二甲雙胍對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制探討

譚春蓮　李曉紅　夏國棟　張志紅　李曉明

摘要：目的 探討二甲雙胍對人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）U2932細(xì)胞的抑制作用及其相關(guān)機(jī)制。方法 采用不同濃度二甲雙胍作用于體外培養(yǎng)的U2932細(xì)胞，分為對照組（0 mmol/L）和二甲雙胍實驗組（分別為5、10、20、40 mmol/L），分別培養(yǎng)24、48、72 h。通過CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性改變；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布及凋亡情況；Western blot檢測AMP活化蛋白激酶（AMPK）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、自噬及凋亡等通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 經(jīng)二甲雙胍處理后的U2932細(xì)胞存活率較對照組明顯下降（P＜0.05）。5、10和20 mmol/L二甲雙胍組G0/G1期細(xì)胞比例均較對照組增加（P＜0.05）。20 mmol/L二甲雙胍組24 h、48 h、72 h的細(xì)胞凋亡比例較對照組增加（P＜0.05）。與對照組相比，5、10和20 mmol/L二甲雙胍組磷酸化AMP活化蛋白激酶α亞基（p-AMPKα）、P53、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、活化的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、微管相關(guān)蛋白l輕鏈3B亞基（LC3B）蛋白表達(dá)水平增加，細(xì)胞自噬蛋白Beclin1表達(dá)水平僅部分增加，Bcl-2、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。結(jié)論 二甲雙胍能夠激活A(yù)MPK、凋亡及自噬通路，抑制U2932細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡。

關(guān)鍵詞：二甲雙胍；淋巴瘤，大B細(xì)胞，彌漫性；AMP活化蛋白激酶類；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；自噬；信號通路

中圖分類號：R733.41文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20220684

Inhibitory effect and mechanism of metformin on diffuse large B-cell lymphoma cells

TAN ChunlianLI Xiaohong XIA Guodong ZHANG Zhihong LI Xiaoming

1 Health Management Center， 2 Department of General Medicine， 3 Department of Hematology， the Affiliated Hospital of Southwest Medical University， Luzhou 646000， China

Corresponding Author E-mail： zhihonglily@126.com

Abstract： Objective To investigate the inhibitory effect and related mechanism of metformin on human diffuse large B-cell lymphoma （DLBCL） U2932 cells. Methods U2932 cells cultured in vitro were treated with different concentrations of metformin， and cells were divided into the control group （0 mmol/L） and the metformin experimental groups （5， 10， 20 and 40 mmol/L）. Cells were cultured for 24 h， 48 h and 72 h， respectively. Changes of cell proliferation activity were detected by CCK-8 assay. Cell cycle distribution and apoptosis were detected by flow cytometry. Expression levels of AMPK， CyclinD1， autophagy and apoptosis pathway-related proteins were detected by Western blot assay. Results The proliferation activity of U2932 cells treated with metformin was significantly lower than that of the control group （P＜0.05）. Compared with the control group， the percentage of cells in G0/G1 phase treated with 5， 10， 20 mmol/L metformin and the apoptosis rate of U2932 cells treated with 20 mmol/L metformin for 24 h， 48 h and 72 h were significantly increased （P＜0.05）. Western blot assay showed that 5， 10， 20 mmol/L metformin could up-regulate the expression of p-AMPKα， P53， Bax， Cleaved Caspase-3， LC3B proteins， but Beclin1 only partially increased， and down-regulate the expression levels of Bcl-2， p-AKT， CyclinD1 proteins in U2932 cells （P＜0.05）. Conclusion Metformin can activate AMPK， apoptosis and autophagy pathways， inhibit the proliferation of U2932 cells， and promote their apoptosis.

