茶黃素調(diào)節(jié)Snail/Slug信號通路對口腔鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響

孫緒高，楊文超，劉彥杰△，楊旭

口腔鱗癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是常見的頭頸部惡性腫瘤，具有易復(fù)發(fā)、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點，患者生存率低且臨床預(yù)后差，嚴(yán)重影響患者口咽部、喉部等生理功能及生命安全［1-2］。茶黃素是紅茶中的酚類成分，體內(nèi)外研究顯示其具有明顯的抗癌潛力，可抑制多種癌細(xì)胞的增殖、存活和遷移，同時促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［3］，如誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞自噬與凋亡［4］，并逆轉(zhuǎn)無機(jī)砷引起的表觀遺傳改變，從而預(yù)防皮膚侵襲性鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生［5］。因此筆者推測茶黃素可能對OSCC具有抗癌功效。Snail、Slug是調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移、黏附和侵襲［6］，下調(diào)其表達(dá)能抑制胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲、遷移、增殖、腫瘤生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［7］。臨床研究顯示，Snail、Slug 高表達(dá)與口咽鱗狀細(xì)胞癌淋巴血管浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)［8］。Snail、Slug在OSCC患者腫瘤細(xì)胞核中呈現(xiàn)陽性表達(dá)，并與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期相關(guān)［9］，由此可知Snail/Slug是OSCC的潛在治療靶點。本文基于Snail/Slug信號，探究茶黃素對OSCC細(xì)胞增殖、凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與細(xì)胞 SPF 級裸鼠購自廈門大學(xué)，生產(chǎn)許可證號：SCXK（閩）2018－0003，雄性，5 周齡左右，體質(zhì)量18～22 g，分籠飼養(yǎng)在漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院動物房中（每籠≤4 只），房內(nèi)飼養(yǎng)條件：溫度23～25 ℃，濕度55%～65%，通風(fēng)換氣8～10次/h。人OSCC細(xì)胞SCC-25購自上海澤葉生物科技有限公司。

1.2 試劑與儀器 茶黃素（純度：HPLC≥98%，貨號IT0600）、MTT試劑盒、DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Trizol、基底膠購自北京索萊寶科技有限公司；脂質(zhì)體高效轉(zhuǎn)染試劑、一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒、Annexin V 凋亡檢測試劑盒（FITC/PI 雙染法）、Snail 過表達(dá)質(zhì)粒、空載質(zhì)粒、β-actin 與Snail、Slug 引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；兔抗人Snail 抗體、β-actin 抗體、Slug 抗體以及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購自英國Abcam 公司；結(jié)晶紫染色液，兔抗人E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體、胞質(zhì)緊密粘連蛋白1（ZO-1）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）抗體均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

FK-SY96A酶標(biāo)儀購自山東方科儀器有限公司；MA6000實時熒光定量PCR（qPCR）檢測儀購自廣東正一實驗裝備有限公司；DxP Athena流式細(xì)胞儀購自青島佳鼎分析儀器有限公司；IMMOILF30 倒置生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；1658033小型電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT法檢測不同質(zhì)量濃度茶黃素處理的SCC-25細(xì)胞的存活率 取凍存SCC-25細(xì)胞，以39.5 ℃溫水浴迅速解凍，置于DMEM/F12完全培養(yǎng)基（DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%雙抗）中混勻，接種在25 mm2培養(yǎng)瓶中無菌培養(yǎng)，細(xì)胞融合率約為85%時傳代。

