TP53基因單核苷酸多態(tài)性與原發(fā)性肝細胞癌預后的關系

唐豪言，潘正龍，劉小方

在世界范圍內(nèi)肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的發(fā)病率和死亡率位居惡性腫瘤第6 位和第4 位［1］，主要由乙型肝炎病毒慢性感染所致。中國是乙肝大國，肝癌發(fā)病率高居我國惡性腫瘤的第4位［2］。目前，HCC 有許多既定的治療方法，包括化療、射頻消融、肝移植及手術切除等。然而，即使早期已接受相關治療的患者生存率也比較低，手術作為最常見的治療手段，術后5 年內(nèi)的肝癌復發(fā)率也高達60%～70%［3-4］。研究HCC患者術后預后的危險因素，對提高肝癌的治療效果具有重要意義。TP53基因作為一個高度突變的抑癌基因，涉及人類多數(shù)腫瘤。該基因位于染色體17p13.1，由12 個外顯子和10 個內(nèi)含子組成，其蛋白產(chǎn)物p53 維持著細胞正常的基本活動，如細胞周期、細胞衰老、細胞凋亡和DNA損傷修復［5-6］。TP53基因突變作為HCC里最常見的突變［7］，其改變不僅與腫瘤增殖、遷移、生長、侵襲及化療藥物的耐藥性相關［8-9］，同時具有TP53基因突變的患者肝癌復發(fā)時間和總生存期也會受到影響［10］。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）作為基因重要的變異形式，廣泛參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［11］。近年來，與腫瘤預后有關的多態(tài)性位點被相繼報道，但關于HCC預后的研究相對較少。本研究旨在探討HCC 患者預后的影響因素，并探究TP53基因SNP與HCC患者預后的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2014 年1 月—2020 年9 月在青島大學附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院接受手術治療且住院資料完整的HCC患者213例。納入標準：已行肝惡性腫瘤切除手術；病理組織學診斷為HCC；采集血液樣本前未行放療或化療。排除標準：既往有其他腫瘤病史；同期合并其他器官惡性腫瘤。研究參與者對試驗知情同意，且通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理號：煙毓醫(yī)倫理審2019-169號）。

1.2 收集指標 通過查閱病歷和標準化問卷收集研究對象年齡、性別，吸煙、飲酒情況，乙型病毒性肝炎感染病史、手術方式及圍術期輸血病史。同時收集患者相關臨床病理學數(shù)據(jù)，包括腫瘤T分期、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、肝硬化、門靜脈癌栓情況等。

1.3 隨訪 通過電話或門診進行隨訪。術后前2年每3個月進行1次，從術后第3年起每6個月進行1次。隨訪終點事件為患者死亡或隨訪截止時間（截至2021年9月1日）。

1.4 SNP位點的選擇和基因分型 基于以往相關腫瘤報道，尤其是涉及HCC預后文獻，并利用TRANSFACR預測軟件及NCBI dbSNP數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）篩選出TP53基因功能性SNP位點。其選擇標準為：SNP位點的最小等位基因頻率（minor allele frequency，MAF）＞0.05。最終篩選出3 個SNP 作為研究對象，即TP53 基因rs1625895、rs9895829和rs28934578。

取靜脈血5 mL，采用血液基因組提取試劑盒（北京博奧醫(yī)學檢驗所有限公司）提取DNA，DNA片段需完整性好，無降解，無小片段RNA 污染，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎镁酆厦告湻磻?限制性片段長度多態(tài)性技術（PCR-RFLP）對基因型進行鑒別。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］。TP53 rs1625895引物序列：上游5'-TGGCCATCTACAAGCAGTCA-3'，下游5'-TTGCACATCTCATGGGGTTA-3'。TP53 rs9895829 引物序列：上游5'-GCACCTCCTGCAACCCACTAGCGAT-3'，下游5'-CTCTCAAAGAGGCCAAGGCAGGCAG-3'。TP53 rs28934578 引物序列：上游5'-GTCTCTGCTAGGGGGCTGGACTTGG-3'，下游5'-CAGGAGTGCTTGGGTTGTGGTGAAA-3'。各SNP 位點均需要1 條延伸引物和2 條PCR 擴增引物。PCR 擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，45 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR 產(chǎn)物使用限制性內(nèi)切酶消化，消化程序：37 ℃40 min，85 ℃5 min。按照延伸反應擴增程序進行PCR產(chǎn)物的延伸，所得產(chǎn)物采用樹脂板進行純化。采用MassARRAY?質(zhì)譜分析儀（美國Agena Bioscience 公司）對產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析，檢測數(shù)據(jù)使用Typer 4.0 分析軟件分析。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用例（%）表示。運用單因素或多因素Cox比例風險回歸模型計算危險比（HR）及其95%CI并校正混雜因素，采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Log-rank 檢驗比較不同基因型之間的生存率差異。檢驗水準雙側α=0.05。