Key words： metformin; lymphoma， large B-cell， diffuse; AMP-activated protein kinases; apoptosis; cell proliferation; autophagy; signaling pathway

淋巴瘤起源于淋巴結(jié)和淋巴組織。其發(fā)生大多與免疫應(yīng)答過程中淋巴細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生的某種免疫細(xì)胞惡變有關(guān)，是免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤。按組織病理學(xué)分類可分為霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）和非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）。NHL易早期發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后明顯差于HL。彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是一種遺傳復(fù)雜且異質(zhì)性很強(qiáng)的侵襲性NHL，也是我國人群最常見的淋巴瘤類型，約占所有淋巴瘤的33.27%，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢［1］。DLBCL具有多種臨床和病理特征，容易出現(xiàn)預(yù)后不良和頻繁復(fù)發(fā)，治療極具挑戰(zhàn)性［2］。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）及磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K/AKT/mTOR）信號通路在細(xì)胞自噬與凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。有研究認(rèn)為，二甲雙胍可通過激活A(yù)MPK及抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng) ［3］。但關(guān)于二甲雙胍對DLBCL的作用機(jī)制卻鮮有報道。本研究以人DLBCL細(xì)胞系U2932為實驗對象，初步探究二甲雙胍對DLBCL細(xì)胞生物學(xué)特性的影響，以期揭示二甲雙胍對DLBCL是否具有潛在治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞 人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系U2932細(xì)胞株購自南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 鹽酸二甲雙胍標(biāo)準(zhǔn)品（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、RPMI1640無血清培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）；青霉素-鏈霉素溶液、細(xì)胞周期檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、流式細(xì)胞儀（美國Becton Dickinson公司）；兔抗人β-肌動蛋白（β-actin）抗體、兔抗人磷酸化AMPKα亞基（p-AMPKα）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自美國Cell Signaling Technology公司；兔抗人細(xì)胞自噬蛋白Beclin1、微管相關(guān)蛋白l輕鏈3B亞基（LC3B）抗體購自英國Abcam公司；兔抗人磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、P53、活化的胱天蛋白酶3（Cleaved Caspase-3）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）抗體均購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；酶標(biāo)測定儀（美國Thermo公司）；蛋白凝膠電泳儀、垂直電泳槽、小型Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) U2932為懸浮細(xì)胞，采用含100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，放至37 ℃、5%CO2孵化箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。

1.3.2 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性 取生長狀態(tài)良好的U2932細(xì)胞，按（3～5）×105/mL的細(xì)胞密度接種至96孔板中培養(yǎng)，分別使用5、10、20、40 mmol/L二甲雙胍處理細(xì)胞，分別為5、10、20、40 mmol/L組，另設(shè)置對照組（二甲雙胍0 mmol/L）和空白組（不含二甲雙胍及細(xì)胞），每組5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)24、48、72 h后添加10 μL CCK-8試劑，避光孵育3.5 h后檢測450 nm波長處光密度（OD），并計算半數(shù)抑制濃度（IC50）和細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實驗組OD-空白組OD）/（對照組OD-空白組OD）×100%，實驗重復(fù)3次。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 在6孔板中接種對照組、5 mmol/L組、10 mmol/L組和20 mmol/L組細(xì)胞（1×106個/孔），培養(yǎng)48 h后轉(zhuǎn)至離心管，PBS洗滌后乙醇固定過夜，750 r/min離心5 min，PBS洗滌，加入PI染色30 min后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，實驗重復(fù)3次。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將對照組及IC50組（本實驗選用20 mmol/L）細(xì)胞接種至6孔板（1×106個/孔），培養(yǎng)24、48、72 h后，750 r/min離心5 min，PBS洗滌2次，加入Binding Buffer（200 μL）重懸，添加5 μL被FITC熒光素標(biāo)記的Annexin V及5 μL的碘化丙啶（PI）混勻，避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，實驗重復(fù)3次。

