鈣蛋白酶2通過誘導三陰乳腺癌細胞上皮間質轉化抵抗紫杉醇的機制探討

陳聰，吳元肇，鄭克思，應文兵，胡逸人

三陰性乳腺癌是具有較強侵襲性表型的乳腺癌亞型，易復發(fā)和轉移，且無法進行內分泌治療和人表皮生長因子受體2 靶向治療［1-2］?；瘜W治療仍然是三陰性乳腺癌的重要治療手段，但隨著治療的推進，腫瘤細胞逐漸出現(xiàn)藥物抵抗而產生繼發(fā)性耐藥，最終導致治療失敗［3］。因此，如何解決藥物抵抗具有重要臨床意義。鈣蛋白酶-2（Calpain-2）是廣泛表達于人體的鈣蛋白酶家族成員，其主要通過蛋白水解活性發(fā)揮其生物學作用［4］。研究顯示，Calpain-2在腎細胞癌［5］、乳腺癌［6］、胰腺癌［7］等多種惡性腫瘤中發(fā)揮作用，參與調控細胞侵襲、遷移及轉移。此外，Calpain-2 還在肺癌［8］和結直腸癌［9］化療抵抗中發(fā)揮重要作用。但在三陰性乳腺癌中，Calpain-2與藥物抵抗的關系及相關機制還不清楚。本研究通過外源性過表達Calpain-2，觀察其在三陰性乳腺癌細胞抵抗紫杉醇（PTX）中的作用及機制，為臨床治療提供基礎理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞購自南京科佰生物科技有限公司；Calpain-2過表達質粒和空載質粒購自上海和元生物技術有限公司；脂質體2000 購自上海Invitrogen 公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、青-鏈霉素混合液、噻唑藍（MTT）購自北京索萊寶科技有限公司。Calpain-2 抗體、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體、波形蛋白（Vimentin）抗體、yes 相關蛋白（YAP）抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自武漢云克隆科技股份有限公司；小鼠抗人大腫瘤抑制基因1（LATS1）抗體、p-LATS1抗體、p-YAP抗體、山羊抗小鼠IgG抗體及山羊抗小鼠IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗購自上海愛必信生物科技有限公司；YAP抑制劑XMU-MP-1購自美國MCE公司；胎牛血清（FBS）購自美國Gibco 公司。多功能酶標儀（型號SpectraMax 190）購自美國Molecular Devices 公司；全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀（型號Tanon 2500）購自上海天能公司；高速低溫離心機（型號AllegraTM21R）購自美國貝克曼公司；倒置熒光顯微鏡（型號IX71）購自日本奧林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、轉染及分組 將MDA-MB-231 細胞接種于含10%FBS和1%青-鏈霉素混合液的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/孔接種于6 孔板中培養(yǎng)過夜。次日，將10 μL Calpain-2過表達質粒和空載質粒加入100 μL高糖DMEM培養(yǎng)基中，并靜置5 min。各向100 μL 高糖DMEM 培養(yǎng)基中加入20 μL脂質體2000，并靜置5 min。將各質粒稀釋液與脂質體2000稀釋液混勻靜置20 min。取出細胞，棄去舊培養(yǎng)基并以PBS 清洗，加入上述混合液，補加800 μL 高糖DMEM 培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 h。而后更換為全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。將轉染Calpain-2過表達質粒和空載質粒的細胞設為過表達組和空載體組，同時以不做轉染的正常細胞作為空白組。蛋白質免疫印跡實驗對Calpain-2蛋白表達進行驗證。

1.2.2 MTT 法檢測細胞存活率 細胞以8 000 個/孔接種于96孔板中，以0、1、5、15、25、50 nmol/L PTX 處理細胞48 h，同時，以DMSO 處理細胞作為溶劑對照，以未處理的細胞作為空白對照。藥物處理結束后每孔加入15 μL MTT（5 g/L）溶液于培養(yǎng)箱孵育4 h。棄去培養(yǎng)液，加入150 μL MDSO 溶解結晶后檢測570 nm波長處吸光度值，實驗重復3次。細胞存活率（%）=（實驗孔-空白對照孔）/（溶劑對照孔-空白對照孔）×100%。計算細胞存活率為50%時的藥物濃度，即半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.2.3 免疫熒光法檢測細胞YAP 蛋白分布 將細胞接種于35 mm激光共聚焦專用培養(yǎng)皿中，過表達組和空載體組細胞轉染10 h后，細胞更換全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去舊培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛和免疫組織細胞通透液分別處理10 min。細胞以10%正常山羊血清封閉1 h 后，于4 ℃孵育YAP 抗體過夜。次日洗去一抗并孵育IgG（H+L）Alexa Fluor 488 二抗1 h，PBST 洗去二抗后加入DAPI 避光孵育5 min。細胞用PBST 洗3 遍，滴加抗熒光猝滅封片液封片，于熒光顯微鏡下成像并拍照。實驗重復3次。