2 結果

2.1 研究對象一般資料及臨床特征與HCC 預后的關系 單因素Cox 回歸分析結果顯示腫瘤大小、腫瘤T 分期、手術方式、圍術期輸血、腫瘤數(shù)目及肝硬化情況與肝癌預后相關（P＜0.05），但年齡、性別、吸煙、飲酒、HBV感染史、肝癌家族史與及門靜脈癌栓方面差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1 Relationship between clinical characteristics and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表1 HCC患者臨床特征與預后的關系［例（%）］

2.2TP53SNPs 與HCC 預后的關系TP53基因rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群體代表性。采用Kaplan-Meier、單因素Cox 回歸分析rs1625895、rs9895829、rs28934578 位點后發(fā)現(xiàn)：TP53基因rs1625895 除顯性模型外，其共顯性模型（HR=2.190，95%CI：1.142～4.201，P=0.018）和隱性基因模型（HR=2.275，95%CI：1.225～4.227，P=0.009）與肝癌患者預后相關，見圖1、表2。由于大多數(shù)肝癌患者確診時年齡較大，老年患者的中位生存時間均短于年輕患者，故對年齡進行分層分析。結果顯示在年齡≥60歲的人群中，共顯性模型和隱性模型中AA基因型患者預后表現(xiàn)更差。TP53基因rs9895829、rs28934578位點基因多態(tài)性與HCC預后無關（P＞0.05），見表3。

Fig.1 TP53 gene rs1625895 Kaplan-Meier survival curve in patients with hepatocellular carcinoma patients圖1 HCC患者TP53基因rs1625895位點不同遺傳模型的生存曲線

Tab.2 Relationship between TP53 SNPs and the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表2 TP53 SNPs與HCC患者預后的關系［例（%）］

Tab.3 Relationship between TP53 gene rs1625895 and prognosis of HCC patients after age stratification表3 年齡分層后TP53基因rs1625895位點多態(tài)性與HCC患者預后的關系［例（%）］

2.3 HCC預后的影響因素分析 采用多因素Cox回歸分析影響HCC 患者術后預后的獨立因素。變量賦值：腫瘤T 分期（T1+T2＝0，T3+T4＝1）；腫瘤大?。ǎ? cm＝0，≥5 cm＝1）；rs1625895（AG/GG＝0，AA＝1）；手術方式（根治性切除＝0，姑息性切除＝1）；圍術期輸血（否＝0，是＝1）；腫瘤數(shù)目（單發(fā)＝0，多發(fā)＝1）；肝硬化（否＝0，是＝1）。結果顯示腫瘤T3+T4 分期、腫瘤直徑≥5 cm、TP53rs1625895 AA 基因型、腫瘤姑息性切除、圍術期輸血、腫瘤多發(fā)以及患有肝硬化是影響肝癌預后的獨立危險因素，見表4。

Tab.4 Cox regression analysis of the prognosis of hepatocellular carcinoma patients表4 HCC患者預后多因素Cox比例風險回歸結果

3 討論

本研究探討TP53基因多態(tài)性與HCC 預后的關系，結果顯示rs1625895位點多態(tài)性與肝癌術后生存期相關，AA 基因型患者較AG/GG 基因型患者術后預后更差，這一情況在年齡≥60歲人群中更為明顯。

