IVF/ICSI助孕后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織焦亡相關(guān)因子表達(dá)水平的研究

車小群　王麗蓮　王笑　許麗華　馬天仲　荊霞　陳碧

摘要：目的 探討體外受精（IVF）/卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中焦亡相關(guān)因子的表達(dá)及作用。方法 選取行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者102例（研究組），同期因意外妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)的患者100例（對(duì)照組），收集蛻膜組織。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法及Western blot法檢測蛻膜組織中焦亡相關(guān)因子Nod樣受體蛋白3（NLRP3）、白細(xì)胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD） mRNA及蛋白表達(dá)，TUNEL法檢測蛻膜組織中細(xì)胞焦亡情況，Pearson法分析蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白水平的相關(guān)性。結(jié)果 與對(duì)照組相比，研究組蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白水平、蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率升高（P＜0.05）；研究組患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r分別為0.429、0.474、0.498、0.540，均P＜0.05）。結(jié)論 IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中焦亡相關(guān)因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD表達(dá)均升高，且與蛻膜組織細(xì)胞焦亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞：流產(chǎn)，治療性；受精，體外；精子注射，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；蛻膜組織；Nod樣受體蛋白3；白細(xì)胞介素-1β；胱天蛋白酶1；gasdermin D

中圖分類號(hào)：R711.6文獻(xiàn)標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20220918

Study on the expression of pyrolysis-related factors in the decidua tissue of patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy

CHE Xiaoqun， WANG Lilian， WANG Xiao， XU Lihua， MA Tianzhong， JING Xia， CHEN Bi

Reproductive Center， Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang 524001， China

Corresponding Author E-mail： chenbi9677@163.com

Abstract： Objective To investigate the expression and effect of pyrodeath related factors in decidual tissue of in vitro fertilization （IVF）/intracytoplasmic sperm injection （ICSI） assisted early postpregnancy abortion. Methods A total of 102 patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy were selected as the research group， and 100 patients who underwent artificial abortion due to unexpected pregnancy during the same period were selected as the control group. Samples of decidua tissue were collected. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） method and Western blot assay were used to detect expression levels of Nod-like receptor pyrin domain 3 （NLRP3）， interleukin-1β （IL-1β）， Cysteinyl aspartate specific proteinase 1 （Caspase1）， gasdermin D （GSDMD） mRNA and protein in decidua tissue. TUNEL method was used to detect the cell pyroptosis in decidua tissue. Pearson method was used to analyze the correlation between pyroptosis rate and the protein levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua. Results Compared with the control group， expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1， GSDMD mRNA and protein， the cell pyroptosis rate in decidua tissues were significantly increased in the research group （P＜0.05）. There was a positive correlation between cell pyroptosis rate in decidua tissue and expression levels of NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in the research group （r=0.429， 0.474， 0.498， 0.540， all P＜0.05）. Conclusion The expression levels of pyrolysis-related factors NLRP3， IL-1β， Caspase1 and GSDMD in decidua tissue are increased in patients with early abortion after IVF/ICSI assisted pregnancy， and which are related to the cell pyroptosis of decidua tissue.

Key words： abortion， therapeutic; fertilization in vitro; sperm injections， intracytoplasmic; decidua tissues; Nod-like receptor pyrin domain 3; interleukin-1β; cysteinyl aspartate specific proteinase 1; gasdermin D

