CircBACH1調(diào)節(jié)miR-140-5p/MDM2軸對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響

劉薈敏，許旋旋，王遠(yuǎn)麗，熊濤，唐元艷

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其特征是腫瘤性漿細(xì)胞的異常增殖和積累［1］。目前蛋白酶體抑制劑如硼替佐米已被廣泛用于MM 治療，雖顯著提高了MM患者的生存率，但由于耐藥性及初始治療后復(fù)發(fā)率較高，該病仍無法治愈［2-3］。研究MM 的耐藥機(jī)制和尋找新的治療靶點(diǎn)對改善MM化療敏感性具有重要意義。環(huán)狀RNA BTB 域名和CNC同系物1（CircBACH1）可作為miR-656-3p的海綿，提高纖溶酶原激活物抑制劑1 RNA 結(jié)合蛋白1表達(dá)，加速肝癌進(jìn)展［4］，但其在MM 中的作用還未知。許多miRNA 的異常表達(dá)與MM 的發(fā)展有關(guān)，如miR-140-5p 在MM 中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-140-5p可通過靶向血管內(nèi)皮生長因子A 抑制MM 細(xì)胞增殖，其也可以通過被Linc00515靶向上調(diào)抑制MM細(xì)胞的自噬和化學(xué)耐藥性［5-6］。鼠雙微體2（MDM2）是一種E3泛素連接酶，與白血病和淋巴瘤等血液系統(tǒng)惡性腫瘤的放化療耐藥相關(guān)，在MM中過表達(dá)，可增強(qiáng)MM 細(xì)胞的增殖和存活能力［7］。研究顯示，miR-140-3p 可以通過調(diào)節(jié)KLF5/N-cadherin/MDM2/Slug軸促進(jìn)多能間充質(zhì)干細(xì)胞在椎間盤退變中的再生作用［8］，但CircBACH1、miR-140-5p與MDM2三者間的靶向關(guān)系尚不明確。本研究旨在分析CircBACH1對MM 細(xì)胞增殖、凋亡和化療敏感性的影響，以及對miR-140-5p/MDM2軸的靶向調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣本和細(xì)胞 選取2021年1月—2022年12月荊州市中心醫(yī)院收治的未接受放化療的18例MM患者（MM組）骨髓，其中男11 例，女7 例，年齡50～75 歲。同時(shí)抽取18 例骨髓移植健康供者骨髓作為正常對照組，其中男10例，女8例，年齡42～68歲。所有臨床檢驗(yàn)樣本的采集均經(jīng)受檢者知情同意并獲得醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：202001136）。人MM 細(xì)胞系U266細(xì)胞購自于武漢普賽諾生命科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 EDTA.2K 抗凝劑（上海源葉生物科技有限公司）；人全血單個(gè)核細(xì)胞分離液（Ficoll配制，上海吉至生化科技有限公司）；FITC標(biāo)記抗人CD138抗體（艾美捷科技有限公司）；RNA 提取試劑、一步法實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 和All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit（ 美國GeneCopoeia 公司）；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑（北京百奧創(chuàng)新科技有限公司）；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；硼替佐米（正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20204018）；si1-CircBACH1、si2-CircBACH1及陰性對照（NC）、miR-140-5p mimic及NC、antimiR-140-5p 及NC、p-mirGLO-CircBACH1-WT、p-mirGLOMDM2-WT 及 p-mirGLO-CircBACH1-MUT、p-mirGLOMDM2-MUT 質(zhì)粒構(gòu)建（上海吉?jiǎng)P基因公司）；qRT-PCR 引物合成（上海生工生物工程股份有限公司）；B 細(xì)胞淋巴因子2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、裂解的胱天蛋白酶（cleaved caspase）-3 兔單克隆抗體（英國Abcam 公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（沈陽萬類生物科技有限公司）；MiniMACSTM 磁珠細(xì)胞分選儀（德國Miltenyi 公司）；SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀（美谷分子儀器有限公司）；CFX96 Touch 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國伯樂公司）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）。

