硫磺菌鑒定及人工馴化栽培研究

程天帥 卯明娟 杜雨桐 李卓宸 趙玉俊 劉迪

摘 要：硫磺菌是一種珍貴的藥食兼用的大型真菌，ITS分類鑒定為奶油硫磺菌（Laetiporus? cremeiporus），對該菇進行培養(yǎng)條件優(yōu)化研究結果為，最佳培養(yǎng)條件為：葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化鈉0.5g·L-1；馴化栽培試驗出現(xiàn)原基，表明該菌馴化成功，本試驗為開發(fā)利用及生產(chǎn)栽培這一野生資源奠定理論基礎。

關鍵詞：硫磺菌；鑒定；培養(yǎng)基優(yōu)化；馴化栽培

硫磺菌（Laetiporus）又名硫磺多孔菌[1-2]，具有基內菌絲和氣生菌絲[3]，子實體在藥用方面有較大作用[4]，內含齒孔酸，可合成甾體藥物腎上腺皮質激素，在很多疾病上有很好治療作用[5]，多糖[6]以其它成分含量也較豐富[7]，具有抗氧化、抗菌、抗腫瘤作用[8]。本研究對野生硫磺菌鑒定，活性成分測定，培養(yǎng)基優(yōu)化，馴化栽培進行研究，旨在為藥用真菌資源的馴化和利用提供理論和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株：菌株于2021年6月21日采自吉林省延邊朝鮮族自治州延吉市園藝農(nóng)場四隊蘋果梨園（東經(jīng)129°27′33″，北緯42°54′56″，海拔218m），其余試驗材料（LH、Li、Dai）均來自延邊大學農(nóng)學院食藥用真菌研究所。

1.2 方法

1.2.1 ITS鑒定：菌絲體DNA提取利用試劑盒，鑒定利用ITS通用引物ITS1和ITS4對DNA樣本序列進行PCR擴增，產(chǎn)物進行測序。將獲得的ITS序列利用NCBI進行比對，采用MEGA? 11.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 營養(yǎng)成分測定：分別對4個菌株進行多糖、黃酮、三萜、多酚的測定，進行超聲提取后紫外分光光度計在相應波長下測定吸光值，并帶入標準曲線計算含量。

1.2.3 硫磺菌菌絲體培養(yǎng)基優(yōu)化

1.2.3.1 單因素試驗：基礎培養(yǎng)基：葡萄糖20g·L-1、蛋白胨2.0g·L-1、

硫酸鎂0.5g·L-1、瓊脂20g·L-1，水1L。碳源：添加等量葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖；氮源：添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硝酸銨、黃豆粉；無機鹽：添加硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鋅、硫酸錳、磷酸二氫鉀，以基礎培養(yǎng)基不加相應物質為對照；設置3個重復，置于25℃避光培養(yǎng)7～10d，用十字交叉法測定菌落直徑。

1.2.3.2 正交試驗：對碳源、氮源、無機鹽三個單因素進行正交設計選出最優(yōu)組合，以確定硫磺菌的最佳培養(yǎng)基配方。正交設計采用L9（33）試驗設計（見表1）。

1.2.4 硫磺菌培養(yǎng)料篩選

1.2.4.1 二級種培養(yǎng)基篩選：二級級種分別選用以麥麩20%、石膏1%、白糖1%為基礎，分別添加雜木屑78%、棉籽殼78%、蘋果梨木屑78%，以雜木屑41.5%、麥麩10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%為基礎分別添加棉籽殼41.5%、蘋果梨木屑41.5%。以麥麩10%、玉米粉5%、石膏1%、白糖1%為基礎配方，分別在兩個配方中添加蘋果梨木屑41.5%、棉籽殼41.5%，設置5個重復，25℃恒溫培養(yǎng)，記錄吃料速度、長勢、滿瓶時間。

1.2.4.2 三級種培養(yǎng)基篩選：三級種培養(yǎng)料以雜木屑、蘋果梨木屑、棉籽殼為主料，在麥麩10%、石膏1%、白糖1%的栽培袋中分別加入雜木屑83%和玉米粉5%，雜木屑86%和玉米粉2%，蘋果梨樹木屑83%和玉米粉5%，蘋果梨樹木屑86%和玉米粉2%，雜木屑43%、棉籽殼43%和玉米粉2%，雜木屑54%、棉籽殼29%和玉米粉5%，蘋果梨木屑54%、棉籽殼29%和玉米粉5%，設置5個重復，25℃培養(yǎng)，記錄生長速度、生長勢、菌滿袋天數(shù)。