取96 孔培養(yǎng)板，接種傳代SCC-25 細(xì)胞，每孔約1×104個細(xì)胞，無菌培養(yǎng)36 h后分別以0、25、50、100、150、175 mg/L茶黃素［10］處理，每個處理質(zhì)量濃度6 個重復(fù)孔，并以0 mg/L 茶黃素處理細(xì)胞作為對照，并選6個不接種細(xì)胞的孔作為空白對照。24 h后加入MTT工作液，按照MTT試劑盒說明書中方法檢測各組SCC-25 細(xì)胞570 nm 波長處吸光度（A570）后計算其存活率，計算公式為：存活率=（藥物處理組A570-空白對照組A570）/（對照組A570-空白對照組A570）×100%，然后繪制各組存活率曲線并計算半數(shù)抑制濃度（IC50），選取接近IC50值的茶黃素作用濃度進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3.2 分組處理SCC-25 細(xì)胞后采集標(biāo)本 取24 孔培養(yǎng)板，接種傳代SCC-25細(xì)胞，每孔約1×105個細(xì)胞，構(gòu)建OSCC移植瘤模型。無菌培養(yǎng)36 h 后分為對照組、茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組、茶黃素高劑量+空載組、茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組。對照組不進(jìn)行任何干預(yù)，茶黃素低、高劑量組分別以100、150 mg/L茶黃素干預(yù)，茶黃素高劑量+空載組、茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組以150 mg/L茶黃素干預(yù)的同時分別以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒和Snail過表達(dá)質(zhì)粒，具體轉(zhuǎn)染步驟按照試劑說明書中方法操作，各組均干預(yù)24 h 后收集細(xì)胞沉淀，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qPCR和免疫印跡檢測各組SCC-25細(xì)胞Snail、Slug表達(dá) qPCR：取1.3.2中各組SCC-25細(xì)胞，以Trizol混勻后按照說明書提取總RNA，每組取適量總RNA 及相應(yīng)引物置于反應(yīng)預(yù)混液中混勻，按照一步法實時熒光定量PCR試劑盒說明書中方法進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增反應(yīng)，以β-actin 為內(nèi)參，所得各組Ct 值采用2-ΔΔCt算法量化Snail、Slug 的相對表達(dá)，引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

免疫印跡實驗：取1.3.2 中各組SCC-25 細(xì)胞，以RIPA 裂解液混勻后按照說明書提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度后置于100 ℃水浴中變性，每組取15 μg 蛋白通過電泳分離，并進(jìn)行電轉(zhuǎn)將其自分離膠中移到硝酸纖維素膜上。使用5%脫脂奶粉溶液封閉后將Snail、Slug、β-actin蛋白剪下孵育相應(yīng)一抗，洗滌后孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗，洗滌并以化學(xué)發(fā)光法顯色，攝取各蛋白圖像后采用Image J軟件量化其灰度值，計算各組目的蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的比值，得到其相對表達(dá)水平。

1.3.4 MTT 法和流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的增殖及凋亡 MTT 法：取96孔培養(yǎng)板，接種傳代SCC-25細(xì)胞，每孔約1×104個細(xì)胞，無菌培養(yǎng)36 h 后按照1.3.2 中步驟分組處理，24 h后以MTT法檢測各組細(xì)胞存活率，具體方法參照1.3.1。

流式細(xì)胞術(shù)：取24孔培養(yǎng)板，接種傳代SCC-25細(xì)胞，每孔約1×105個細(xì)胞，無菌培養(yǎng)36 h后按照1.3.2中步驟分組處理，24 h后收集各組細(xì)胞并以PBS洗滌、重懸，計數(shù)后每組取約2×105個細(xì)胞進(jìn)行FITC/PI 雙染，按照Annexin V 凋亡檢測試劑盒說明書操作，最后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 細(xì)胞劃痕與Transwell侵襲實驗檢測各組SCC-25細(xì)胞遷移、侵襲 細(xì)胞劃痕實驗：取24孔培養(yǎng)板，以每孔約1×105個細(xì)胞的密度接種傳代SCC-25 細(xì)胞，無菌培養(yǎng)36 h，按照1.3.2中步驟分組處理后使用無菌直尺及1 mL槍頭在每孔中央劃一條直線，洗去劃痕中細(xì)胞后于生物顯微鏡下采集各組細(xì)胞圖像并以Image J軟件定量其劃痕寬度（記為W0h），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后再次采集各組細(xì)胞圖像并定量其劃痕寬度（記為W24h），根據(jù)公式（W0h-W24h）/W0h×100%得到各組遷移率。

Transwell 侵襲實驗：取24 孔Transwell 培養(yǎng)板，每孔加入適量基底膠于4 ℃包被過夜，以PBS洗滌后備用。取24孔培養(yǎng)板，接種傳代SCC-25細(xì)胞，每孔約1×105個細(xì)胞，無菌培養(yǎng)36 h 后按照1.3.2 中步驟分組處理。24 h 后收集各組細(xì)胞沉淀，以PBS 洗滌、不含胎牛血清的DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸，計數(shù)后每組取約2×105個細(xì)胞于上述包被過的Transwell培養(yǎng)板上室中接種，同時Transwell 培養(yǎng)板下室中加適量含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后洗滌并固定下室細(xì)胞，孵育結(jié)晶紫染色液后洗滌，于生物顯微鏡下采集各組細(xì)胞圖像，并以Image J 軟件定量其細(xì)胞數(shù)量作為各組細(xì)胞侵襲數(shù)。