不孕不育是與生活環(huán)境、心理壓力、身體健康狀況等多種因素有關(guān)的疾病，近年來其發(fā)病率不斷升高，且趨于年輕化，嚴(yán)重影響家庭和諧［1］。體外受精（in-vitro fertilization，IVF）/卵胞漿內(nèi)單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）是重要的生育輔助技術(shù)，在不孕癥治療中應(yīng)用廣泛［2］。研究顯示，IVF/ICSI助孕妊娠可將臨床妊娠率由15%～20%提高到40%～50%，但妊娠12周前患者自然流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)仍較高，單胎活產(chǎn)率僅35%左右［3］。研究IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)的相關(guān)影響因素具有重要價(jià)值。妊娠的正常維持有賴于胎盤組織細(xì)胞凋亡、增殖的動(dòng)態(tài)平衡，而在妊娠早期，承擔(dān)著分化發(fā)育成胎盤的絨毛組織以及為受精卵提供保護(hù)、營養(yǎng)的蛻膜組織在維持妊娠方面發(fā)揮重要作用［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)，Nod樣受體蛋白3（nod-like receptor pyrin domain3，NLRP3）炎癥小體介導(dǎo)的母胎相關(guān)炎癥在復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用［6］。細(xì)胞焦亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種依賴于炎癥反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式［7］，但鮮見其在IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)中作用的相關(guān)研究。本研究旨在探討IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中焦亡相關(guān)因子NLRP3、白細(xì)胞介素（IL）-1β、胱天蛋白酶1（Caspase1）、gasdermin D（GSDMD）的mRNA及蛋白表達(dá)水平，以期為相關(guān)研究提供參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年10月—2020年10月于廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院生殖中心首次行IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者102例（研究組），年齡（32.52±8.09）歲，體質(zhì)量指數(shù)（BMI）（23.64±4.05）kg/m2，孕（8.53±2.25）周。選取同期在本院婦科門診因意外妊娠行人工流產(chǎn)術(shù)的患者100例（對(duì)照組），均為單胎妊娠，年齡（30.84±8.72）歲，BMI（22.89±4.26）kg/m2，孕（8.93±2.40）周。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并單側(cè)卵巢畸形、子宮畸形、子宮內(nèi)膜異位癥、宮腔粘連、基礎(chǔ)內(nèi)分泌疾病、染色體異常及異位妊娠者。（2）未收集到蛻膜組織者。（3）有明顯誘因流產(chǎn)者。（4）年齡、孕周、孕產(chǎn)次、基礎(chǔ)疾病等臨床資料不完整者。2組年齡（t=1.420）、BMI（t=1.283）、孕周（t=1.222）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。收集所有患者新鮮蛻膜組織，生理鹽水沖洗干凈，分為2份，分別于-80 ℃冷凍保存及4%多聚甲醛固定后石蠟包埋保存。本研究獲得本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（PJ2019105），患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 SYBR One-Step實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（貨號(hào)：abs60038）購自愛必信（上海）生物科技有限公司；NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH羊抗兔一抗（貨號(hào)：ab263899、ab216995、ab207802、ab210070、ab9485）購自英國Abcam公司；TUNEL試劑盒（貨號(hào)：T2190）購自北京索萊寶科技有限公司；StepOne Plus熒光定量PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；GelDocEZ凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；SMZ745光學(xué)顯微鏡購自日本尼康公司。

1.3 qRT-PCR法檢測蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA表達(dá)水平 取部分冷凍的蛻膜組織，TRIzol法提取總RNA，使用SYBR One-Step qRT-PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，引物序列見表1。反應(yīng)體系（20 μL）：2×StarScript Ⅱ Green One Step qRT-PCR Buffer 10 μL，StarScript Ⅱ One Step Enzyme Mix 2.0 μL，ROX Reference Dy 0.4 μL，RNA模板 2.0 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH₂O 4.8 μL。反應(yīng)條件：反轉(zhuǎn)錄 50 ℃ 10 min，預(yù)變性94 ℃ 2 min；變性94 ℃ 15 s，退火（NLRP3 57 ℃、IL-1β 60 ℃、Caspase1 55 ℃、GSDMD 58 ℃） 15 s，延伸70 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot法檢測蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達(dá)水平 取部分冷凍的蛻膜組織，冰上研碎，加預(yù)冷的RIPA裂解液，12 000 r/min離心10 min，BCA試劑盒檢測上清液蛋白濃度。計(jì)算上樣體積，各樣品取40 μg蛋白，沸水浴變性，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，使用PVDF膜進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)膜操作，用5%脫脂奶粉常溫封閉1 h，加入NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD、GAPDH一抗（均1∶1 000）4 ℃過夜，次日PBS沖洗PVDF膜，加羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育1 h，避光下滴加ECL液發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍攝圖像，以GAPDH蛋白為內(nèi)參蛋白，Image J軟件分析條帶灰度。

1.5 TUNEL法檢測蛻膜組織中細(xì)胞焦亡情況 石蠟包埋的蛻膜組織切片（4 μm），使用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色操作（一抗為Caspase1抗體）。每位患者取一張切片于光鏡下觀察蛻膜組織染色結(jié)果，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為焦亡細(xì)胞，每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)不重疊視野，統(tǒng)計(jì)焦亡細(xì)胞百分比，即焦亡率。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0、GraphPad 7.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用x±s表示，2組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。相關(guān)分析用Pearson相關(guān)系數(shù)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，研究組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA相對(duì)表達(dá)水平均升高（P＜0.01），見表2。