2 結果與分析

2.1 形態(tài)學鑒定：硫磺菌（LHJ）子實體沒有著生菌柄，菌蓋直生于菌絲基部，呈扇形，菌蓋直徑12～14cm，菌蓋邊緣厚度0.2～0.4cm，橘黃色，表面有白色絨毛，邊緣呈波浪狀，菌肉呈乳黃色，有明顯溝壑（見圖1）。

2.2 ITS鑒定：菌株LHJ、LH、Li為硫磺菌屬（Laetiporus? Murrill）的奶油硫磺菌（Laetiporus? cremeiporus），菌株Dai為硫磺菌屬（Laetiporus? Murrill）的硫色硫磺菌（Laetiporus? sulphureus），與形態(tài)學鑒定結果相符（見圖2）。

2.3 活性成分分析：對4個菌株活性成分進行測定，如表2，菌株LHJ其多糖、多酚、黃酮、三萜含量均最高，且顯著高于其他菌株，綜合得出菌株LHJ最優(yōu)，后續(xù)選取該菌株進行試驗。

2.4 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1 碳源：如表3，以葡萄糖為碳源的硫磺菌菌絲體長勢最好。綜合碳源的適用順序為：葡萄糖>麥芽糖>果糖>蔗糖>乳糖。

2.4.2 氮源：菌絲體在不同氮源下均可生長，如表4，蛋白胨最佳，硝酸銨最弱，無氮源中基本停止生長。綜合對5種氮源的適用順序為：蛋白胨>黃豆粉>牛肉膏>酵母膏>硫酸銨。

2.4.3 無機鹽：菌絲體在不同無機鹽下均可生長，如表5，氯化鈉時長勢最好，硫酸錳時長勢最弱，綜合適用順序為：氯化鈉>硫酸鋅>硫酸鎂>磷酸二氫鉀>硫酸錳。

2.4.6 正交試驗：如表6，對硫磺菌菌絲體生長影響為碳源>氮源>無機鹽，配方8菌絲生長速度最大，故最佳配方組合為A3B2C2。

2.5 原種配方對菌絲體的影響：如表7，配方5菌絲生長最慢，配方2菌絲生長速度最快為0.517cm·d-1，滿瓶時間最短，為菌絲生長最適原種配方。

2.6 栽培種配方對菌絲體生長的影響：如表8，配方5菌絲生長速度最快且與其他配方差異顯著，為最佳栽培種培養(yǎng)料配方，配方4生長最慢，在配方5、6、7、8中都出現(xiàn)原基，說明馴化成功。

3 討論與結論

通過對該菌進行鑒定，結果表明該菇為硫磺菌，各菌株中LHJ多糖、黃酮、多酚、三萜含量均高于其他，為優(yōu)勢菌株。對該菌進行培養(yǎng)基優(yōu)化，最佳因素為葡萄糖、蛋白胨、氯化鈉，最佳組合為葡萄糖25g·L-1，酵母膏2.0g·L-1，氯化鈉0.5g·L-1。最佳二級種為配方2生長速度最快。最佳三級種為配方5，且有原基出現(xiàn)，證明馴化成功?？傊?，硫磺菌分布廣泛，不同來源菌株在遺傳特性上可能會存在區(qū)別[7]，本研究結果可為硫磺菌培養(yǎng)和栽培提供一定理論依據(jù)。

參考文獻

[1] 楊娟，林佩婷，賴瀅妮，等.硫磺菌子實體多糖的提取及其抗氧化活性[J].福建農(nóng)林大學學報，2021，50（06）：843-849.

[2] Saba? E，Son? Y，Jeon? BR，et? al.Acetyl? Eburicoic? Acid? from? Laetiporus? sulpHureus? var.miniatus? Suppresses? Inflammation? in? Murine? MacropHage? RAW? 264.7? Cells.[J].Mycobiology，2015，43（2）：250-263.

[3] 蘭玉菲，安秀榮，唐麗娜，等.泰山硫磺菌硫磺原變種的生物學特性研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2012，44（08）：46-48.

[4] 張云龍.一株野生食用菌鑒定及其生物學特性研究[D].河北工程大學，2020.

[5] 卯曉嵐.中國大型真菌[M].河南科技出版社，2001.405.

[6] Body? of? Laetiporus? versisporus[J].Chemical? and? pHarmaceutical? Bulletin，2000，48（10）：1418-1422.

[7] 王艷華，朱巍巍.硫磺菌研究進展[J].食用菌學報，2023，30（03）：110.