1.3.6 免疫印跡檢測各組SCC-25細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá) 取1.3.2 中采集的各組SCC-25 細(xì)胞，提取其中總蛋白后采用免疫印跡實驗檢測各組Bcl-2、Bax、ZO-1、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達(dá)。

1.3.7 構(gòu)建OSCC移植瘤裸鼠模型并分組處理后檢測其腫瘤體積及質(zhì)量 參考文獻(xiàn)［11］構(gòu)建OSCC 移植瘤裸鼠模型：取傳代SCC-25 細(xì)胞，以PBS 洗滌、重懸后計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度獲得1×106個/mL 的細(xì)胞懸液，于裸鼠右前腋皮下接種SCC-25 細(xì)胞懸液，每只100 μL，1 周后接種處皮下長出硬質(zhì)結(jié)節(jié)表明裸鼠模型構(gòu)建成功。按照隨機(jī)數(shù)字表法將裸鼠分為對照組、茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組、茶黃素高劑量+空載組、茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組。茶黃素低、高劑量組分別腹腔注射20、40 μg/kg茶黃素（1次/d，茶黃素溶于生理鹽水制為4、8 μg/L的溶液，均注射5 μL/g）［10］，同時于移植瘤處皮下注射生理鹽水（2次/周，注射5 μL/g）；茶黃素高劑量+空載組、茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組裸鼠腹腔注射40 μg/kg 茶黃素，同時分別于移植瘤處皮下注射空載質(zhì)粒、Snail 過表達(dá)質(zhì)粒（2 次/周，均為3 μg/g，溶于生理鹽水制為0.6 mg/L 的溶液，均注射5 μL/g）；對照組裸鼠腹腔注射生理鹽水（1次/d，生理鹽水5 μL/g），同時于移植瘤處皮下注射生理鹽水（2次/周，注射5 μL/g）。各組裸鼠均處理3周，然后頸椎脫臼處死并剪開皮膚，取出腫瘤組織塊，稱其質(zhì)量后測量其最長徑a及最短徑b，根據(jù)公式1/2×a×b2計算體積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，多組間比較進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茶黃素對人OSCC 細(xì)胞SCC-25 存活率的影響 與0 mg/L茶黃素相比，25、50、100、150、175 mg/L茶黃素均可降低SCC-25 細(xì)胞存活率（P＜0.05），且呈劑量依賴性，見圖1。本文選擇IC50值（132.50 mg/L）附近的100、150 mg/L進(jìn)行后續(xù)實驗。

Fig.1 Effects of different concentrations of ttheaflavin on survival rate of SCC-25 cells圖1 不同質(zhì)量濃度茶黃素對SCC-25細(xì)胞存活率的影響

2.2 茶黃素對SCC-25 細(xì)胞Snail、Slug 表達(dá)水平的影響 與對照組相比，茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組細(xì)胞Snail、Slug mRNA 及蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）。與茶黃素高劑量組相比，茶黃素高劑量+空載組細(xì)胞Snail、Slug mRNA 及蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組細(xì)胞Snail、Slug mRNA 及蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見圖2、表2。

Fig.2 The expression of Snail and Slug proteins in SCC-25 cells in each group detected by immunoblotting圖2 免疫印跡檢測各組SCC-25細(xì)胞Snail、Slug蛋白表達(dá)

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Snail and Slug in SCC-25 cells between the five groups表2 各組SCC-25細(xì)胞Snail、Slug相對表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.2 Comparison of relative expression levels of Snail and Slug in SCC-25 cells between the five groups表2 各組SCC-25細(xì)胞Snail、Slug相對表達(dá)水平比較（n=6，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與茶黃素低劑量組比較，c與茶黃素高劑量組比較，P＜0.05；表3—6同。

組別對照組茶黃素低劑量組茶黃素高劑量組茶黃素高劑量+空載組茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組F mRNA蛋白Snail 1.02±0.14 0.57±0.05a 0.31±0.05ab 0.33±0.07 0.98±0.16c 63.958＊＊Slug 1.00±0.13 0.63±0.07a 0.29±0.04ab 0.30±0.06 0.94±0.18c 57.763＊＊Snail 0.87±0.11 0.47±0.08a 0.11±0.02ab 0.13±0.03 0.82±0.10c 132.685＊＊Slug 0.85±0.09 0.46±0.07a 0.09±0.01ab 0.10±0.03 0.80±0.13c 129.660＊＊