1.3.5 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平 將已培養(yǎng)至對數(shù)生長期的U2932細(xì)胞接種至對照組、5 mmol/L組、10 mmol/L組和20 mmol/L組培養(yǎng)瓶（2×106個/瓶），經(jīng)培養(yǎng)48 h后提取各組細(xì)胞總蛋白，12 000 r/min離心10 min，棄細(xì)胞碎片，BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取約15 μg蛋白，通過SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)至PVDF膜，常溫封閉1 h，加入兔抗p-AMPKα、p-AKT、CyclinD1、P53、Cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、LC3B、Beclin1抗體（1︰1 000），置于4 ℃搖床過夜。次日漂洗3次后加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG（1︰1 000）室溫孵育1 h，洗膜后加ECL試劑顯色，置于凝膠成像儀中觀察并拍照，以β-actin作為內(nèi)參，使用Image J軟件對條帶進(jìn)行定量分析。蛋白相對表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值，實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Graphpad Prism 8.0軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x ±s）表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對U2932細(xì)胞增殖活性的影響 與對照組相比，經(jīng)二甲雙胍處理后的U2932細(xì)胞存活率在72 h內(nèi)明顯下降（P＜0.05），見表1。24 h、48 h 和72 h的IC50分別為48.514、19.423、12.715 mmol/L。

2.2 二甲雙胍對U2932細(xì)胞周期的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍處理U2932細(xì)胞48 h后，G0/G1期細(xì)胞百分比增加，S期、G2/M期細(xì)胞百分比降低（P＜0.05），10 mmol/L組和20 mmol/L組G0/G1期細(xì)胞百分比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2、圖1。

2.3 二甲雙胍對U2932細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，20 mmol/L二甲雙胍處理后的U2932細(xì)胞凋亡比例在24 h（28.06%±4.85% vs. 8.95%±1.54%，t=4.251）、48 h（37.16%±1.79% vs. 11.73%±2.08%，t=5.404）及72 h（57.07%±0.91% vs. 16.44%±2.27%，t=3.299）升高（n=3，均P＜0.01），見圖2。

2.4 二甲雙胍對U2932細(xì)胞AMPK、AKT、CyclinD1以及P53通路蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍組p-AMPKα、P53蛋白表達(dá)水平增加，p-AKT、CyclinD1蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；10 mmol/L組和20 mmol/L組P53蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖3、表3。

2.5 二甲雙胍對U2932細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，5 mmol/L、10 mmol/L和20 mmol/L二甲雙胍組Cleaved Caspase-3、Bax及LC3B蛋白表達(dá)水平增加，Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）；10 mmol/L組和20 mmol/L組Beclin1蛋白表達(dá)水平較對照組增加（P＜0.05），5 mmol/L組未見顯著變化（P＞0.05），見圖4、表4。

3 討論

DLBCL是臨床中十分常見的淋巴瘤類型，其分子生物學(xué)特征及個體預(yù)后差異很大，約有1/3的患者無法治愈，存在復(fù)發(fā)、難治的普遍現(xiàn)象［2］。二甲雙胍是臨床廣泛使用的口服降糖藥物，近年來在抗腫瘤領(lǐng)域報道頗多，其機(jī)制較為復(fù)雜，包括調(diào)控多級代謝通路、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡等［4］。而目前其對DLBCL的作用機(jī)制尚未闡明，因此擬通過必要的研究探討，以尋求新的治療方式及干預(yù)藥物。

3.1 二甲雙胍在腫瘤防治中的研究 近年來研究表明，二甲雙胍不僅作為降糖藥物來使用，其在腫瘤防治方面的作用已逐漸被流行病學(xué)研究和薈萃分析證實，包括乳腺癌［5］、前列腺癌［6］及胰腺癌［7］等。在血液系統(tǒng)腫瘤中也有類似的結(jié)論，二甲雙胍可降低2型糖尿病患者罹患NHL的風(fēng)險［8］，還可改善新診斷的DLBCL和濾泡性淋巴瘤患者的臨床預(yù)后［9］。陳惠麗等［10］的體外研究也證實二甲雙胍可抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)自噬與凋亡。而AMPK、AKT/mTOR等信號通路可能是其作用機(jī)制之一［11］。本研究結(jié)果顯示二甲雙胍能抑制U2932細(xì)胞的生長和增殖，阻滯細(xì)胞周期，與Xiong等［12］得出的二甲雙胍抑制腫瘤細(xì)胞增殖結(jié)果相似。

