乳腺癌細胞培養(yǎng)上清液促進人脂肪間充質(zhì)干細胞遷移和增殖的機制探討

劉丹陽，王璐璐，何軍，姜楊，李永濤，張曉東，李鵬輝，沈雷△

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，其中三陰性乳腺癌（TNBC）尚無針對性的治療方案，具有高侵襲性、易復發(fā)的特點［1-2］。由細胞因子、趨化因子、干細胞和成纖維細胞等構成的腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長和轉移的基礎，探討TNBC 微環(huán)境的構成特點對遏制TNBC 的發(fā)生、發(fā)展具有重要意義。乳腺由腺泡及其周圍豐富的脂肪組織構成。人體脂肪組織含有豐富的人脂肪間充質(zhì)干細胞（hAdMSC），能夠促進乳腺癌細胞形成腫瘤球，表現(xiàn)出較好的腫瘤趨向性，但其機制尚不明確［3］。干細胞既有抗腫瘤價值，也具有潛在的致癌風險［4］。源自前列腺癌細胞Du145的外泌體可促進骨髓間充質(zhì)干細胞分化為肌成纖維細胞，并提高肌成纖維細胞的增殖和侵襲能力［5］。局部組織環(huán)境內(nèi)的干細胞、血管內(nèi)皮細胞能夠向趨化因子濃度高的地方遷移［6］。白細胞介素（IL）-8 與膀胱癌、卵巢癌、結腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生、轉移及復發(fā)密切相關［7］。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關巨噬細胞表達IL-8，促進乳腺癌轉移，IL-8 表達水平與肝癌細胞惡性程度呈正相關［8-9］。IL-8 等趨化因子和間充質(zhì)干細胞在構成腫瘤微環(huán)境、調(diào)控腫瘤生長或轉移中均發(fā)揮關鍵作用。目前，TNBC腫瘤細胞招募hAdMSC到腫瘤微環(huán)境并影響腫瘤進展的分子機制尚不明確。MDA-MB-231細胞是TNBC代表性細胞［10］。本實驗以MDA-MB-231 細胞培養(yǎng)上清液刺激hAdMSC，觀察趨化因子受體1/2（CXCR1/2）-Akt-mTOR信號軸對hAdMSC遷移、增殖及凋亡的影響，為遏制TNBC發(fā)生、發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料 MDA-MB-231細胞購自美國細胞培養(yǎng)物收藏中心（ATCC），hAdMSC 購自廣州賽業(yè)生物科技有限公司。胎牛血清購自美國Gibco 公司。Leibovitz's L-15 和RPMI-1640 培養(yǎng)基均購自美國Hyclone 公司。蛋白激酶B（Akt）抑制劑GSK690693 購自美國Selleck 公司，Reparixin（CXCR1/2抑制劑）購自美國Med Chem Express 公司。CCK-8試劑購自日本Dojindo 公司。聚偏二氟乙烯膜（PVDF）、BCA 蛋白檢測試劑盒和Annexin V-FITC/PI 雙標記流式細胞凋亡試劑盒購自上海碧云天生物科技公司。兔抗人哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）抗體、兔抗人Akt 和磷酸化Akt（p-Akt）抗體、兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗兔IgG二抗購自英國Abcam 公司。SpectraMax iD3 酶標儀購自美國Molecular Devices公司；Tanon 6200型發(fā)光成像儀購自上海天能公司；FACSAriaⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；IX53倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 細胞培養(yǎng) MDA-MB-231 細胞用含10%胎牛血清的Leibovitz's L-15 培養(yǎng)基培養(yǎng)。hAdMSC 用含10%胎牛血清、100 mg/L 鏈霉素與100 U/mL 青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。2 種細胞均采用對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞進行實驗，實驗期間細胞均沒有出現(xiàn)污染或衰老等現(xiàn)象。

1.3 實驗方法

1.3.1 hAdMSC 培養(yǎng)與分組 將5.5×106個MDA-MB-231 細胞37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h 后吸出細胞培養(yǎng)上清液，800 r/min離心5 min 后提取上清液，針筒式濾器抽濾，于-80 ℃保存待用。將MDA-MB-231細胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基以1∶4的體積比混勻后培養(yǎng)的hAdMSC為MDAMB-231上清液組。向MDA-MB-231上清液組添加10 μmol/L Reparixin 為CXCR1/2 抑制劑組；向MDA-MB-231 上清液組添加10 nmol/L GSK690693 為Akt 抑制劑組。無任何刺激進行培養(yǎng)的hAdMSC為對照組。

1.3.2 細胞劃痕實驗檢測各組hAdMSC的遷移能力 將3.5×105個/孔hAdMSC 接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。無菌200 μL 移液器吸頭進行劃痕。0.05 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3 次，每次1 min。根據(jù)hAdMSC 實驗分組添加相應試劑，37 ℃、5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。IX53 倒置顯微鏡拍攝0 h、24 h及48 h的劃痕圖像，實驗重復3次。Image J 1.8.0圖像軟件測量細胞劃痕閉合面積。