2.3 茶黃素對SCC-25 細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對照組相比，茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組細(xì)胞存活率均降低，凋亡率均升高（P＜0.05）。與茶黃素高劑量組相比，茶黃素高劑量+空載組細(xì)胞存活率、凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組細(xì)胞存活率升高，凋亡率降低（P＜0.05）。見圖3、表3。

Fig.3 Apoptosis rate of SCC-25 cells in each group detected by flow cytometry圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組SCC-25細(xì)胞凋亡率

Tab.3 Comparison of survival rate and apoptosis rate of SCC-25 cells between the five groups表3 各組SCC-25細(xì)胞存活率、凋亡率比較（n=6，%，）

Tab.3 Comparison of survival rate and apoptosis rate of SCC-25 cells between the five groups表3 各組SCC-25細(xì)胞存活率、凋亡率比較（n=6，%，）

組別存活率凋亡率對照組茶黃素低劑量組茶黃素高劑量組茶黃素高劑量+空載組茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組F 100.00±14.26 61.75±6.20a 34.02±5.32ab 31.46±4.93 93.13±15.41c 57.918＊＊2.71±0.64 39.26±5.17a 64.98±7.28ab 65.17±8.13 5.05±1.28c 191.004＊＊

2.4 茶黃素對SCC-25 細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與對照組相比，茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)均降低（P＜0.05）。與茶黃素高劑量組相比，茶黃素高劑量+空載組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)升高（P＜0.05）。見表4，圖4、5。

Fig.4 Migration rate of SCC-25 cells in each group detected by cell scratch test(×200)圖4 細(xì)胞劃痕實驗檢測各組SCC-25細(xì)胞遷移率（×200）

Fig.5 Invasion number of SCC-25 cells in each group detected by Transwell invasion test(crystal violet staining,×200)圖5 Transwell侵襲實驗檢測各組SCC-25細(xì)胞侵襲數(shù)（結(jié)晶紫染色，×200）

Tab.4 Comparison of migration rate and invasion number of SCC-25 cells between the five groups表4 各組SCC-25細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)比較（n=6，）

Tab.4 Comparison of migration rate and invasion number of SCC-25 cells between the five groups表4 各組SCC-25細(xì)胞遷移率、侵襲數(shù)比較（n=6，）

組別對照組茶黃素低劑量組茶黃素高劑量組茶黃素高劑量+空載組茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組F遷移率/%83.70±12.35 52.53±6.37a 24.64±3.96ab 26.01±4.49 72.98±13.40c 52.681＊＊侵襲數(shù)/（個/視野）342.13±45.63 219.25±24.18a 94.82±9.27ab 105.12±11.34 320.56±50.26c 74.663＊＊

2.5 茶黃素對SCC-25細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對照組相比，茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05），Bax、ZO-1、E-cadherin 蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。與茶黃素高劑量組相比，茶黃素高劑量+空載組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin、Bax、ZO-1、E-cadherin 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組細(xì)胞Bcl-2、N-cadherin 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），Bax、ZO-1、E-cadherin蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），見表5、圖6。

Fig.6 ImmunoblottingresultsofexpressionofSCC-25cellapoptosis and epithelial mesenchymal transformation related proteins in each group圖6 免疫印跡檢測各組SCC-25細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)

Tab.5 Comparison of relative expression levels of SCC-25 cell apoptosis and epithelial mesenchymal transformation related proteins between the five groups表5 各組SCC-25細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（n=6，）

Tab.5 Comparison of relative expression levels of SCC-25 cell apoptosis and epithelial mesenchymal transformation related proteins between the five groups表5 各組SCC-25細(xì)胞凋亡及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白相對表達(dá)水平比較（n=6，）

組別對照組茶黃素低劑量組茶黃素高劑量組茶黃素高劑量+空載組茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組F Bax 0.08±0.01 0.46±0.08a 0.83±0.13ab 0.81±0.15 0.11±0.03c 84.340＊＊Bcl-2 0.89±0.13 0.51±0.09a 0.14±0.04ab 0.13±0.03 0.84±0.17c 71.048＊＊ZO-1 0.09±0.02 0.50±0.11a 0.95±0.14ab 0.96±0.13 0.12±0.01c 110.548＊＊E-cadherin 0.15±0.03 0.58±0.12a 1.06±0.20ab 1.03±0.23 0.18±0.04c 52.992＊＊N-cadherin 1.19±0.22 0.72±0.08a 0.21±0.05ab 0.22±0.06 1.14±0.18c 72.711＊＊

