高效液相色譜法測(cè)定甜夢(mèng)膠囊中4種成分

李志嬌，鞏長芹，張曉博，陳 靜，方君卉，楊小薛

（1. 臨沂市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 臨沂 276001；2. 齊魯制藥有限公司，山東 濟(jì)南 250000；3. 東阿阿膠健康連鎖有限公司，山東 臨沂 276001；4. 棗莊市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 棗莊 277102）

甜夢(mèng)膠囊，是在奇效年良方《枸杞丸》基礎(chǔ)上加味組方而成，主要成分有刺五加、淫羊藿、黃芪、陳皮、黃精、黨參、枸杞子、黃花、山楂等，具益氣補(bǔ)腎，健脾和胃，養(yǎng)心安神之功效，可改善心脾兩虛患者失眠、多夢(mèng)癥狀，緩解焦慮、抑郁情緒；臨床上多用于頭暈耳鳴，視減聽衰，失眠健忘，食欲不振，腰膝酸軟，心慌氣短，卒中后遺癥等癥[1-2]。通過檢索文獻(xiàn)[2-4]，發(fā)現(xiàn)關(guān)于甜夢(mèng)膠囊的特征性成分含量測(cè)定的報(bào)道較少，不能很好地監(jiān)測(cè)藥品的質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-波長切換法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷、淫羊藿苷、朝藿定C以及橙皮苷4種特征性成分的含量，能更好地控制藥品的質(zhì)量。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（Agilent 1260 Q u a t 泵，D A D 檢測(cè)器，四元在線脫氣機(jī)）；Thermo Hypersil Gold AQ（賽默飛世爾科技中國公司）色譜柱；XS205型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度為十萬分之一）；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；Milli-Q超純水機(jī)（法國默克）。

1.2 藥品與試劑

毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201907，含量以96.8 %計(jì)）、淫羊藿苷對(duì)照品（批號(hào)：110737-202017，含量以98.1 %計(jì)）、朝藿定C對(duì)照品（批號(hào)：111780-201905，含量以94.3 %計(jì)）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-202019，含量以95.3 %計(jì)）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純（默克公司）；甲酸為色譜純（阿拉?。?；水為超純水；甜夢(mèng)膠囊[榮昌制藥（淄博）]，批號(hào)：210107，210402，220207，211202）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil Gold AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2 %甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，A 15 %→30 %；20～30 min，A 30 %→35 %；30～40 min，A 35 %→40 %）；流速為1.0 ml/min；檢測(cè)波長：260 nm（0～12 min，檢測(cè)毛蕊異黃酮苷）、283 nm（12～18 min，檢測(cè)橙皮苷）、270 nm（18～40 min，檢測(cè)淫羊藿苷、朝藿定C）；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品11.33 mg、淫羊藿苷對(duì)照品11.19 mg、朝藿定C對(duì)照品13.73 mg，橙皮苷對(duì)照品10.75 mg，分別置入50 ml棕色量瓶，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液，備用。分別精密吸取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照儲(chǔ)備液、淫羊藿苷對(duì)照儲(chǔ)備液、朝藿定C對(duì)照儲(chǔ)備液、橙皮苷對(duì)照儲(chǔ)備液6.0，15.0，1.0，5.0 ml，置入同一50 ml棕色量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取甜夢(mèng)膠囊內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取5 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲提取30 min（功率300 W，頻率40 kHz），放冷，用甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液制備 按甜夢(mèng)膠囊的處方工藝，分別制備缺少黃芪、陳皮、淫羊藿的陰性樣品，按供試品制備方法，制備成陰性溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果在供試品溶液色譜圖中，呈現(xiàn)與混合對(duì)照品保留時(shí)間一致的特征峰，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷的保留時(shí)間分別為10.08，13.64，23.44，24.26 min，陰性溶液未呈現(xiàn)與照品保留時(shí)間一致的特征峰，表明陰性樣品對(duì)所測(cè)組分沒有干擾，各被測(cè)成分理論塔板數(shù)均大于15 000，各成分間的分離度均大于3.0，見圖1。

圖1 甜夢(mèng)膠囊中4種成分HPLC圖

2.4 線性關(guān)系

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液1，2，5，8，10，12，15 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄液相色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X（μg），計(jì)算回歸方程。結(jié)果見表1。

表1 回歸方程及其范圍

2.5 精密度

取2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄4種成分的峰面積。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積平均值分別為101.5，1067，321.9，306.6，RSD分別為0.32 %，0.27 %，0.67 %，0.24 %，表明儀器精密度較好。

2.6 重復(fù)性

分別精密稱取同一批次（批號(hào)：220207）樣品6份，按2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷峰面積平均值分別為97.88，1054，316.8，303.4，RSD為0.51 %，0.46 %，0.78 %，0.60 %，表明方法重復(fù)性良好。

2.7 溶液穩(wěn)定性

取同一樣品（批號(hào)：220207）溶液，放置室溫中，分別在配制后0，4，6，8，10，12，24，36 h，進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量為5 μl，記錄峰面積。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷面積的平均值分別為99.36，1065，321.5，310.2，RSD分別為1.02 %，0.73 %，1.04 %，1.56 %，表明供試品溶液36 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.8 加樣回收

取已知含量的同一批次（批號(hào)：220207）樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，每份分別精密加入毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.0，5.0，5.0，6.0 ml，按2.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為5 μl，計(jì)算回收率。結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均回收率為98.86 %、橙皮苷平均回收率為98.29 %、朝藿定C平均回收率為98.87 %、淫羊藿苷平均回收率為99.12 %，RSD均在2.0 %以內(nèi)。

2.9 樣品測(cè)定

取4批甜夢(mèng)膠囊（批號(hào)：210107，210402，220207，211202），按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為5 μl，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算，結(jié)果見表2。

表2 甜夢(mèng)膠囊中4種成分含量測(cè)定結(jié)果/mg·g-1（n=2）

3 討論

3.1 波長的選擇

對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷、橙皮苷、朝藿定C、淫羊藿苷在190～400 nm進(jìn)行全波長掃描，毛蕊異黃酮葡萄糖苷在260 nm、橙皮苷在283 nm、朝藿定C、淫羊藿苷在270 nm處有最大吸收，因此選擇260 nm作為毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定波長、選擇283 nm作為橙皮苷的測(cè)定波長、選擇270 nm作為朝藿定C、淫羊藿苷測(cè)定波長。

3.2 流動(dòng)相的選擇

參考《中國藥典》2020年版一部中黃芪、淫羊藿及陳皮[5]和相關(guān)文獻(xiàn)[6-10]，以乙腈-0.1 %磷酸溶液、乙腈-0.1 %甲酸溶液、乙腈-0.2 %甲酸溶液、乙腈-水梯度洗脫，乙腈-水等度洗脫。通過試驗(yàn)，結(jié)果以乙腈-0.2 %甲酸溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，峰形好，4種成分分離度高，陰性樣品干擾小。

3.3 提取溶劑方法的選擇

參考文獻(xiàn)[2-10]，試驗(yàn)中考察了甲醇、50 %甲醇、70 %甲醇、稀乙醇作為提取溶劑，以及加入不同體積（20，25，50 ml）的提取溶劑。結(jié)果用25 ml甲醇作為提取溶劑，提取率最高；考察了超聲20，30，45，60 min，及回流45，60 min的提取效果，結(jié)果表明，加入25 ml甲醇超聲處理30，60 min與回流60 min，測(cè)得的結(jié)果相差很小，因此選擇操作簡單的超聲方法作為該試驗(yàn)的提取方法，省時(shí)、簡便。