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    決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的保護(hù)作用研究

    2023-11-07 04:42:42閆志芳任可樂孟祥龍李秀英
    食品與藥品 2023年5期
    關(guān)鍵詞:決明子水提物酒精性

    閆志芳,任可樂,孟祥龍,李秀英

    (山西中醫(yī)藥大學(xué) 中藥與食品工程學(xué)院,中藥炮制山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山西 晉中 030619)

    酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是肝臟相關(guān)疾病和肝病死亡的主要原因之一[1]。ALD早期表現(xiàn)為急性酒精性損傷,主要原因是短時(shí)間內(nèi)飲用的大量酒精。肝細(xì)胞在人體消化吸收代謝酒精時(shí),產(chǎn)生大量的氧自由基和多種炎性介質(zhì),這些物質(zhì)使肝臟的氧化還原反應(yīng)無法進(jìn)行,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化,損害細(xì)胞膜,細(xì)胞器的功能受到限制,肝臟受到損傷[2]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療ALD需長期服用的保肝藥物會(huì)產(chǎn)生一定的耐藥性、藥源性疾病等不良反應(yīng)。

    決明子為豆科植物鈍葉決明Cassia btusifoliaL.或決明(小決明)Cassia toraL.的干燥成熟種子,具有清熱明目,潤腸通便的作用。研究發(fā)現(xiàn),決明子富含多種化學(xué)活性物質(zhì),主要包括蒽醌類、脂肪酸類、黃酮類、多糖類、苷類等[3],具有保肝[4]、降血壓[5]、降脂[6]、降糖[7]、抗氧化[8]等藥理作用。其中,水溶性物質(zhì)蒽醌類等被證實(shí)通過改善轉(zhuǎn)氨酶水平、抗炎、調(diào)節(jié)Nrf2介導(dǎo)的ERK/MAPK/JNK等信號(hào)通路等,緩解酒精引起的急性肝損傷[9-13]。

    為研究決明子緩解酒精所致肝損傷,本文通過灌胃白酒建立小鼠急性酒精性肝損傷模型[14],經(jīng)決明子水提物給藥后檢測(cè)小鼠血清及肝臟組織中生化指標(biāo)與血清炎性因子的變化,觀察肝臟病理組織病變程度,以明確決明子水提物對(duì)于肝臟的保護(hù)作用,并探討初步的作用機(jī)制,旨在為決明子進(jìn)一步開發(fā)與利用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    決明子(北京同仁堂,產(chǎn)地安徽,批號(hào):220216004),經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)張朔生教授鑒定為豆科植物鈍葉決明Cassia obtusifoliaL.或決明(小決明)Cassia toraL.的干燥成熟種子。白酒(42°,北京紅星);水飛薊素(批號(hào):C10742879,麥克林);通用型組織固定液(批號(hào):G1101,Servicebio);油紅染液、蘇木素染液、分化液、返藍(lán)液、甘油明膠封片劑(Servicebio);異丙醇(批號(hào):80109218,國藥集團(tuán))。

    甘油三酯(TG,批號(hào):20210819)、總膽固醇(TC,批號(hào):20210530)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT,批號(hào):20200815)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST,批號(hào):20210726)、丙二醛(MDA,批號(hào):20200921)、谷胱甘肽(GSH,批號(hào):20209717)(南京建成生物工程研究所);腫瘤壞死因子(TNF-α,批號(hào):202109),白介素1β(IL-1β,批號(hào):202107)、白介素6(IL-6,批號(hào):202106)(上海酶免生物);實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

