超聲輔助處理對發(fā)酵鮐魚酶解液風味品質的影響

郭正暢，劉智禹，方旭波,3，陳小娥,*，周小敏，李 真，馬宇喬，陳 貝，高瀟楠，楊會成

（1.浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022；2.福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013；3.浙江國際海運職業(yè)技術學院，浙江 舟山 316021；4.浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316000，5.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021）

鮐魚（Pneumatophorus japonicus）又名青占魚、鯖魚，具有分布廣、產量高等特點[1]，為我國近海主要捕撈的中上層魚類[2]。目前鮐魚主要以鮮食為主，除了少部分用于低值魚粉加工外，精深加工程度嚴重不足，其銷售價格低廉，對經濟效益產生了負面影響[3]。對鮐魚進行深加工、提高其產品附加值是目前亟需解決的一個問題。研究表明，鮐魚的蛋白質含量很高，富含鈣、磷、鐵等微量元素，是優(yōu)質的水產蛋白來源，而酶水解法是促進魚類蛋白高值化利用的有效途徑[4]，但魚類酶解液存在腥味重、氣味不協(xié)調等缺點[5]，限制了其在食品工業(yè)中的應用。

產香菌可以產生多種芳香化合物及特別的風味物質，有助于改善發(fā)酵產品的總體風味[6]。利用產香菌改善魚蛋白酶解液風味品質，制備新型海鮮調味基料，提高水產品附加值已成為近年來的研究熱點。湯玉潔等[7]在金槍魚碎肉酶解液中加入植物乳桿菌進行發(fā)酵后，乙醛等腥味化合物含量降低，風味得到改善。本課題組前期利用長孢洛德酵母對遠東擬沙丁魚酶解液進行增香發(fā)酵處理，結果表明，發(fā)酵后酶解液腥味降低，鮮味氨基酸和揮發(fā)性風味物質等含量明顯增加[8]。

另一方面，低頻超聲技術（16～100 kHz）在發(fā)酵食品中的應用近來也逐漸受到關注，相關研究工作主要集中在酒、醋、醬油和果蔬汁等產品上，研究表明，低頻超聲產生穩(wěn)定的、溫和的空化效應[9]，可以促進發(fā)酵液中的微生物代謝、縮短發(fā)酵時間、改善發(fā)酵食品的風味品質[10]。舒杰等[11]發(fā)現(xiàn)超聲處理可以對黃酒產生催陳效果。張媛淵等[12]發(fā)現(xiàn)，與未處理的食醋相比較，經超聲波催陳后的新醋色澤棕紅、口感良好、醋香較溫和、酯香味更加濃郁。Gao Xianli等[13]同樣發(fā)現(xiàn)，經超聲處理后大豆醬油的風味物質含量明顯提高，口感更加和諧。鑒于此，將超聲波技術與酵母菌產香發(fā)酵技術相結合并應用于魚蛋白酶解液的增香發(fā)酵中，推測不僅可以使魚蛋白酶解液的發(fā)酵時間縮短，還可以改善產物的風味品質。然而，國內外關于這方面的應用研究鮮有報道，故值得深入研究。

本研究以鮐魚蛋白酶解液為基質，利用超聲波輔助長孢洛德酵母菌發(fā)酵增香，研究超聲波技術對鮐魚酶解液發(fā)酵過程中菌落數、氨基酸態(tài)氮含量、感官評分的影響，并通過主成分分析（principal component analysis，PCA）判別發(fā)酵過程中超聲與未超聲條件下產物風味的差異，旨在探明在不同發(fā)酵階段發(fā)酵鮐魚酶解液經超聲處理后風味品質的變化情況。同時，本研究還對發(fā)酵產物進行游離氨基酸組成分析和必需氨基酸營養(yǎng)評價，并采用氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）技術分析發(fā)酵產物中香氣物質差異，以期為超聲波技術在新型海鮮調味料的應用研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮐魚購自舟山市海利遠洋漁業(yè)有限公司，平均體長15～25 cm，-20 ℃冰箱冷凍保存。

長孢洛德酵母由浙江海洋大學水產食品化學實驗室保存。

動物蛋白水解酶（1×105U/g）南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SPX-250 B-Z型生化培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；PEN 3電子鼻便攜式系統(tǒng)德國Airsense公司；全自動氨基酸分析儀 美國Pickering公司；FlavourSpec?風味分析儀 德國GAS公司；超聲處理儀上?？茖С晝x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取斜面培養(yǎng)基上保存的長孢洛德酵母接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃的條件下培養(yǎng)72 h，作為活化的種子液備用[14]。

1.3.2 鮐魚蛋白酶解液的制備

將流水解凍后的鮐魚攪碎[15]，鮐魚蛋白酶解液的制備參照劉溫等[16]的方法并作修改，按照料液比1∶2加入蒸餾水，體系中動物蛋白水解酶添加量為4 000 U/g，加酶后的樣品置于55 ℃酶解罐中酶解6.5 h，反應結束后滅酶（90 ℃水浴20 min）20 min，冷卻至室溫進行離心（5 000 r/min、10 min），取上清液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.3 發(fā)酵體系的建立

