsal root neurons

神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一種慢性繼發(fā)性疼痛，在普通人群中的發(fā)病率約為7%［1］。由于NP的形成機(jī)制尚不明確，診斷和治療較為困難，患者的生活質(zhì)量受到嚴(yán)重影響。因此，深入研究NP的可能機(jī)制和治療位點(diǎn)具有重要意義。研究表明，背根神經(jīng)元（sorasal root ganglion，DRG）內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與NP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，發(fā)生NP時(shí)，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BIP）的激活促進(jìn)ERS相關(guān)蛋白的活化，引發(fā)ERS，使用藥物減輕ERS可顯著改善NP［2］。sigma-1受體（sig-1R）是位于線(xiàn)粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種分子伴侶蛋白，廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，參與多項(xiàng)神經(jīng)系統(tǒng)生理與病理功能的調(diào)節(jié)［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，抑制sig-1R的表達(dá)可減輕大鼠的神經(jīng)性疼痛［5］。但sig-1R是否可通過(guò)減輕ERS來(lái)改善NP目前尚不明確。本研究擬探討sig-1R在NP大鼠ERS中的作用，以期為NP的防治提供作用位點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 SPF級(jí)成年雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）20200003］。本實(shí)驗(yàn)已通過(guò)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：202104004）。所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，處于晝夜交替環(huán)境，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑與儀器 sig-1R抑制劑BD1047（中國(guó)愛(ài)必信生物科技有限公司）；兔抗大鼠sig-1R多克隆抗體（美國(guó)CST公司）、β-actin多克隆抗體（美國(guó)Abclonal公司）；小鼠抗大鼠BIP、轉(zhuǎn)錄活化因子4（activating transcription factor 4，ATF4）、C/EBP同源蛋白（CHOP）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司），山羊抗兔及山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；山羊抗兔549通道綠色熒光二抗和山羊抗鼠488通道紅色熒光二抗（美國(guó)Abbkine公司）；BCA試劑盒、RIPA裂解液、Triton X-100破膜液、DAPI、抗熒光猝滅封片劑（上海碧云天公司）；von Frey纖維絲（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所）；電泳儀/轉(zhuǎn)印儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；倒置相差熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；透射電鏡（日本HTACHI公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 鞘內(nèi)置管術(shù) 參考文獻(xiàn)［6］的方法行鞘內(nèi)置管術(shù)。大鼠于術(shù)前8 h禁食不禁飲，稱(chēng)質(zhì)量后麻醉，取俯臥位固定，將無(wú)菌PE-10導(dǎo)管用生理鹽水沖洗后備用，背部備皮、消毒；切開(kāi)約2 cm皮膚，分離肌肉，使L3-4脊椎間隙充分暴露，將PE-10導(dǎo)管突破椎間隙后斜行緩慢置入，置入過(guò)程中可見(jiàn)導(dǎo)管內(nèi)有腦脊液溢出且大鼠出現(xiàn)甩尾反應(yīng)，導(dǎo)管沿皮下引至頸部，外端牽出固定。置管后觀(guān)察2 d，如大鼠出現(xiàn)后肢神經(jīng)損傷則剔除，其余大鼠鞘內(nèi)注射2%利多卡因10 μL，若大鼠出現(xiàn)雙下肢軟癱并且于30 min內(nèi)恢復(fù)正常，表明鞘內(nèi)置管成功，可用于建模。