3.2 二甲雙胍對DLBCL的作用機(jī)制探討 目前多數(shù)研究領(lǐng)域認(rèn)為AMPK作為一種腫瘤抑制激酶，同時也是二甲雙胍發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵靶分子。而PI3K/AKT/mTOR是AMPK重要的下游信號通路，在人類腫瘤細(xì)胞中往往是失控的，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的快速增殖。二甲雙胍可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路降低人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖［13］，在甲狀腺癌細(xì)胞株中也發(fā)現(xiàn)類似的作用［14］。此外，Zhang等［15］研究認(rèn)為AKT的過度磷酸化可誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生，而二甲雙胍可下調(diào)p-AKT的表達(dá)，降低AKT轉(zhuǎn)染細(xì)胞Cyclin D1的表達(dá)，從而減輕脂質(zhì)沉積，緩解動物肝臟的脂肪變性，對AKT誘導(dǎo)的肝細(xì)胞腫瘤有治療作用。而p53是一種抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。最新研究證實APR-246（恢復(fù)突變型p53活性的化合物）可誘導(dǎo)DLBCL細(xì)胞發(fā)生自噬，抑制其增長［16］。還有研究表明，二甲雙胍能增強(qiáng)Bcl-2抑制劑的促凋亡作用，并發(fā)揮協(xié)同抗淋巴瘤效應(yīng)［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度二甲雙胍干預(yù)U2932細(xì)胞48 h后p-AMPK蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng)，同時p-AKT表達(dá)逐漸減弱，表明二甲雙胍發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)可能與激活A(yù)MPK及抑制AKT信號通路有關(guān)。其次，二甲雙胍可下調(diào)Cyclin D1、上調(diào)P53蛋白的表達(dá)，參與細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的調(diào)控。此外，與對照組相比，5、10和20 mmol/L二甲雙胍組的Bax、Cleaved Caspase-3及LC3B蛋白表達(dá)水平逐漸增加、Bcl-2蛋白表達(dá)水平逐漸降低，推測可能與細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬有關(guān)。但5 mmol/L二甲雙胍組與對照組的Beclin1蛋白表達(dá)水平無顯著差異，可能與高濃度二甲雙胍更容易誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬或其他機(jī)制有關(guān)。

綜上所述，二甲雙胍在體外有顯著抑制U2932細(xì)胞增殖的作用，其抗腫瘤效應(yīng)可能與激活A(yù)MPK信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡有關(guān)。本研究為了解二甲雙胍對DLBCL的作用機(jī)制提供了參考，有助于尋找治療DLBCL的潛在有效藥物，但仍需體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。

參考文獻(xiàn)

［1］ COCCARO N，ANELLI L，ZAGARIA A，et al. Molecular complexity of diffuse large B-cell lymphoma：Can it be a roadmap for precision medicine？［J］. Cancers，2020，12（1）：185. doi：10.3390/cancers12010185.

［2］ LIU M K，SUN X J，GAO X D，et al. Methylation alterations and advance of treatment in lymphoma［J］. Front Biosci（Landmark Ed），2021，26（9）：602-613. doi：10.52586/4970.

［3］ MA T，TIAN X，ZHANG B，et al. Low-dose metformin targets the lysosomal AMPK pathway through PEN2［J］. Nature，2022，603（7899）：159-165. doi：10.1038/s41586-022-04431-8.

［4］ SAENGBOONMEE C，SANLUNG T，WONGKHAM S. Repurposing metformin for cancer treatment：A great challenge of a promising drug［J］. Anticancer Res，2021，41（12）：5913-5918. doi：10.21873/anticanres.15410.