3.1TP53基因SNP研究現(xiàn)狀TP53基因SNP在多個與癌癥相關的途徑中發(fā)揮核心作用［12］。p53通路里存在許多涉及不同腫瘤且功能復雜的SNP 位點，它們結構變異或異常表達能不同程度地影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展，最終影響患者預后并體現(xiàn)于患者的生存周期上。目前已證實TP53基因多態(tài)性位點與多種腫瘤預后相關。Assad Samani 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在伊朗人群中，rs1625895位點攜帶A等位基因的乳腺癌患者早期死亡風險是攜帶G 等位基因患者的3 倍。Voropaeva 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，rs1625895 多態(tài)性會影響彌漫性大B 細胞淋巴瘤患者化療方案的治愈率，大大降低患者生存周期。在TP53基因多態(tài)性與低位直腸癌的生物學行為相關研究中，Zhang等［15-16］發(fā)現(xiàn)p53蛋白表達受TP53基因rs1042522多態(tài)性影響，這使得腫瘤更快發(fā)展到晚期，間接縮短了患者的生存期。

3.2TP53基因SNP 與HCC 的關系 本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895位點多態(tài)性與肝癌術后人群生存周期相關。rs1625895 位于TP53基因第6 內(nèi)含子上，由等位基因A和G組成，該區(qū)域的SNP通常會影響TP53mRNA 的加工（如剪接）步驟及DNA 鏈和蛋白分子之間的相互作用，同時引起細胞DNA 損傷修復及凋亡能力下降，加速腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展［13，17-18］。TP53基因該點的多態(tài)性是因限制性內(nèi)切酶MspI上的鳥嘌呤與腺嘌呤之間的替換所引起的，這會影響到限制性內(nèi)切酶的正常功能，進而導致TP53基因表達減少，并可能破壞細胞周期停滯和凋亡所需的靶基因轉錄激活的過程［19］。特別是當這種突變與有缺陷的腫瘤抑制因子或紡錘體檢查位點相結合時，更容易引起基因組不穩(wěn)定［20-21］。有研究表明TP53基因該位點的多態(tài)性可能會讓其失去抑制腫瘤的功能，相反會獲得一種推進腫瘤發(fā)生發(fā)展的新能力。楊怡等［22］研究發(fā)現(xiàn)TP53基因的變異會促進血管新生，肝臟腫瘤病灶轉移發(fā)生率增高，腫瘤更具侵襲性，最終使得患者的生存周期明顯縮短。同時有研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織學分級不光與TP53基因突變有關，突變患者的總體生存期、疾病特異性生存期、無進展生存期和無病生存期也明顯差于無突變的患者［6］。

3.3 HCC預后的影響因素 本研究多因素Cox回歸分析結果顯示，腫瘤T3+T4分期、腫瘤直徑≥5 cm、腫瘤姑息性切除、圍術期輸血、腫瘤多發(fā)及患有肝硬化同樣是影響肝癌患者術后預后的獨立危險因素。分析其原因如下：（1）T分期較晚的患者往往肝功能已嚴重受損，行肝切除術時會增大術中大出血及術后出現(xiàn)肝功能衰竭的風險［23］。（2）腫瘤大小和微血管侵襲之間存在顯著的關聯(lián)，即腫瘤體積較大者發(fā)生術后腹腔轉移風險高，從而降低了患者生存期［24］。（3）多發(fā)腫瘤較單發(fā)腫瘤更易轉移，同時多發(fā)腫瘤更易導致抑制肝癌細胞生長和侵襲的基因突變［25］。（4）肝硬化常伴有凝血功能的異常，這不僅增加出血風險同時還增大了手術難度［26］。（5）根治性肝切除的患者殘存肝臟的負荷會增大，而姑息性手術的患者則會因殘留的癌細胞導致腫瘤復發(fā)［27］。（6）圍術期輸血會降低機體外周血淋巴細胞數(shù)量，降低免疫功能，可能會增加殘余肝臟內(nèi)新生腫瘤的復發(fā)［28］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)TP53基因rs1625895 位點與HCC患者術后的預后相關，尤其對老年群體術后OS影響更大。但同時也存在一定局限性，SNP位點分布頻率可能會受到地域、人種等因素的影響，進而導致結果的偏差。本研究樣本量相對較小，今后將增大樣本量并采用前瞻性研究進一步證實。目前關于TP53基因多態(tài)性與HCC 預后的報道相對較少，其中的分子機制還尚未完全闡明，對于未來肝癌相關基因多態(tài)性位點研究的方向，功能驗證將是重要的一環(huán)，這需要進一步深入探究。