1.3.2 NP模型建立 參照文獻(xiàn)［7］建立大鼠坐骨神經(jīng)慢性擠壓性損傷（chronic construction injury，CCI）模型。24只大鼠均鞘內(nèi)置管成功且無(wú)神經(jīng)損傷，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（S組）、NP模型組（C組）、sig-1R抑制劑BD1047干預(yù)組（B組），每組8只。大鼠造模前8 h禁食不禁飲，稱(chēng)質(zhì)量后麻醉，備皮消毒，C組和B組在股骨結(jié)節(jié)下方0.5 cm處切皮，分離肌肉間隙，充分暴露并游離出坐骨神經(jīng)，用4-0絲線(xiàn)在坐骨神經(jīng)干上結(jié)扎4道，每道間隔1 mm，結(jié)扎強(qiáng)度以小腿肌肉輕微顫抖時(shí)停止。S組大鼠僅游離暴露坐骨神經(jīng)，不予結(jié)扎。CCI手術(shù)麻醉清醒后觀(guān)察到縮爪、舔足、術(shù)側(cè)足不敢著地等疼痛行為視為造模成功。造模成功的大鼠休養(yǎng)3 d后給藥。CCI術(shù)后第4、5、6天，B組鞘內(nèi)注射120 μmol/L BD1047 20 μL，S組和C組鞘內(nèi)注射20 μL生理鹽水，1次/d。

1.3.3 機(jī)械縮足反應(yīng)閾（mechanical withdraw threshold，MWT）檢測(cè) 分別于CCI手術(shù)前1 d，手術(shù)后第1、3、5、7天測(cè)定大鼠術(shù)側(cè)足MWT（第5天于給藥1 h后檢測(cè)術(shù)側(cè)足MWT）。在安靜舒適的環(huán)境中，將大鼠置于底部為金屬網(wǎng)格且透光的籠子中，適應(yīng)30 min后測(cè)試，用von Frey纖維絲垂直刺激大鼠術(shù)側(cè)足底皮膚，刺激力度以纖維絲彎曲90°為宜，持續(xù)刺激3～5 s，當(dāng)大鼠出現(xiàn)迅速縮足、舔足等反應(yīng)時(shí)記為陽(yáng)性，記錄該刺激力度。初始刺激力度為6 g，若出現(xiàn)刺激反應(yīng)，則選低一級(jí)的刺激力度；反之則選高一級(jí)的刺激力度，重復(fù)測(cè)試3次，每次間隔5 min，取平均值。最大刺激力度設(shè)為60 g，以防損傷大鼠后足。

1.3.4 Western blot法檢測(cè)DRG組織sig-1R、BIP、ATF4、CHOP蛋白表達(dá) CCI術(shù)后第7天MWT測(cè)試結(jié)束后，處死大鼠，于冰上取出術(shù)側(cè)DRG，置入RIPA裂解液中充分裂解。提取總蛋白上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白上樣量，加入上樣緩沖液，于100 ℃水浴變性5 min；SDS-PAGE分離蛋白，于150 mA恒流條件下濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉中封閉1 h；洗滌后加入一抗：sig-1R（1∶1 000）、BIP（1∶1 000）、ATF4（1∶500）、CHOP（1∶800）和內(nèi)參蛋白β-actin（1∶1 000）4 ℃孵育過(guò)夜；取出PVDF膜，經(jīng)TBST漂洗后放入山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG二抗室溫孵育1 h，洗滌后ECL顯影、曝光，采用Image J軟件分析灰度值。

1.3.5 免疫熒光法檢測(cè)DRG組織sig-1R、BIP、ATF4、CHOP的表達(dá)定位 取術(shù)側(cè)的DRG組織，于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋，制成厚度5 μm的石蠟切片。取各組石蠟切片，經(jīng)烤片、脫蠟、PBS洗滌、抗原修復(fù)后，3%過(guò)氧化氫室溫孵育10 min，加入0.3% Triton X-100破膜，洗滌后用血清封閉1 h，加入一抗：sig-1R、BIP（1∶200），ATF4（1∶100）、CHOP（1∶100）4 ℃孵育過(guò)夜，在相應(yīng)組織上滴加相應(yīng)的綠色或紅色熒光二抗（1∶200），室溫避光孵育1 h，PBS洗滌后將DAPI滴于組織上染核3～5 min，滴加抗熒光猝滅劑封片。于暗室中用熒光顯微鏡觀(guān)察，結(jié)果使用Image J軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3.6 HE染色 取各組DRG組織石蠟切皮，經(jīng)烤片、脫蠟、PBS洗滌后，置于蘇木素染液中作用5 min，洗凈后用1.0%鹽酸乙醇分色，而后放入伊紅染液中浸泡。洗滌、脫水后封片，顯微鏡下觀(guān)察DRG形態(tài)大小及病理改變。