［5］ YANG J，ZHOU Y，XIE S，et al. Metformin induces ferroptosis by inhibiting UFMylation of SLC7A11 in breast cancer［J］. J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：206. doi：10.1186/s13046-021-02012-7.

［6］ CADEDDU G，HERV?S-MOR?N A，MART?N-MART?N M，et al. Metformin and statins：A possible role in high-risk prostate cancer［J］. Rep Pract Oncol Radiother，2020，25（2）：163-167. doi：10.1016/j.rpor.2019.12.027.

［7］ EIBL G，ROZENGURT E. Metformin：Review of epidemiology and mechanisms of action in pancreatic cancer［J］. Cancer Metastasis Rev，2021，40（3）：865-878. doi：10.1007/s10555-021-09977-z.

［8］ TSENG C H. Metformin is associated with a lower risk of non-Hodgkin lymphoma in patients with type 2 diabetes［J］. Diabetes Metab，2019，45（5）：458-464. doi：10.1016/j.diabet.2019.05.002.

［9］ WANG Y，MAURER M J，LARSON M C，et al. Impact of metformin use on the outcomes of newly diagnosed diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma［J］. Br J Haematol，2019，186（6）：820-828. doi：10.1111/bjh.15997.

［10］ 陳惠麗，馬平，陳艷麗，等. 二甲雙胍對K562細(xì)胞增殖、凋亡及糖酵解的影響［J］. 中國實驗血液學(xué)雜志，2019，27（5）：1387-1394. CHEN H L，MA P，CHEN Y L，et al. Effect of metformin on proliferation capacity，apoptosis and glycolysis in K562 cells［J］. Journal of Experimental Hematology，2019，27（5）：1387-1394. doi：10.19746/j.cnki.issn.1009-2137.2019.05.006.

［11］ VISNJIC D，DEMBITZ V，LALIC H. The role of AMPK/mTOR modulators in the therapy of acute myeloid leukemia［J］. Curr Med Chem，2019，26（12）：2208-2229. doi：10.2174/0929867325666180117105522.

［12］ XIONG Z S，GONG S F，SI W，et al. Effect of metformin on cell proliferation，apoptosis，migration and invasion in A172 glioma cells and its mechanisms［J］. Mol Med Rep，2019，20（2）：887-894. doi：10.3892/mmr.2019.10369.

［13］ ZHAO Y，SUN H，F(xiàn)ENG M，et al. Metformin is associated with reduced cell proliferation in human endometrial cancer by inbibiting PI3K/AKT/mTOR signaling［J］. Gynecol Endocrinol，2018，34（5）：428-432. doi：10.1080/09513590.2017.1409714.

［14］ NOZHAT Z，MOHAMMADI-YEGANEH S，AZIZI F，et al. Effects of metformin on the PI3K/AKT/FOXO1 pathway in anaplastic thyroid cancer cell lines［J］. Daru，2018，26（2）：93-103. doi：10.1007/s40199-018-0208-2.

［15］ ZHANG C，HU J，SHENG L，et al. Metformin delays AKT/c-Met-driven hepatocarcinogenesis by regulating signaling pathways for de novo lipogenesis and ATP generation［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2019，365：51-60. doi：10.1016/j.taap.2019.01.004.

［16］ HONG Y，REN T，WANG X，et al. APR-246 triggers ferritinophagy and ferroptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells with distinct TP53 mutations ［J］. Leukemia，2022，36（9）：2269-2280. doi：10.1038/s41375-022-01634-w.

［17］ CHUKKAPALLI V，GORDON L I，VENUGOPAL P，et al. Metabolic changes associated with metformin potentiates Bcl-2 inhibitor，Venetoclax，and CDK9 inhibitor，BAY1143572 and reduces viability of lymphoma cells［J］. Oncotarget，2018，9（30）：21166-21181. doi：10.18632/oncotarget.24989.

（2022-06-20收稿 2022-11-15修回）

（本文編輯 李鵬）