1.2.4 蛋白質免疫印跡實驗檢測蛋白表達 3 組細胞用含1×蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液裂解細胞10 min。在4 ℃、14 000×g離心20 min 并收集上清液。采用BCA蛋白定量法檢測上清液蛋白濃度，隨后以蛋白上樣緩沖液制備蛋白樣品。樣品經SDS-PAGE 電泳和轉印法將蛋白分離并轉印至PVDF 膜上。將載有蛋白的PVDF 膜于4 ℃孵育Calpain-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、LATS1（1∶1 000）、p-LATS1（1∶1 000）、p-YAP（1∶1 000）及YAP（1∶1 000）抗體過夜。次日洗去一抗后孵育對應山羊抗兔IgG抗體或山羊抗小鼠IgG抗體1 h。去除二抗后用ECL化學發(fā)光試劑盒在凝膠成像儀下對蛋白條帶進行成像。實驗重復3次。

1.2.5 XMU-MP-1 干預 以XMU-MP-1（1 μmol/L）處理過表達組細胞24 h 作為XMU-MP-1+過表達組，同時培養(yǎng)空載體組和過表達組細胞作為對照。MTT 法檢測PTX 對各組細胞存活的影響，蛋白質免疫印跡實驗檢測N-cadherin、Vimentin和E-cadherin蛋白表達。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學方法 以Graphpad 7.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Calpain-2 增強MDA-MB-231 細胞抵抗PTX 空載體組Calpain-2 蛋白表達與空白組差異無統(tǒng)計學意義，而過表達組Calpain-2蛋白表達高于空載體組（P＜0.05），見圖1A、B。PTX 處理后空白組和空載體組細胞存活率差異無統(tǒng)計學意義，但與空載體組相比，過表達組細胞存活率升高（P＜0.05），見圖1C。計算PTX 對各組細胞的IC50發(fā)現(xiàn)，過表達組IC50高于空載體組（P＜0.05），見圖1D。

Fig.1 Role of Calpain-2 in the resistance of triple-negative breast cancer cells to PTX圖1 Calpain-2在三陰性乳腺癌細胞抵抗PTX中的作用

2.2 Calpain-2 誘導三陰性乳腺癌細胞EMT 相較于空白組，空載體組E-cadherin、N-cadherin 及Vimentin 蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與空載體組相比，過表達組細胞N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達上調，E-cadherin 蛋白表達下調（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Effect of Calpain-2 on EMT of triple-negative breast cancer cells圖2 3組細胞EMT相關蛋白表達水平變化

2.3 Calpain-2 誘導YAP 磷酸化及胞漿轉移 相較于空白組，空載體組p-LATS1和p-YAP蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義；與空載體組相比，過表達組p-LATS1 和p-YAP 蛋白表達上調（P＜0.05），見圖3。與空載體組相比，過表達組細胞核內YAP 分布減少，見圖4。

Fig.3 Effect of Calpain-2 on the expression of YAP圖3 Calpain-2對YAP表達的影響

Fig.4 Effect of Calpain-2 on the distribution of YAP(immunofluorescence,×400)圖4 Calpain-2對YAP蛋白分布的影響（免疫熒光染色，×400）

2.4 抑制表達YAP 可逆轉Calpain-2誘導的三陰性乳腺癌細胞EMT 與過表達組相比，XMU-MP-1+過表達組N-cadherin 和Vimentin 蛋白表達下調，E-cadherin蛋白表達上調（P＜0.05），見圖5。