1.3 研究方法

1.3.1 免疫磁珠分離骨髓液中CD138+漿細(xì)胞 取加入EDTA-K2抗凝劑的骨髓液3 mL，使用Ficoll分離液分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，然后利用CD138 標(biāo)記磁珠抗體進(jìn)行孵育，并加入磁珠分選緩沖液，經(jīng)過MACS磁珠分選器分離CD138+漿細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)驗(yàn)證漿細(xì)胞。剩余細(xì)胞離心后，TRIzol法提取總RNA，并放置-20 ℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人MM 細(xì)胞系U266 細(xì)胞接種于含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗的PMI-1640 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率生長至80%后進(jìn)行傳代。

1.3.3 qRT-PCR 檢測細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的表達(dá) 分別收集MM組和正常對照組的漿細(xì)胞以及U266 細(xì)胞，用TRIzol 法提取總RNA。miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（All-in-One ?miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成miRNA 對應(yīng)的cDNA 第一鏈，再以cDNA 為模板使用miRNA qPCR 定量試劑盒（All-in-One?miRNA qPCR Kit）對miR-140-5p 進(jìn)行定量，隨后以總RNA為模板，按照一步法qRT-PCR試劑盒對CircBACH1和MDM2進(jìn)行定量。qRT-PCR 反應(yīng)體系：2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，Enzyme 1 μL，上下游引物各0.5 μL，RNA 1 μL，補(bǔ)ddH2O 至總體積20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；二步法，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個(gè)循環(huán)。CircBACH1、MDM2 以GAPDH 為內(nèi)參，miR-140-5p 以U6 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的相對表達(dá)量，引物序列見表1。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

Tab.1 qRT-PCR primers表1 qRT-PCR引物

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 先構(gòu)建兩個(gè)靶向CircBACH1 的siRNA 質(zhì)粒，分別為siRNA1-CircBACH1 和siRNA2-CircBACH1，將兩個(gè)不同敲低位點(diǎn)的質(zhì)粒利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至U266 細(xì)胞中，記為si1-CircBACH1 組和si2-CircBACH1 組，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染（Control 組）和轉(zhuǎn)染空載體（si-NC 組）作為陰性對照。然后通過qRT-PCR 檢測各組CircBACH1 的表達(dá)來確定最優(yōu)敲低位點(diǎn)，并在轉(zhuǎn)染si-CircBACH1 的基礎(chǔ)上進(jìn)行回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞分為si-CircBACH1+anti-miR-NC 組（共轉(zhuǎn)染si-CircBACH1 和antimiR-NC）和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組（共轉(zhuǎn)染si-CircBACH1 和anti-miR-140-5p），轉(zhuǎn)染48 h 后收集各組細(xì)胞分別提取RNA 和蛋白，并按照1.3.3 的方法檢測各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA的表達(dá)。

1.3.5 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活性 將轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞以1×103個(gè)/孔接種至96 孔板中，加入100 μL PMI-1640 培養(yǎng)基并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后在每孔中加入10 μL 的CCK-8 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）=（OD實(shí)驗(yàn)組-OD空白組）（/OD對照組-OD空白組）×100%。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及化療敏感性 凋亡檢測：將轉(zhuǎn)染48 h 后的各組細(xì)胞接種至6 孔板中（1×104個(gè)/孔），加入普通培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，重懸細(xì)胞，4 ℃，300×g離心5 min收集細(xì)胞。然后分別加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，室溫避光孵育15 min?；熋舾行詸z測：另取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞接種至6孔板，加入含有20 nmol/L硼替佐米的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h［11］，然后收集細(xì)胞，其余步驟同上，用流式細(xì)胞儀分別檢測加入硼替佐米前后的細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 Western blot 檢測細(xì)胞中Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后神經(jīng)元并用PBS 清洗，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。然后將蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中。將膜用5%脫脂奶粉室溫孵育1 h，然后加入Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3兔單克隆抗體稀釋液（1∶2 000）在4 ℃下孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗稀釋液（1∶500）在室溫下孵育1 h，用ECL 發(fā)光試劑顯色，用凝膠成像儀成像，以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件分析并計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.3.8 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-140-5p 與CircBACH1、MDM2之間的靶向關(guān)系 先通過ENCORI（https://starbase.sysu.edu.cn）進(jìn)行生物信息預(yù)測miR-140-5p 在CircBACH1、MDM2 的3'UTR 上的結(jié)合位點(diǎn)。然后利用pmirR-GLO 載體分別構(gòu)建野生型質(zhì)粒CircBACH1-WT、MDM2-WT 和突變型質(zhì)粒CircBACH1-MUT、MDM2-MUT，再將野生型和突變型質(zhì)粒分別與miR-140-5p mimic 或miR-140-5p mimic-NC 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，48 h 后用雙螢光素酶活性檢測試劑盒檢測螢光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad prism 8.0分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey’s檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA 在細(xì)胞中表達(dá)水平比較 與正常對照組相比，MM 組的骨髓漿細(xì)胞及U266 細(xì)胞中CircBACH1、MDM2 mRNA 表達(dá)升高，miR-140-5p 表達(dá)降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of CircBACH1,miR-140-5p and MDM2 between three groups表2 各組CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA表達(dá)水平比較（n=18，）

