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    一株適用于苦蕎米發(fā)酵的紅曲霉菌株分離與篩選

    2023-11-07 04:42:36張艷艷孫曉康張曉元張林軍袁丹丹劉英梅張秀華
    食品與藥品 2023年5期
    關(guān)鍵詞:色價洛伐他汀氨基丁酸

    張艷艷,孫曉康,張曉元,張林軍,袁丹丹,劉英梅,陳 勉,張秀華,劉 飛

    (山東省藥學(xué)科學(xué)院,山東省生物藥物重點實驗室,山東省多糖類藥物工程實驗室,多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室,山東 濟南 250101)

    中國是苦蕎麥生產(chǎn)大國,面積和產(chǎn)量均居世界第二位,出口量居第一位??嗍w麥中富含多種營養(yǎng)成分,具有保健功能,是一種“藥食兩用”產(chǎn)品[1]。據(jù)《本草綱目》記載,苦蕎麥具有益氣、利目、健胃等功效。苦蕎麥富含蘆丁等黃酮類化合物[2],藥理學(xué)研究表明,苦蕎麥的初級加工品苦蕎米具有降糖降脂、抗氧化、預(yù)防心腦血管系統(tǒng)疾病等作用[3-5],是一種頗具開發(fā)潛力的功能性食品[6]。

    紅曲霉屬于真菌門,是紅曲科腐生絲狀真菌,種類豐富[7],廣泛用于傳統(tǒng)食品加工過程。紅曲色素是安全的天然色素[8],廣泛用于食品著色。研究表明,紅曲霉代謝產(chǎn)物有非常重要的生理活性[9],如洛伐他汀有降低膽固醇和降血脂的功效[10-12];γ-氨基丁酸有降血壓的作用[13-14]。然而紅曲霉的產(chǎn)物桔青霉素[18]是對人畜有害的一種真菌毒素[19],毒性主要作用于腎臟[20],還有誘發(fā)突變、致畸、導(dǎo)致腫瘤等潛在危險[21-23]。不同紅曲霉產(chǎn)桔青霉素的能力各不相同[24],因此高產(chǎn)洛伐他汀和γ-氨基丁酸、低產(chǎn)桔青霉素成為篩選紅曲霉菌株重要指標(biāo)。

    苦蕎米產(chǎn)品深層次、細(xì)化的開發(fā)研究較少,本研究結(jié)合苦蕎米的天然屬性和紅曲霉的代謝產(chǎn)物特性,以總黃酮、紅曲色素、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的產(chǎn)量為綜合考察指標(biāo),篩選合適的發(fā)酵菌株,旨在進一步深化苦蕎米開發(fā)。

    1 材料與儀器

    1.1 材料

    豆腐乳、紅曲米、苦蕎米(市售);洛伐他汀、γ-氨基丁酸對照品(分析純,阿拉?。惶J丁對照品(分析純,純度:98 %,北京百靈威科技);孟加拉紅固體培養(yǎng)基(青島海博);鄰苯二醛、巰基乙醇、磷酸(分析純,國藥集團)、乙腈、甲醇(色譜純,德國默克公司);AlCl3(分析純、天津科密歐);玻璃纖維濾紙、桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品,桔青霉素免疫親和柱(Pribolab、青島普瑞邦生物)。

    1.2 儀器

    LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A紫外檢測器、RF-20A熒光檢測器(日本島津);Agilent ZORBAX C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);Agilent ZORBAX SB-Aq色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);U-T6紫外可見分光光度計(屹譜儀器);Legend micro 21R低溫高速離心機(美國Thermo);BSA1245電子天平(德國賽多利斯);KQ-600E超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司);GM-0.33A隔膜真空泵(天津津騰);S201K pH計(瑞士梅特勒);FXB101-3電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海樹立)。

    2 方法

    2.1 紅曲霉菌株分離純化、鑒定

    取豆腐乳50 g、紅曲米50 g,分別置入200 ml無菌生理鹽水,漩渦震蕩,無菌條件下于孟加拉紅固體平板中劃線,28 ℃培養(yǎng)3 d,挑取少量菌絲接種于孟加拉紅固體平板中繼續(xù)恒溫培養(yǎng)7 d,繼續(xù)挑取少量菌絲轉(zhuǎn)接純化,直至得到純菌株,30 %甘油洗脫孢子置入-80 ℃冰箱保藏備用。樣品送濟南博尚生物技術(shù)有限公司進行ITS1基因序列測序,用于菌株鑒定。

    2.2 紅曲霉發(fā)酵苦蕎米樣品制備

    2.2.1 苦蕎米預(yù)處理 稱取苦蕎米500 g,加入1000 ml純凈水浸泡2 h,沖洗干凈后,瀝干水分,蒸煮1 h,加入0.5 %酵母粉,121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min,4 ℃冰箱保藏備用。