根據前期的預實驗結果，鮐魚蛋白酶解液滅菌后進行發(fā)酵培養(yǎng)，酶解液接種體積分數1%的種子液，35 ℃的條件下進行靜態(tài)發(fā)酵[17]，在接種發(fā)酵后的0、3、6、9、12、15 d對發(fā)酵液進行超聲輔助處理（40 ℃、120 W、10 min），并在超聲處理后取樣，取樣后樣品繼續(xù)發(fā)酵。同時以相同條件下發(fā)酵且未作超聲處理的發(fā)酵液作為對照組，測定相關指標。超聲過程中控制超聲機內槽液面始終高于鮐魚蛋白酶解液液面。

1.3.4 菌落數測定

采用平板菌落計數法測定發(fā)酵液中的長孢洛德酵母菌數量，結果以lg（CFU/mL）表示。

1.3.5 氨基酸態(tài)氮含量測定

參照陳啟航等[18]的報道采用甲醛滴定法測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.6 電子鼻分析

參考鄺格靈等[19]的方法，在燒杯中加入1/3體積的發(fā)酵液，用保鮮膜封口，靜置15 min后進行檢測。測定時間98 s，載氣流速和進樣流速均設置為200 mL/min。通過PEN 3電子鼻的WinMuster軟件對采集到的樣品氣味信息進行PCA。

1.3.7 感官評價

感官評價根據陳啟航等[20]的方法并進行修改，由10 名經過專業(yè)培訓的感官評定人員組成品評小組，進行感官評價。每組發(fā)酵液分別量取50 mL并隨機編號，每組做3 個平行，采用先聞后嘗的方式，按照表1所示評分標準[21]進行打分并記錄結果。

表1 鮐魚發(fā)酵液感官質量評定標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of fermented mackerel enzymatic hydrolysate

1.3.8 游離氨基酸含量的測定及營養(yǎng)評價

取發(fā)酵12 d超聲處理組樣品，以未超聲處理組樣品為對照，參照衛(wèi)陽飛等[22]的方法并稍作修改測定游離氨基酸含量，取1 mL樣品置于50 mL離心管中，加入三氯乙酸（終質量分數5%）進行離心（4 ℃、15 000 r/min、30 min），用濾膜（0.22 μm）過濾離心后的上清液，放入氨基酸自動分析儀樣品盒中上機測定。參照楊超等[23]的方法，對發(fā)酵產物的氨基酸評分（amino acids score，AAS）、化學評分（chemical score，CS）及必需氨基酸指數（essential amino acids index，EAAI）計算。

1.3.9 GC-IMS分析風味變化

取發(fā)酵12 d的超聲處理組樣品，以未超聲處理組樣品為對照，使用FlavourSpec?風味分析儀檢測和分析揮發(fā)性風味物質，每個實驗重復3 次。參照趙玲等[24]的方法并略作修改，分別量取1 mL發(fā)酵液于20 mL的頂空瓶中，密封，然后將樣品在40 ℃下孵育20 min，孵育轉速500 r/min。采用頂空自動進樣的方式將500 μL的樣品注入進樣器中，進行檢測。

檢測條件：色譜柱為FS-SE-54-CB-1 型（15 m×0.53 mm）；載氣：高純N2（純度≥99.999%）；柱溫：60 ℃；分析時間：30 min；初始流速為2 mL/min，保持2 min，在2～10 min內線性上升至10 mL/min，10～20 min內線性上升至100 mL/min，20～30 min內線性上升至150 mL/min，電離源為β射線（氚3H），漂移氣為高純N2（純度≥99.999%），溫度45 ℃，流速150 mL/min，正離子模式。

1.4 數據處理與分析

應用Origin 2021軟件繪圖，使用SPSS 18.0軟件對實驗數據進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著；電子鼻數據采用自帶軟件分析；GC-IMS測定結果通過比對NIST、IMS數據庫進行定性分析，然后采用GalleryPlot功能繪制樣品的揮發(fā)性成分譜圖。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助處理對鮐魚蛋白酶解液發(fā)酵過程中菌落數的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液的菌落數呈上升趨勢，發(fā)酵到第12天時進入穩(wěn)定期。此時，超聲處理組菌落數為8.90（lg（CFU/mL）），顯著高于對照組（8.50（lg（CFU/mL）））（P＜0.05）。從趨勢上看，在整個發(fā)酵過程中，超聲處理組菌落數均高于未超聲處理組，這與Huang Guoping等[25]的研究結果相似，表明在適當的超聲強度下，長孢洛德酵母的生長速率得到提高。這一現(xiàn)象可能是因為超聲波產生的空化效應提高了長孢洛德酵母細胞膜的通透性，加快了其新陳代謝的速率，從而促進其生長繁殖[9]。