2.2 2組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，研究組NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白相對(duì)表達(dá)水平均升高（P＜0.01），見圖1、表3。

2.3 2組患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率比較 研究組蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率（18.94%±4.08%）高于對(duì)照組（5.26%±1.33%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=31.907，P＜0.01），見圖2。

2.4 研究組患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達(dá)的相關(guān)性 研究組患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r分別為0.429、0.474、0.498、0.540，P＜0.05）。

3 討論

近年來，我國不孕不育患者的數(shù)量呈增長趨勢，且一些有孕育打算的中、高年齡群體受孕概率較低，故輔助妊娠措施越來越受到重視［8］。IVF/ICSI能大大提高受孕率，縮短待孕時(shí)間，但I(xiàn)VF/ICSI助孕妊娠12周內(nèi)容易發(fā)生早期流產(chǎn)［9］。因此，研究IVF/ICSI助孕妊娠后發(fā)生早期流產(chǎn)的機(jī)制具有重要意義。

蛻膜組織在妊娠過程中發(fā)揮重要作用，可逐漸發(fā)育為胎盤，成為母體-胎兒之間的紐帶，可負(fù)責(zé)氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)、代謝廢物等的交換，而蛻膜組織由子宮內(nèi)膜間質(zhì)增殖、再分化形成，在胚胎著床、妊娠的建立與維持、分娩發(fā)動(dòng)過程中均起重要作用。趙亞民等［10］認(rèn)為，miR-575可能通過促進(jìn)蛻膜細(xì)胞凋亡及炎癥反應(yīng)，參與自然流產(chǎn)反復(fù)發(fā)生過程。本研究結(jié)果顯示，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率較人工流產(chǎn)患者顯著升高，表明蛻膜組織中細(xì)胞過多焦亡可能是患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期發(fā)生流產(chǎn)的重要原因，探究更多關(guān)于蛻膜組織中細(xì)胞焦亡的機(jī)制具有重要意義。

焦亡嚴(yán)重依賴于炎癥反應(yīng)，發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞脹破、內(nèi)容物外泄，引發(fā)更多的炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡［11］。Landi等［12］研究顯示，妊娠早期失調(diào)的促炎過程可能在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化癥女性流產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。Bas等［13］研究表明，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與淋巴細(xì)胞計(jì)算的比值等全血炎癥標(biāo)志物可用于妊娠自然流產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。Suttorp等［14］研究發(fā)現(xiàn)，感染性炎癥、非感染性炎癥均可導(dǎo)致胎盤功能障礙及妊娠并發(fā)癥發(fā)生，增加懷孕小鼠流產(chǎn)的發(fā)生率。經(jīng)典的焦亡途徑依賴于Caspase1誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，當(dāng)外源性、內(nèi)源性刺激信號(hào)經(jīng)由炎癥小體NLRP3激活Caspase1后，打孔蛋白GSDMD介導(dǎo)細(xì)胞膜孔道的形成，使得細(xì)胞腫脹破裂，胞內(nèi)物質(zhì)流出，刺激IL-1β等炎性因子大量合成并釋放，加重炎癥反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生［15］。秦志平等［16］研究亦顯示，稽留流產(chǎn)患者滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中GSDMD、NLRP3、Caspase-1、IL-1β高于正常早孕女性。本研究結(jié)果顯示，與人工流產(chǎn)患者相比，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD mRNA及蛋白表達(dá)水平均升高，再次證實(shí)了IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中發(fā)生了大量的細(xì)胞焦亡。肖文霞等［17］研究發(fā)現(xiàn)，蛻膜組織細(xì)胞焦亡與稽留流產(chǎn)具有相關(guān)性。本研究結(jié)果顯示，研究組患者蛻膜組織中細(xì)胞焦亡率與NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)，表明IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中細(xì)胞死亡方式與細(xì)胞焦亡有關(guān)，蛻膜組織中細(xì)胞大量焦亡可能是導(dǎo)致患者IVF/ICSI助孕妊娠后早期發(fā)生流產(chǎn)的重要原因之一。

綜上所述，IVF/ICSI助孕妊娠后早期流產(chǎn)患者蛻膜組織中焦亡相關(guān)因子NLRP3、IL-1β、Caspase1、GSDMD的mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯上調(diào)，可能參與蛻膜組織細(xì)胞焦亡發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致患者流產(chǎn)。

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（2022-06-21收稿 2022-09-28修回）

（本文編輯 陸榮展）