1.3.3 CCK-8實驗檢測各組hAdMSC增殖情況 將hAdMSC以5×103個/孔接種到96 孔細胞培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，實驗重復3次。SpectraMax iD3酶標儀于450 nm波長處檢測各組樣品吸光度（A450）值［11］，A450值代表細胞增殖水平。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI 雙標記流式細胞凋亡實驗檢測各組hAdMSC 的凋亡率 以0.25%胰酶消化各組hAdMSC。1 000 r/min離心5 min，棄上清液；冰浴下，195 μL Annexin VFITC結合液重懸細胞，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）室溫避光孵育20 min，實驗重復3次。FACSAriaⅡ流式細胞儀測定各組細胞凋亡率。

1.3.5 Western blot 檢測各組hAdMSC 的mTOR/p-mTOR 和Akt/p-Akt 蛋白表達 將4.5×106個/孔hAdMSC 于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)12 h。4 ℃下RIPA 裂解液裂解各組hAdMSC，12 000 r/min 離心60 min。BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定各組細胞裂解液蛋白濃度。80 V電泳30 min；120 V電泳45 min。75 V 轉膜120 min 到PVDF 膜。5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜120 min。分別添加兔抗人p-mTOR 抗體（1∶600）、mTOR 抗體（1∶550）、p-Akt 抗體（1∶500）、Akt 抗體（1∶350）和GAPDH抗體（1∶1 000），4 ℃孵育16 h。HRP 標記山羊抗兔IgG（1∶500）4 ℃孵育2 h。發(fā)光成像儀顯影曝光，各實驗重復3 次。Image J 1.8.0圖像分析軟件計算各蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Tukey-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組hAdMSC 遷移能力比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組24 h 和48 h 細胞劃痕閉合面積增加（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2 抑制劑組hAdMSC 的48 h細胞劃痕閉合面積減少（P＜0.05），見表1、圖1。

Fig.1 Typical images of hAdMSC cell scratches in each group（Scale bar=100 μm）圖1 各組hAdMSC細胞劃痕的典型圖像（標尺=100 μm）

Tab.1 Comparison of cell scratch closure area of hAdMSC between the four groups表1 各組hAdMSC的細胞劃痕閉合面積比較（n=3，×104μm2，）

Tab.1 Comparison of cell scratch closure area of hAdMSC between the four groups表1 各組hAdMSC的細胞劃痕閉合面積比較（n=3，×104μm2，）

＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與MDA-MB-231 上清液組比較，P＜0.05；表2同。

組別對照組MDA-MB-231上清液組Akt抑制劑組CXCR1/2抑制劑組F 24 h 6.57±1.05 39.54±1.98a 35.93±0.48 37.68±0.95 318.300＊＊48 h 20.53±0.69 61.19±0.21a 43.00±0.26b 45.23±0.32b 3 240.000＊＊

2.2 各組hAdMSC 增殖情況比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 的增殖水平升高（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2抑制劑組hAdMSC的增殖水平均降低（P＜0.05），見圖2。

Fig.2 Histogram of hAdMSC A450 in each group圖2 各組hAdMSC的A450比較柱狀圖

2.3 各組hAdMSC 凋亡率比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 凋亡率降低（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2抑制劑組hAdMSC凋亡率均增加（P＜0.05），見圖3、4。

Fig.3 Histogram of hAdMSC apoptosis rate in each group圖3 各組hAdMSC凋亡率比較的柱狀圖

Fig.4 Typical images of hAdMSC apoptosis rate detected by Annexin V-FITC/PI double labeled flow cytometry圖4 Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞凋亡實驗檢測各組hAdMSC凋亡率的典型圖像

2.4 各組Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR蛋白表達比較 與對照組比較，MDA-MB-231 上清液組p-Akt和p-mTOR 蛋白相對表達量均增加（P＜0.05）；與MDA-MB-231 上清液組比較，Akt 抑制劑組和CXCR1/2 抑制劑組hAdMSC 的p-Akt 和p-mTOR 蛋白相對表達量均降低（P＜0.05），見圖5、表2。

Fig.5 MDA-MB-231 supernatant promoted expression levels of p-Akt and p-mTOR proteins in hAdMSC圖5 MDA-MB-231上清液促進hAdMSC表達p-Akt和p-mTOR蛋白

Tab.2 Comparison of the relative expression levels of Akt,p-Akt,mTOR and p-mTOR hAdMSC between the four groups表2 各組hAdMSC的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（n=3，）

Tab.2 Comparison of the relative expression levels of Akt,p-Akt,mTOR and p-mTOR hAdMSC between the four groups表2 各組hAdMSC的Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白相對表達量比較（n=3，）