1.3.7 透射電鏡觀(guān)察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變 迅速取出各組大鼠DRG組織，于2.5%戊二醛緩沖液中室溫固定4 h，PBS洗滌，于2%四氧化鋨中再固定2 h，洗滌、脫水，環(huán)氧樹(shù)脂室溫滲透過(guò)夜，于樹(shù)脂中加入催化劑包埋、聚合，切片，透射電鏡下觀(guān)察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MWT比較 各組大鼠CCI術(shù)前1 d MWT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與S組比較，C組、B組CCI術(shù)后各時(shí)點(diǎn)MWT降低（P＜0.05）；與C組比較，B組CCI術(shù)后第5、7天MWT升高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組sig-1R、BIP、ATF4、CHOP蛋白的表達(dá)水平 與S組比較，C組和B組DRG組織sig-1R、BIP、ATF4、CHOP表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）；與C組比較，B組DRG sig-1R、BIP、ATF4、CHOP表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖1、表2。

2.3 sig-1R、BIP、ATF4、CHOP蛋白免疫熒光染色比較 sig-1R、BIP、ATF4、CHOP蛋白均表達(dá)于DRG細(xì)胞質(zhì)；與S組比較，C組和B組DRG中sig-1R、BIP、ATF4、CHOP蛋白熒光表達(dá)均升高（P＜0.05），C組sig-1R富集于細(xì)胞膜附近；與C組比較，B組DRG中sig-1R的表達(dá)及在細(xì)胞膜的富集減少，BIP、ATF4、CHOP表達(dá)均降低（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖2。

2.4 DRG組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE染色顯示，S組大鼠DRG組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)大小正常，細(xì)胞核居中；C組DRG神經(jīng)元明顯腫脹，細(xì)胞核移位，可見(jiàn)胞質(zhì)溶解、核固縮；B組DRG神經(jīng)元腫脹程度較輕，大部分細(xì)胞核居中，見(jiàn)圖3。

2.5 透射電鏡表現(xiàn) S組DRG神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)致密、有大量核糖體附著，無(wú)明顯脫落，細(xì)胞線(xiàn)粒體脊明顯，無(wú)腫脹水解；C組DRG神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)松散、腫脹、解離，核糖體明顯脫落，線(xiàn)粒體脊明顯減少甚至消失，線(xiàn)粒體空泡化；B組DRG神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)較為致密，核糖體無(wú)明顯脫落，少數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線(xiàn)粒體輕微腫脹，見(jiàn)圖4。

3 討論

CCI是研究NP的一種常用建模方法，坐骨神經(jīng)結(jié)扎可引起神經(jīng)水腫及炎癥發(fā)生，模擬臨床上的自發(fā)性疼痛、痛覺(jué)過(guò)敏等癥狀［8］。本研究中大鼠CCI術(shù)后MWT顯著降低，并于術(shù)后第7天MWT達(dá)最低值，而S組MWT無(wú)明顯變化，提示大鼠NP模型制備成功。本課題組前期研究證實(shí)CCI術(shù)后第7天疼痛表現(xiàn)最為明顯［9］。本研究選擇CCI術(shù)后第7天取材完成相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