    1.2 儀器與設(shè)備

    TGL-20B高速冷凍離心機(jī)(中國上海安亭科學(xué)儀器廠);AX224ZH/E十萬分之一電子天平(奧豪斯上海);KZ-III-FP高速低溫組織研磨儀(武漢賽維爾);SynergyHTX多功能酶標(biāo)儀(美國伯騰);RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);CRYOSTAR NX50冰凍切片機(jī)(Thermo);LEICA 819切片刀( 上海徠卡);黏附載玻片(冰凍切片,白漆色帶,G6012-2,Servicebio)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)ICR小鼠,雄性,體重15~25 g,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0011,合格證號(hào):110324210102969025[斯貝福(北京)]。倫理批準(zhǔn)號(hào):AWE202209002(動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度25 ℃,濕度40 %~70 %的清潔級(jí)動(dòng)物房。

    1.4 方法

    1.4.1 決明子水提物的制備 稱取決明子200 g,加8倍量的水,浸泡1 h,再加熱回流提取2次,每次30 min,將提取液混合濃縮至200 ml(相當(dāng)于生藥1 g/ml),備用。

    1.4.2 動(dòng)物分組、造模及給藥 參照文獻(xiàn)方法[15],將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,按體質(zhì)量高低,隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性組、決明子水提物低、中、高劑量組(2.25,4.5,9 g/kg)(依據(jù)2020年版《中國藥典》,通過人臨床劑量換算成小鼠等效劑量,按照折合后劑量的3,9,18倍換算而得),每組10只。空白組與模型組灌胃等體積蒸餾水,陽性組灌胃水飛薊素(0.2 g/kg),其余各給藥組按照相應(yīng)劑量灌胃給藥,連續(xù)給藥7 d。末次給藥9 h后,除空白組外其余各組均按照體質(zhì)量12 ml/kg一次性灌胃白酒(10 ml/kg),建立急性酒精性肝損傷模型。

    1.4.3 血液和組織樣本采集 最后一次給藥結(jié)束后,乙醚麻醉,摘眼球取血,室溫靜置30 min,于3000 r/min離心15 min,得待測(cè)血清,放置于-80 ℃冰箱。分離取肝臟并稱重,部分肝臟固定于組織固定液中,其余肝臟置于-80 ℃冰箱。

    1.4.4 體重變化及臟器指數(shù) 記錄60只小鼠體質(zhì)量每日的變化,計(jì)算小鼠日平均增重;解剖取新鮮肝臟,利用生理鹽水清洗干凈肝臟,置于濾紙上吸干水分后,稱重,計(jì)算肝臟的臟器指數(shù)。計(jì)算按式1、式2。

    1.4.5 肝臟組織油紅O染色 取肝臟組織同一部位的組織做冰凍切片,經(jīng)生理鹽水清洗后,用4 %多聚甲醛溶液固定,冰凍切片,晾干,油紅染液浸染6~8 min。將切片停留3 s后依次浸入60 %異丙醇分化2次,各3 s和5 s,再依次浸入純水中浸洗2次,各10 s。取出切片,停留3 s后浸入蘇木素復(fù)染3~5 min,純水浸洗3次,各5,10,30 s。分化液(以 60 %酒精為溶劑)分化2~8 s,蒸餾水洗2次各10 s,返藍(lán)液返藍(lán)1 s,將切片輕輕浸入自來水中浸洗2次,各5 s和10 s,甘油明膠封片。在顯微鏡下觀察肝臟組織的形態(tài)學(xué),并采集圖片[10]。

    1.4.6 生化指標(biāo)檢測(cè) 參照試劑盒說明,檢測(cè)小鼠血清中TG、TC、ALT、AST、MDA含量以及肝臟組織中GSH的含量。

    1.4.7 炎性因子水平的測(cè)定 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平。

    1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPadPrism 8.0.2統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),以均數(shù)±方差(±s)表示為數(shù)據(jù)資料,組間比較以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠體重及肝臟指數(shù)的影響