    2.2.2 孢子懸液制備 將-80 ℃冰箱保藏的菌株于孟加拉紅固體平板中進行活化,培養(yǎng)7 d,用無菌生理鹽水洗脫孢子,轉(zhuǎn)入帶有無菌玻璃珠的三角瓶中,150 r/min震蕩30 min,打散孢子,采用4層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲后,利用血球計數(shù)板在光學(xué)顯微鏡下計數(shù),調(diào)整孢子數(shù)量級約為106/ml,備用。

    2.2.3 紅曲霉發(fā)酵 將1 ml孢子懸液接種于200 g苦蕎米固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃靜止發(fā)酵11 d。每間隔2 d混勻一次。

    2.2.4 發(fā)酵樣品后處理 將發(fā)酵結(jié)束的固體發(fā)酵物置入烘箱,65 ℃烘干6~8 h至恒重,備用。

    2.3 紅曲色價的測定方法

    紅曲色價的測定參照GB1886.181-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑紅曲紅[25]的方法進行。稱取樣品5 g,沸水100 ml溶解,搖勻,靜止放涼后,混勻過濾。取此溶液置入1 cm比色皿,分光光度計505 nm測定其吸光度值(A)。色價計算:以試樣溶液濃度為1 %,1 cm比色皿,在505 nm波長處測的A計。

    2.4 總黃酮的測定方法(AlCl3法[26])

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mg/ml)制備:稱取蘆丁0.0255 g,采用70 %乙醇溶液溶解后,定容至25 ml,于4 ℃冰箱保藏備用。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:分別取0,0.050,0.075,0.100,0.125,0.150,0.200 ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液,加入1.5 % AlCl3溶液2 ml,最終用70 %乙醇定容至10 ml,混勻后,室溫靜置30 min,于273 nm波長處測定A。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo),A為縱坐標(biāo),繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品溶液的制備:稱取苦蕎麥和發(fā)酵后樣品各50 g,采用料理機粉碎,取粉碎后樣品1 g,加入70 %乙醇10 ml,溶解2 h,于273 nm波長處測定A。

    2.5 洛伐他汀的測定方法

    HPLC條件[27]:色譜柱 ZORBAX SB-Aq;流動相乙腈:0.01 %磷酸(V:V)=60:40;紫外檢測器;檢測波長:238 nm;流速1 ml/min;進樣量20 μl。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取洛伐他汀對照品16 mg,溶于4 ml乙腈,逐步稀釋至濃度為0.1,0.2,0.4,0.8,1.0 mg/ml,0.22 μm濾膜過濾,HPLC進樣分析,以洛伐他汀濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制洛伐他汀標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品溶液的制備:稱取樣品5.0 g,溶于25 ml乙腈,浸泡30 min,超聲20 min后,0.22 μm濾膜過濾,HPLC進樣分析。

    2.6 γ-氨基丁酸的測定方法

    HPLC條件[28]:色譜柱 ZORBAX C18;流動相:甲醇:1 %冰乙酸水(V:V)=60:40;紫外檢測器;檢測波長:332 nm;流速1 ml/min;進樣量20 μl。

    柱前衍生化:衍生試劑[29]:稱取鄰苯二醛3 mg,溶于1 ml甲醇,加10 μl巰基乙醇,用0.4 mol/L(pH 10.2)硼酸緩沖溶液定容至10 ml。取0.2 ml待測樣品與0.1 ml衍生試劑,混勻反應(yīng)1 min,0.22 μm濾膜過濾,HPLC進樣分析。

    標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:稱取0.2 gγ-氨基丁酸溶于70 %甲醇中,定容至10 ml,逐步稀釋至濃度為0.003,0.005,0.01,0.02,0.04 mg/ml,0.22 μm濾膜過濾,經(jīng)柱前衍生化后,HPLC進樣分析,以γ-氨基丁酸濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    樣品溶液的制備:稱取樣品5 g,溶于25 ml,70 %甲醇超聲20 min,5000 r/min 離心5 min,經(jīng)柱前衍生化后,0.22 μm濾膜過濾,HPLC進樣分析。

    2.7 桔青霉素檢測的測定方法

    參考國標(biāo)GB5009.222-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測定[30],紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定方法。HPLC條件:色譜柱 ZORBAX C18;流動相:乙腈:0.1 %磷酸(V:V)=90:10;熒光檢測器;激發(fā)波長:350 nm,發(fā)射波長500 nm;流速0.8 ml/min;進樣量20 μl。

    桔青霉素對照品溶液:取桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品(5 μg/ml)4 μl,溶于996 μl甲醇溶液,即得20 ng/ml桔青霉素對照品溶液,逐步稀釋得到濃度5,4,2,1,0.5 ng/ml桔青霉素對照品。

    樣品溶液的制備:分別稱取苦蕎米及發(fā)酵樣品各1.0 g,加入20 ml,70 %甲醇提取液,超聲提取20 min,8000 r/min離心5 min,吸取上清1 ml加入49 ml 10 mmol/L磷酸溶液(pH 7.5)稀釋,采用纖維濾紙過濾,取10 ml過桔青霉素免疫親和柱,采用甲醇:10 mmol/L磷酸溶液(pH 2.5)洗脫,0.22 μm濾膜過濾,液相色譜檢測。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 紅曲霉分離純化、鑒定