2.6 茶黃素對SCC-25 移植瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積的影響 與對照組相比，茶黃素低劑量組、茶黃素高劑量組裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積均降低（P＜0.05）。與茶黃素高劑量組相比，茶黃素高劑量+空載組裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），茶黃素高劑量+Snail 過表達(dá)組裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積升高（P＜0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of tumor mass and tumor volume of SCC-25 transplanted tumor in nude mice between the five groups表6 各組SCC-25移植瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積比較（n=10，）

Tab.6 Comparison of tumor mass and tumor volume of SCC-25 transplanted tumor in nude mice between the five groups表6 各組SCC-25移植瘤裸鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤體積比較（n=10，）

組別對照組茶黃素低劑量組茶黃素高劑量組茶黃素高劑量+空載組茶黃素高劑量+Snail過表達(dá)組F腫瘤質(zhì)量/g 0.85±0.11 0.52±0.07a 0.20±0.05ab 0.22±0.04 0.78±0.10c 148.199＊＊腫瘤體積/mm3 940.32±53.76 620.43±48.07a 314.85±28.15ab 320.94±30.36 908.89±45.12c 514.771＊＊

3 討論

OSCC 的臨床治療策略主要是手術(shù)切除輔以局部放療、全身化療等，但由于癌組織靠近上呼吸道、顱腦等重要器官，且易發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移，手術(shù)難以完全清除腫瘤組織，易于復(fù)發(fā)，患者的生存率、生活質(zhì)量和生命健康并不能達(dá)到理想預(yù)期，因此，還需探尋新型藥物以改善OSCC 的治療效果［12-14］。茶黃素是提取自紅茶的多酚類物質(zhì)，具有明顯的抗腫瘤活性，可誘導(dǎo)活性氧生成，從而導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞凋亡［15］，還可通過抑制人類乳頭瘤病毒E6 癌蛋白表達(dá)對宮頸鱗狀細(xì)胞癌起到潛在抗癌作用［16］，并可抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖和遷移［17］。本研究以25、50、100、150、175 mg/L 茶黃素處理人OSCC 細(xì)胞SCC-25，均可降低其存活率，呈劑量依賴性，表明茶黃素可抑制OSCC細(xì)胞生長，且濃度越高，其抑制作用越強(qiáng)；以不同劑量茶黃素處理SCC-25 細(xì)胞及其移植瘤裸鼠模型，可上調(diào)細(xì)胞Bax 及ZO-1、E-cadherin 蛋白表達(dá)，下調(diào)Slug 及Bcl-2、N-cadherin 蛋白表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制其增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而降低其遷移及侵襲能力；以不同劑量茶黃素處理SCC-25移植瘤裸鼠模型，可降低裸鼠腫瘤質(zhì)量及體積，提示茶黃素可抑制OSCC 細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖并促進(jìn)其凋亡，降低其遷移、侵襲能力及體內(nèi)成瘤性，發(fā)揮抗癌功效，劑量越高，功效越強(qiáng)，揭示茶黃素在OSCC 臨床治療中具有應(yīng)用前景。

上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化是啟動細(xì)胞進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，Snail/Slug 作為調(diào)控該過程的重要信號通路，參與包括乳腺癌在內(nèi)的多種癌細(xì)胞的生長、運動、轉(zhuǎn)移及侵襲，下調(diào)該通路蛋白表達(dá)可抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、生長和侵襲［18-19］。研究顯示，Snail、Slug 在OSCC 患者腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)［9］，另外Slug 在犬OSCC 組織中表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)其遷移和侵襲［20］。因此，Snail/Slug 可能成為OSCC的潛在治療靶點。本文以100、150 mg/L茶黃素處理SCC-25 細(xì)胞，均可降低其Snail 及Slug 蛋白表達(dá)，表明Snail/Slug參與茶黃素對OSCC細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲、增殖與裸鼠移植瘤體內(nèi)生長的抑制過程；以茶黃素和Snail 過表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合處理SCC-25 細(xì)胞及其裸鼠移植瘤模型，相比茶黃素單獨處理，過表達(dá)Snail 可減弱茶黃素對OSCC 細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、遷移、侵襲與增殖的抑制作用，消除茶黃素對OSCC 細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，最終逆轉(zhuǎn)茶黃素對OSCC的抗癌功效，揭示茶黃素抑制OSCC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，延緩裸鼠移植瘤的生長是通過下調(diào)Snail實現(xiàn)的。

綜上所述，茶黃素可抑制OSCC 細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、增殖、遷移、侵襲及在裸鼠移植瘤生長，并促進(jìn)其凋亡，發(fā)揮抗癌功效。