組別對照組MDA-MB-231上清液組Akt抑制劑組CXCR1/2抑制劑組F Akt 1.11±0.06 1.12±0.01 p-Akt 0.43±0.02 1.03±0.03a mTOR 1.06±0.09 1.10±0.04 p-mTOR 0.59±0.05 0.94±0.02a 1.02±0.05 1.09±0.01 2.622 0.48±0.03b 0.77±0.04b 144.000＊＊1.03±0.02 0.95±0.03 2.890 0.71±0.03b 0.73±0.02b 86.400＊＊

3 討論

具有多向分化特性的間充質(zhì)干細胞遷移到腫瘤部位可分化為腫瘤相關成纖維細胞（CAF），從而促進腫瘤發(fā)展及轉移［12-13］。干擾間充質(zhì)干細胞歸巢到腫瘤微環(huán)境可抑制乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。IL-8 能夠與細胞膜表面的CXCR1/2 受體結合，發(fā)揮促進血管生成、腫瘤干細胞存活等促腫瘤生長功能［14］。Fernando 等［15］發(fā)現(xiàn)，MCF-7、T47D、BT474、MDAMB-231和MDA-MB-436等多種乳腺癌細胞系高表達IL-8，可誘導腫瘤微環(huán)境的細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉化（EMT）而促進腫瘤進展。Alraouji 等［16］發(fā)現(xiàn)，TNBC 細胞分泌高水平IL-8，活化血管內(nèi)皮細胞IL-8/信號轉導子和轉錄激活子3（STAT3）-核因子κB（NF-κB）通路，促進腫瘤組織血管生成并有利于TNBC 細胞的生長和轉移。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231 上清液組hAdMSC 的24 h、48 h 細胞劃痕閉合面積較對照組增加，而CXCR1/2 抑制劑組和Akt 抑制劑組hAdMSC 的48 h 細胞劃痕閉合面積較MDA-MB-231上清液組減小，表明MDA-MB-231培養(yǎng)上清液可激活hAdMSC 的Akt-mTOR 信號通路，促進hAdMSC 遷移，從而促進hAdMSC 歸巢到乳腺癌微環(huán)境?？紤]其可能原因為不斷生長的MDAMB-231 細胞高表達IL-8，活化Akt 信號通路，從而促進細胞微管或微絲收縮形成偽足，引起細胞定向遷移［17］。

Morein等［18］認為，IL-6、IL-8等趨化因子在乳腺癌等惡性腫瘤中高表達，具有促癌作用，能降解細胞外基質(zhì)、促進間充質(zhì)干細胞歸巢和腫瘤血管生成。Jin等［19］發(fā)現(xiàn)，MDA-MB-231細胞的培養(yǎng)上清液富含IL-8、腫瘤壞死因子等趨化因子和細胞因子，可誘導成纖維細胞分化為CAF，促進TNBC 細胞遷移和增殖，降低腫瘤細胞凋亡，是腫瘤轉移的關鍵步驟。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231上清液組較對照組hAdMSC 的增殖水平升高，細胞凋亡率降低，Akt 抑制劑組或CXCR1/2 抑制劑組較MDA-MB-231 上清液組上述指標均呈相反變化，表明MDA-MB-231細胞上清液中的IL-8 可激活Akt 信號通路，具有促進hAdMSC 增殖，減少hAdMSC 凋亡的能力，提示抑制IL-8表達或阻斷CXCR1/2可成為靶向抗TNBC的潛在療法。考慮原因為MDA-MB-231 細胞上清液中高表達的IL-8、CC 趨化因子配體2（CCL2）和CCL5等促癌趨化因子可縮短hAdMSC 細胞周期，促進hAdMSC 增殖［15，18］。另有一些研究認為，IL-8 與hAdMSC 表面的CXCR1/2 結合，通過激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT-mTOR 信號通路，誘導腫瘤微環(huán)境的細胞發(fā)生EMT 表型變化，從而促進TNBC血管生成、腫瘤細胞生長并加速其侵襲過程［20-21］。Habanjar等［22］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞分泌大量IL-8、IL-6、粒細胞集落刺激因子等細胞因子或趨化因子，這些因子間相互影響形成疊加效應，通過酪氨酸激酶（JAK）/信號轉導子和轉錄激活子（STAT）、PI3K、Akt、mTOR、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和NF-κB等諸多信號通路來增加腫瘤細胞與其微環(huán)境細胞的相互作用，共同維持癌細胞增殖和存活，減少腫瘤細胞凋亡。本研究結果亦顯示，MDA-MB-231上清液組較對照組hAdMSC 的p-Akt 和p-mTOR 蛋白表達均升高，而Akt 抑制劑組或CXCR1/2 抑制劑組較MDA-MB-231上清液組上述指標均呈相反變化，表明MDA-MB-231細胞上清液可激活Akt及其下游的mTOR信號通路。

綜上所述，MDA-MB-231 細胞上清液通過激活Akt-mTOR信號通路，促進hAdMSC的增殖和歸巢到腫瘤微環(huán)境，這其中IL-8-CXCR1/2 軸在促進TNBC腫瘤細胞生長和侵襲中可能起關鍵作用。