    與空白組相比,模型組體質(zhì)量顯著降低,肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.05或P<0.01)。體重降低表明酒精性肝損傷可能引起某些病理變化,引起小鼠食欲下降致體重增長減慢;肝臟指數(shù)顯著升高說明一次性大量飲酒使得肝臟受損,導(dǎo)致肝臟腫大。與模型組比較,陽性藥和決明子水提物高劑量組小鼠體質(zhì)量增長明顯,且能顯著降低肝臟指數(shù)(P<0.05或P<0.01),結(jié)果呈劑量依賴關(guān)系。表明決明子水提物可降低小鼠的肝臟指數(shù),緩解酒精造成的肝臟腫脹問題(見圖1)。

    圖1 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟指數(shù)、小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=10)

    2.2 對(duì)急性酒精性肝損傷的小鼠肝臟病理影響

    肝臟組織油紅O染色結(jié)果見圖2。由圖2可見,空白組小鼠肝組織未見脂肪顆粒堆積。模型組與空白組對(duì)比肝細(xì)胞體積增大,出現(xiàn)大量的不同程度的紅色脂滴聚集。與模型組相比,決明子水提物各組的脂滴聚集減少。結(jié)果表明,決明子水提物能減少急性酒精性肝損傷的小鼠體內(nèi)脂質(zhì)的累積。

    圖2 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟的病理變化的影響(×200)

    2.3 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清TG、TC含量的影響

    與空白組相比,模型組小鼠TG、TC水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)。與模型組相比,決明子水提物各劑量組TG、TC含量均有下降趨勢(shì),陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組TG、TC含量呈顯著下降(P<0.05或P<0.01)(見圖3)。表明決明子水提物能有效降低急性酒精性肝損傷血清中的TC、TG水平,對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的改善作用。

    圖3 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠TG、TC含量的影響(±s,n=10)

    2.4 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清氨基轉(zhuǎn)移酶水平ALT、AST含量的影響

    與空白組相比,模型組小鼠ALT、AST兩種氨基轉(zhuǎn)移酶水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,陽性藥組與決明子水提物各劑量組ALT含量均明顯下降(P<0.01),且呈劑量依賴性;陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組AST含量均明顯下降(P<0.01)(見圖4)。結(jié)果表明,決明子水提物能顯著降低氨基酸轉(zhuǎn)移酶的水平。

    圖4 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠AST、ALT含量的影響(±s,n=10)

    2.5 對(duì)急性酒精肝損傷小鼠血清GSH含量的影響

    與空白組相比,模型組小鼠GSH含量顯著降低(P<0.01);與模型組相比,陽性藥組與決明子水提物中、高劑量組GSH含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)(見圖5)。結(jié)果表明,決明子水提物可提高機(jī)體抗氧化酶的活性,消除酒精代謝過程中產(chǎn)生過多自由基及其他損害物質(zhì),從而減輕肝臟受損狀況。

    圖5 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠GSH含量的影響(±s,n=10)

    2.6 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠肝臟MDA含量的影響

    與空白組相比,模型組小鼠MDA水平顯著升高(P<0.001);與模型組相比,各劑量組均有不同程度的降低趨勢(shì),陽性藥組與決明子水提物高劑量組MDA水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)(見圖6)。結(jié)果表明,決明子水提物可減緩代謝酒精過程中脂質(zhì)過氧化反應(yīng),對(duì)急性酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

    圖6 決明子水提物對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠MDA含量的影響(±s,n=10)

    2.7 對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響

    與空白組相比,模型組顯著高于正常組(P<0.01),表明酒精代謝過程中可導(dǎo)致小鼠肝細(xì)胞發(fā)生炎性損傷;與模型組相比,陽性藥組與決明子水提物高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)(見圖7)。結(jié)果表明,決明子水提物可抑制炎性因子水平,發(fā)揮其肝保護(hù)作用。

    綜上,決明子水提物對(duì)酒精引起的酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能與改善肝細(xì)胞代謝紊亂、降低脂質(zhì)代謝、提高機(jī)體抗氧化酶活性、抑制促炎細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)[16-26]。本研究為進(jìn)一步開發(fā)決明子水提物保肝等功能性產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ),下一步將探究決明子緩解急性酒精性肝損傷的通路和靶點(diǎn)。

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