Tab.2 Comparison of mRNA expression levels of CircBACH1,miR-140-5p and MDM2 between three groups表2 各組CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA表達(dá)水平比較（n=18，）

＊＊P＜0.01；a與正常對照組比較，P＜0.05。

組別正常對照組MM組U266細(xì)胞F CircBACH1 1.02±0.07 1.97±0.15a 2.01±0.12a 405.689＊＊miR-140-5p 0.98±0.06 0.37±0.03a 0.34±0.03a 1304.333＊＊MDM2 0.96±0.05 1.61±0.11a 1.68±0.10a 346.024＊＊

2.2 不同位點(diǎn)敲低細(xì)胞中CircBACH1 的表達(dá)水平比較 Control組、si-NC組、si1-CircBACH1組和si2-CircBACH1 組細(xì)胞CircBACH1 表達(dá)水平分別為0.99±0.04、0.98±0.05、0.43±0.02和0.56±0.03，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=184.148，P＜0.01）；與Control 組和si-NC 組相比，si1-CircBACH1 組和si2-CircBACH1 組細(xì)胞中CircBACH1 的表達(dá)水平均降低，且si1-CircBACH1 組中CircBACH1 的表達(dá)水平低于si2-CircBACH1 組（P＜0.05），選用效率更高的si1-CircBACH1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA 的表達(dá) 與Control 組和si-NC 組相比，si-CircBACH1 組CircBACH1、MDM2 mRNA 表達(dá)降低，miR-140-5p 表達(dá)升高（P＜0.05）；與si-CircBACH1+anti-miR-NC 組相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組CircBACH1 表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-140-5p 表達(dá)降低，MDM2 mRNA 表達(dá)升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of CircBACH1,miR-140-5p and MDM2 between five groups of cells表3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of CircBACH1,miR-140-5p and MDM2 between five groups of cells表3 各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 mRNA表達(dá)水平比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與si-NC 組比較，c 與si-CircBACH1+anti-miR-NC組比較，P＜0.05；表4同。

CircBACH1 1.00±0.00 0.98±0.05 0.46±0.03ab 0.44±0.02 miR-140-5p 1.00±0.00 1.02±0.05 1.93±0.13ab 1.91±0.14組別Control組si-NC組si-CircBACH1組si-CircBACH1+antimiR-NC組si-CircBACH1+antimiR-140-5p組F MDM2 1.00±0.00 1.01±0.06 0.39±0.02ab 0.41±0.03 0.46±0.031.32±0.08c 0.77±0.05c 187.459＊＊276.128＊＊69.823＊＊

2.4 細(xì)胞增殖活性比較 Control 組、si-NC 組、si-CircBACH1組、si-CircBACH1+anti-miR-NC 組和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組細(xì)胞增殖活性（%）分別為82.65±6.57、80.19±6.24、31.18±4.24、32.67±4.47、63.48±5.12，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=63.860，P＜0.01）；與Control 組和si-NC 組相比，si-CircBACH1 組細(xì)胞增殖活性降低（P＜0.05）；與si-CircBACH1 組和si-CircBACH1+anti-miR-NC 組相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組細(xì)胞增殖活性升高（P＜0.05）。