    紅曲霉在孟加拉紅固體培養(yǎng)基生長會產(chǎn)生紅色素,基于此分離純化得到25株疑似菌株,經(jīng)濟南博尚生物技術(shù)有限公司鑒定,22株為紅曲霉,優(yōu)選長勢較快的5株菌株,編號為MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23,此5株菌在孟加拉紅固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d(見圖1),其中MZ1、MZ7和MZ18紅曲霉菌絲體呈黃色,MZ20和MZ23的菌絲體猶如白色毛毯狀。成熟后均具有皺褶,呈紅色。針對5株菌的ITS1基因序列,采用軟件MEGA11.0進行序列比對,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖2),結(jié)果表明,各菌株均屬紅曲霉種。

    圖1 5株紅曲霉菌株形態(tài)

    圖2 基于ITS1基因序列建立的紅曲霉菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

    3.2 發(fā)酵后樣品色價分析

    經(jīng)MZ1、MZ7、MZ18、MZ20和MZ23紅曲霉菌株發(fā)酵苦蕎米的樣品,分別命名為MY1、MY7、MY18、MY20和MY23,其色價測定結(jié)果見圖3。結(jié)果表明,不同紅曲霉菌株發(fā)酵的苦蕎米樣品色價均有所不同,其中樣品MY20的顏色最深,色價最高,樣品濃度為1 %、1 cm比色皿,在505 nm波長處測得A為0.395±0.008。

    圖3 各樣品色價

    3.3 總黃酮測定結(jié)果

    以蘆丁為對照品測定總黃酮的含量,測定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.0332X+0.001,R2=0.9998,蘆丁在0~25 μg/ml濃度范圍內(nèi)與A呈良好的線性關(guān)系。以此方法測定苦蕎米及發(fā)酵后各樣品中總黃酮的含量,結(jié)果見圖4。苦蕎米的總黃酮含量為6.49±1.61 mg/g,發(fā)酵后樣品的總黃酮含量均有不同程度的提高,其中樣品MY20的總黃酮含量最高,可達29.03±4.39 mg/g,是發(fā)酵之前的4.47倍。

    3.4 洛伐他汀測定結(jié)果

    以洛伐他汀對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=27 910 846.6667X+16 856.9778,R2=0.9978,洛伐他汀在10~60 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。采用此方法測定苦蕎米及發(fā)酵后各樣品中洛伐他汀的含量,結(jié)果見圖5??嗍w米中洛伐他汀含量為零,不同紅曲霉菌株發(fā)酵后的洛伐他汀含量相差較大,其中樣品MY20的洛伐他汀含量最高,可達0.52±0.04 μg/g。

    圖5 樣品中洛伐他汀含量

    3.5 γ-氨基丁酸測定結(jié)果

    以γ-氨基丁酸對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=47 319 479.1394X-10 311.0746,R2=0.9997,γ-氨基丁酸在3~40 μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系??嗍w米及發(fā)酵各樣品中的γ-氨基丁酸含量見圖6??嗍w米中γ-氨基丁酸含量為41.06±6.58 μg/g,發(fā)酵后樣品γ-氨基丁酸含量均高于苦蕎米,MY7、MY20和MY23的γ-氨基丁酸含量分別為139.45±6.10,135.89±7.22,135.31±5.83 μg/g。

    圖6 樣品中γ-氨基丁酸含量

    3.6 桔青霉素測定結(jié)果

    歐盟規(guī)定在紅曲霉發(fā)酵大米的食品補充劑中桔青霉素的最大限量值為 2.0 mg/kg[31],日本規(guī)定在紅曲色素中桔青霉素的最大限量值 0.2 mg/kg[32],食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.181-2016對食品添加劑紅曲紅色素中的桔青霉素含量限定為40 μg/kg,輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T2847-2007對功能性紅曲米(粉)桔青霉素含量限定為50 μg/kg。

    以桔青霉素對照品測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=105 397X-7599.3,R2=0.9909,桔青霉素在0.5~5 ng/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系??嗍w米及發(fā)酵各樣品中的桔青霉素含量見圖7。發(fā)酵后樣品的桔青霉素均不高于國家標(biāo)準(zhǔn)和輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

    4 結(jié)論

    本研究中通過分離純化鑒定,優(yōu)選5株紅曲霉菌株,經(jīng)發(fā)酵苦蕎米,檢測發(fā)酵后樣品的色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸和桔青霉素的含量,結(jié)果顯示紅曲霉菌株MZ20發(fā)酵樣品MY20的色價、總黃酮和洛伐他汀的含量最高,樣品MY7的γ-氨基丁酸含量最高,所有樣品桔青霉素含量均不高于40 μg/kg。綜合上述實驗結(jié)果選擇紅曲霉菌株MZ20作為苦蕎米的發(fā)酵菌株。后續(xù)的實驗計劃優(yōu)化發(fā)酵條件提高色價、總黃酮、洛伐他汀、γ-氨基丁酸的含量,降低桔青霉素含量。

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