sig-1R是一種分子伴侶蛋白，在機(jī)體的組織和器官中廣泛分布，參與多種細(xì)胞功能和生物過(guò)程。DRG是疼痛轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，sig-1R在DRG中高度表達(dá)，與NP的發(fā)生密切相關(guān)［10-11］。BD1047是選擇性sig-1R拮抗劑，在非應(yīng)激條件下，sig-1R拮抗劑不會(huì)改變感覺(jué)閾值，也不產(chǎn)生傷害性反應(yīng)；在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下，sig-1R表達(dá)升高并沿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移到質(zhì)膜和核膜，與離子通道或受體相互作用。研究表明，抑制sig-1R的表達(dá)可以抵抗痛覺(jué)過(guò)敏，使痛覺(jué)閾值恢復(fù)到較高水平，從而改善神經(jīng)病理性疼痛［12-13］。本研究結(jié)果顯示，制備CCI模型后sig-1R表達(dá)水平較S組明顯升高，免疫熒光染色可見(jiàn)sig-1R富集于細(xì)胞膜附近，表明DRG處于應(yīng)激狀態(tài)；與C組比較，B組sig-1R表達(dá)水平下調(diào)，筆者推測(cè)可能是BD1047與sig-1R結(jié)合后發(fā)生了構(gòu)象改變，形成了較為緊密的結(jié)合體，從而阻斷下游信號(hào)傳導(dǎo)；在檢測(cè)sig-1R蛋白時(shí)，該結(jié)合體未能被sig-1R一抗結(jié)合，因此檢測(cè)到的sig-1R表達(dá)降低。B組大鼠MWT明顯回升，表明抑制sig-1R可以明顯改善NP大鼠的痛覺(jué)過(guò)敏。

ERS是細(xì)胞為應(yīng)對(duì)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的異常聚集而激活未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein response，UPR）信號(hào)的反應(yīng)過(guò)程。BIP是一種駐留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的伴侶蛋白，正常情況下，BIP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含量較低；當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)，在壓力作用下，BIP釋放并激活非折疊蛋白反應(yīng)，其中包括蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）-真核細(xì)胞起始因子2α（eIF2α）-ATF4-CHOP通路的激活［14］；ATF4會(huì)促進(jìn)CHOP的大量表達(dá)，而CHOP是ERS介導(dǎo)細(xì)胞死亡的關(guān)鍵蛋白，如果CHOP持續(xù)表達(dá)，蛋白質(zhì)合成的增加將導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激加劇和細(xì)胞凋亡［15］。這是一條經(jīng)典的ERS通路，可在一定程度上反映細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素，因此本研究選擇測(cè)定該通路的相關(guān)指標(biāo)。本課題組前期研究證明，大鼠NP的發(fā)生發(fā)展與ERS時(shí)UPR的激活緊密相關(guān)，NP時(shí)DRG中的BIP蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，并引發(fā)一系列的神經(jīng)炎性反應(yīng)，產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏，通過(guò)抑制ERS可以有效減輕大鼠的神經(jīng)病理性疼痛［9，16］。本研究結(jié)果顯示，ERS相關(guān)蛋白BIP、ATF4及CHOP在CCI術(shù)后表達(dá)量明顯升高，透射電鏡下可見(jiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯腫脹、核糖體脫落等表現(xiàn)，表明CCI術(shù)后DRG發(fā)生了ERS，進(jìn)一步可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，與行為學(xué)上出現(xiàn)痛覺(jué)過(guò)敏表現(xiàn)一致。與C組比較，B組BIP、ATF4及CHOP表達(dá)下調(diào)，透射電鏡下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞較輕微，表明鞘內(nèi)注射BD1047抑制sig-1R表達(dá)，DRG中ERS有所緩解，其疼痛行為也明顯改善，但并不能恢復(fù)到正常水平。HE染色結(jié)果顯示C組大鼠CCI術(shù)后第7天出現(xiàn)明顯的細(xì)胞水腫等損傷表現(xiàn)，而B(niǎo)組細(xì)胞損傷較輕，說(shuō)明抑制sig-1R對(duì)NP大鼠的DRG細(xì)胞有保護(hù)作用。

綜上所述，sig-1R與NP的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，疼痛早期抑制sig-1R表達(dá)可以減輕大鼠CCI術(shù)后的NP，其機(jī)制可能與減輕DRG的ERS有關(guān)，這為NP的治療藥物研發(fā)提供新的方向。由于NP的形成機(jī)制復(fù)雜，本研究?jī)H探討了sig-1R對(duì)NP大鼠ERS的作用，未對(duì)ERS可能引起的細(xì)胞凋亡進(jìn)行深入研究，以及兩者在體外細(xì)胞中的關(guān)系仍待進(jìn)一步研究。

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（2022-09-15收稿 2022-10-28修回）

（本文編輯 李志蕓）