2.5 敲低CircBACH1 對細(xì)胞凋亡的影響 Control組、si-NC 組、si-CircBACH1 組、si-CircBACH1+antimiR-NC 組和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組細(xì)胞凋亡率（%）分別為28.96±1.37、29.12±1.41、65.69±2.17、66.78±2.25 和43.82±1.87，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=305.487，P＜0.01）；與Control組和si-NC 組相比，si-CircBACH1 組細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；與si-CircBACH1 組和si-CircBACH1+anti-miR-NC組相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p組細(xì)胞凋亡率降低（P＜0.05），見圖1。

Fig.1 Apoptosis of cells in each group detected by flow cytometry圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率

2.6 敲低CircBACH1 對細(xì)胞化療敏感性的影響 見圖2。加入硼替佐米后，Control組、si-NC組、si-CircBACH1 組、si-CircBACH1+anti-miR-NC 組和si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組細(xì)胞凋亡率（%）分別51.18±2.73、52.29±2.62、84.74±4.68、83.37±4.35和69.25±1.08，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=3，F(xiàn)=69.638，P＜0.01）；與Control 組和si-NC 組相比，si-CircBACH1 組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），敲低CircBACH1表達(dá)后細(xì)胞對硼替佐米的化療敏感性升高；與si-CircBACH1 組和si-CircBACH1+anti-miRNC 組相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p 組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），敲低CircBACH1表達(dá)的同時(shí)抑制miR-140-5p表達(dá)，細(xì)胞對硼替佐米的化療敏感性降低。

Fig.2 The apoptosis of cells in each group after adding bortezomib detected by flow cytometry圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測加入硼替佐米后各組細(xì)胞的凋亡率

2.7 敲低CircBACH1 對細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 與Control 組和si-NC 組相比，si-CircBACH1 組細(xì)胞中Bcl-2 蛋白表達(dá)降低，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與si-CircBACH1+antimiR-NC 組相比，si-CircBACH1+anti-miR-140-5p組細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)升高，Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見圖3、表4。

Fig.3 Bcl-2,Bax,cleaved caspase-3 protein expression in each group圖3 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)情況

Tab.4 Comparison of expression levels of Bcl-2,Bax,and cleaved caspase-3 between five groups of cells表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

Tab.4 Comparison of expression levels of Bcl-2,Bax,and cleaved caspase-3 between five groups of cells表4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平比較（n=3，）

組別Control組si-NC組si-CircBACH1組si-CircBACH1+antimiR-NC組si-CircBACH1+antimiR-140-5p組F Bcl-2 1.02±0.05 1.01±0.05 0.41±0.02ab 0.42±0.02 Bax 0.97±0.04 0.95±0.04 1.52±0.06ab 1.51±0.06 cleaved caspase-3 0.92±0.04 0.93±0.05 1.44±0.06ab 1.45±0.07 0.72±0.04c 1.21±0.05c 1.17±0.05c 182.49389.79167.222

2.8 CircBACH1、miR-140-5p和MDM2之間的靶向關(guān)系 ENCORI 分析結(jié)果顯示，miR-140-5p 與CircBACH1、MDM2 均存在靶向結(jié)合位點(diǎn)，見圖4。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染CircBACH1-WT 或MDM2-WT 后，共轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic 的細(xì)胞相對螢光素酶活性低于共轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic-NC 的細(xì)胞（0.42±0.03vs. 1.02±0.07，t=13.650；0.43±0.02vs. 1.00±0.07，t=19.810；n=3，P＜0.05），而轉(zhuǎn)染CircBACH1-MUT 或MDM2-MUT后，共轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic的細(xì)胞與共轉(zhuǎn)染miR-140-5p mimic-NC的細(xì)胞相對螢光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.99±0.05vs. 0.97±0.05，t=0.490；1.02±0.06vs.1.01±0.07，t=0.188；n=3，P＞0.05）。

Fig.4 Targeted binding sites between miR-140-5p and CircBACH1 and MDM2圖4 miR-140-5p與CircBACH1、MDM2之間的靶向結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