Fig.5 Role of YAP inhibition in Calpain-2 induced EMT in triple negative breast cancer cells圖5 抑制YAP在Calpain-2誘導三陰性乳腺癌細胞EMT中的作用

2.5 抑制YAP 可逆轉Calpain-2誘導的三陰性乳腺癌細胞PTX 抵抗 PTX 處理后，與過表達組相比，XMU-MP-1+過表達組細胞存活率降低（P＜0.05），見圖6A。XMU-MP-1+過表達組IC50低于過表達組（P＜0.05），見圖6B。

Fig.6 Inhibition of YAP in Calpain-2-induced PTX resistance in triple-negative breast cancer cells圖6 抑制YAP在Calpain-2誘導的三陰性乳腺癌細胞PTX抵抗中的作用

3 討論

藥物抵抗是三陰性乳腺癌治療失敗的主要原因之一。Calpain-2 已被證實在惡性腫瘤化療藥物抵抗中發(fā)揮作用。研究顯示，Calpain-2通過表皮生長因子受體（EGFR）-磷酸化蛋白激酶B（pAKT）通路增強非小細胞肺癌對PTX的化療抵抗［8］。還有研究報道，Calpain-2 依賴性的核因子κB 抑制因子α（IκBα）降解介導了結直腸癌異種移植中的鹽酸伊立替康耐藥［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性過表達Calpain-2 可增強三陰性乳腺癌細胞抵抗PTX。這與文獻報道［8］結果相類似，但Calpain-2 的相關信號機制還不清楚。上皮間質轉化（EMT）是腫瘤細胞獲得更強遷移和侵襲能力的重要生物學過程［10］。目前，大量研究顯示，腫瘤細胞EMT 參與化療藥物抵抗。Cheng等［11］發(fā)現(xiàn)，G蛋白結合蛋白1通過磷酸激酶1激活的EMT 信號在非小細胞肺癌中促進厄洛替尼的抵抗。卵巢癌相關研究顯示，lncRNA CHRF 通過miR-10b誘導的EMT和信號轉導和轉錄激活因子3信號激活參與卵巢癌順鉑抗抵抗［12］。而在三陰性乳腺癌中，EMT 在介導TGF-β 誘導的抗藥性中發(fā)揮重要作用［13］。本研究顯示，與空載體組相比，Calpain-2 過表達組間質標志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達上調，上皮標志物E-cadherin 蛋白表達下調，提示Calpain-2可能誘導三陰性乳腺癌細胞EMT。

YAP 是Hippo 信號通路的核心效應因子，在腫瘤生物學活動中發(fā)揮重要作用。目前，YAP 的生物學作用尚存爭議，其細胞核表達存在抑癌和促癌兩種觀點。部分研究顯示，YAP 被上游蛋白LATS1/2磷酸化后定位于細胞質并最終降解，而去磷酸后，YAP轉運到胞核內發(fā)揮促癌作用［14-15］。另有研究發(fā)現(xiàn)，YAP細胞核表達與腫瘤細胞惡性程度呈負相關，主要發(fā)揮抑癌作用［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，Calpain-2 過表達組MDA-MB-231 細胞YAP 磷酸化和細胞漿表達增加。為驗證YAP 胞漿表達的潛在作用，本研究繼續(xù)觀察了XMU-MP-1 的干預作用。XMU-MP-1作為化學合成的小分子化合物，可阻斷MST1/2-LATS1/2 通路磷酸化，從而誘導YAP 從細胞漿易位至細胞核內［18］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，XMU-MP-1預處理可逆轉Calpain-2 誘導的MDA-MB-231 細胞PTX抵抗。提示Calpain-2 誘導的YAP 胞漿表達促進了PTX抵抗，Calpain-2在MDA-MB-231細胞中起促癌作用。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)XMU-MP-1預處理可逆轉Calpain-2 過表達誘導的MDA-MB-231 細胞EMT，提示YAP參與介導Calpain-2誘導的三陰性乳腺癌細胞EMT。

綜上，Calpain-2過表達可誘導MDA-MB-231細胞對PTX 抵抗，而該作用與YAP 介導的EMT 有關。本研究揭示了Calpain-2 誘導三陰性乳腺癌細胞化療抵抗的作用及其機制，完善了對Calpain-2生物學功能的認識，可為臨床治療提供基礎理論支持。