MM 是一種無法治愈的漿細(xì)胞惡性腫瘤，患者表現(xiàn)出非特異性癥狀，如疲勞、貧血和骨痛。在確診MM 時(shí)，患者一般處于腫瘤晚期，其病因難以評(píng)估，對其發(fā)病機(jī)制的深入了解非常重要［9］。目前的治療方法主要基于使用蛋白酶體抑制劑、雙膦酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑和外周血干細(xì)胞移植，但目前的治療方法對部分患者仍然無效，生存率較低［10］。CircRNA 是一類具有共價(jià)閉環(huán)結(jié)構(gòu)的非編碼RNA，已被揭示與多種腫瘤的進(jìn)展有關(guān)，包括MM［11-12］。CircPSAP 通過充當(dāng)miR-331-3p 海綿來調(diào)節(jié)組蛋白去乙?；?（HDAC4）表達(dá)來調(diào)節(jié)人MM 細(xì)胞的增殖、凋亡和對硼替佐米的敏感性［13］，CircBACH1可以通過靶向let-7a-5p 調(diào)節(jié)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白5，增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移［14］。本研究結(jié)果顯示，CircBACH1 在MM 患者的漿細(xì)胞和U266細(xì)胞中的表達(dá)高于正常對照組，表明CircBACH1 可能參與MM 的發(fā)展過程。因此，本研究進(jìn)行了CircBACH1敲低實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-CircBACH1后細(xì)胞中CircBACH1 的表達(dá)和細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞凋亡率和對硼替佐米的敏感性升高，且細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白cleaved caspase-3、Bax 表達(dá)升高，Bcl-2 表達(dá)降低，提示敲低CircBACH1 能夠抑制MM細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并提高對化療的敏感性，從而提升MM的治療效果，抑制其發(fā)展。

CircRNA可以通過充當(dāng)miRNA海綿來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而與某些miRNA 結(jié)合，影響細(xì)胞發(fā)育、凋亡、增殖和其他生物活性。circ_0058058 可以充當(dāng)miR-338-3p 的海綿上調(diào)自噬相關(guān)蛋白14（ATG14）表達(dá)以促進(jìn)MM 細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［15］。Wu等［16］研究發(fā)現(xiàn)了MM 發(fā)病機(jī)制中的miRNAs 網(wǎng)絡(luò)：miR-145-3p 通過靶向HDAC4 mRNA 起作用，從而增強(qiáng)MM 細(xì)胞自噬、凋亡以及硼替佐米的抗MM 活性。MDM2 作為一種原癌基因，可直接與腫瘤抑制因子p53 結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄活性。研究顯示，在MM過程中MDM2 過表達(dá)導(dǎo)致p53 失活和細(xì)胞凋亡減少，敲低MDM2 可以抑制MM 的惡性進(jìn)展［17-18］。本研究結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-CircBACH1組的MM 細(xì)胞中miR-140-5p 表達(dá)升高，而MDM2 表達(dá)降低；回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染anti-miR-140-5p后si-CircBACH1 對MM 細(xì)胞增殖、凋亡及化療敏感性的作用被逆轉(zhuǎn)，同時(shí)MDM2 mRNA水平升高，提示敲低CircBACH1對MM的抑制作用可能是通過上調(diào)miR-140-5p、下調(diào)MDM2 實(shí)現(xiàn)的。ENCORI 分析和螢光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，miR-140-5p mimic 顯著降低了MM 細(xì)胞中CircBACH1-WT 和MDM2-WT 的螢光素酶活性，驗(yàn)證了CircBACH1、miR-140-5p、MDM2 三者之間存在靶向關(guān)系，提示敲低CircBACH1 可能通過海綿化miR-140-5p 靶向下調(diào)MDM2 來抑制MM 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡及對化療敏感性。

綜上所述，敲低CircBACH1 可通過調(diào)控miR-140-5p/MDM2 軸來抑制MM 細(xì)胞的增殖，促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡，提高化療敏感性，為提升MM 的治療效果，降低其耐藥性提供了新生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。但目前CircBACH1 和miR-140-5p 在腫瘤發(fā)展中的研究較少，因此可進(jìn)一步探索兩者在其他腫瘤中作用及靶向調(diào)節(jié)關(guān)系。