圖1 超聲處理對鮐魚酶解液發(fā)酵過程中菌落數的影響Fig.1 Effect of ultrasound on total bacterial count during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2 超聲輔助處理對鮐魚蛋白酶解液發(fā)酵過程中風味品質的影響

2.2.1 超聲輔助處理對鮐魚蛋白酶解液氨基酸態(tài)氮含量的影響

氨基酸態(tài)氮含量是考察發(fā)酵液營養(yǎng)價值的一項重要指標[26]，由圖2可知，發(fā)酵過程中，各組氨基酸態(tài)氮含量均有所提高；直至發(fā)酵第12天，超聲處理組氨基酸態(tài)氮含量升至0.78 g/100 g，此后增勢趨于平緩，與第15天相比無顯著差異（P＞0.05）。整個發(fā)酵過程中，超聲處理組樣品的氨基酸態(tài)氮含量均大于未超聲組，原因可能是超聲處理促進了長孢洛德酵母的生長繁殖，使其在釋放香氣物質的同時產生了少量的氨肽酶，促進了酶解液蛋白的水解，有利于更好地利用鮐魚原料蛋白。

圖2 超聲處理對鮐魚酶解液發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of ultrasound on the content of amino acid nitrogen during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2.2 超聲輔助處理對鮐魚蛋白酶解液感官品質的影響

為確保產品被消費者接受，通常采用感官分析來評價食物的特性（質地、味道、外觀以及氣味等）[27]。由圖3可知，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液的感官評分不斷升高，12 d時達到最大值，之后略有下降。與未超聲處理組樣品相比，超聲處理組樣品鮮香味更加濃郁，伴有果香味，而腥臭味幾乎察覺不到，其感官評分在發(fā)酵期間均顯著高于未超聲處理組（P＜0.05），風味更容易被人們接受，這與劉二蒙[28]的研究結果一致。

圖3 超聲處理對鮐魚酶解液發(fā)酵過程中感官評分的影響Fig.3 Effect of ultrasonic on sensory evaluation score during the fermentation of mackerel enzymatic hydrolysate

2.2.3 電子鼻分析

由圖4可知，主成分（principal component，PC）1和PC2的貢獻率分別為97.69%和1.64%，總貢獻率為99.33%，說明電子鼻PCA可以達到較好的區(qū)分效果，這與劉麗麗等[29]的研究結果相似。除發(fā)酵0 d外，超聲處理組和未超聲處理組隨發(fā)酵時間的延長均得到了較好的分離，且發(fā)酵12 d 的超聲處理組樣品在PC1方向上與發(fā)酵0 d的超聲處理組樣品差距達到最大。在相同發(fā)酵時間下，超聲處理組樣品在PC1方向上與0 d樣品的差距均大于未超聲組。

圖4 發(fā)酵過程中不同處理方式下發(fā)酵產物的PCA圖Fig.4 PCA plot of fermented products with different treatments during fermentation

綜合圖2和圖3可知，長孢洛德酵母輔助鮐魚酶解液發(fā)酵的最適時間為12 d，且超聲輔助處理對發(fā)酵液的風味品質有重要影響。

2.3 發(fā)酵產物中游離氨基酸組成分析及相關營養(yǎng)評價

發(fā)酵12 d后，超聲處理組與未超聲處理組中游離氨基酸酸含量如表2所示，兩組樣品中均檢出17 種游離氨基酸，且組成成分相同，但含量存在顯著差異。未超聲處理組中游離氨基酸總量為4.984 g/100 g，而超聲處理組中游離氨基酸總量則達到6.373 g/100 g，增加了27.87%。其中，鮮味氨基酸Ala、Glu與His、Tyr、Cys-s等具有抗氧化能力的氨基酸含量明顯增加，這幾種氨基酸有可能是超聲輔助處理改善發(fā)酵液風味品質的重要因子。

表2 發(fā)酵產物中游離氨基酸組成分析及相關營養(yǎng)評價Table 2 Analysis of free amino acid composition in fermented products

AAS和CS是兩項評價食品營養(yǎng)價值的指標。由表3可知，當以AAS為評分標準時，超聲處理組的鮐魚發(fā)酵液中苯丙氨酸＋酪氨酸評分最高，蘇氨酸評分最低。以CS為評分標準時，超聲處理組的鮐魚發(fā)酵液中評分最高和最低的分別是苯丙氨酸＋酪氨酸和蛋氨酸。EAAI常用來評價蛋白質的營養(yǎng)價值[30]，鮐魚發(fā)酵液的EAAI為82.90，表明其營養(yǎng)價值較高，可以作為理想的海鮮調味基料。

表3 發(fā)酵產物中必需氨基酸營養(yǎng)評價Table 3 Nutritional evaluation of essential amino acids in fermented products

2.4 超聲對發(fā)酵過程中揮發(fā)性香味物質動態(tài)變化分析

發(fā)酵12 d后，超聲處理組和未超聲處理組樣品中揮發(fā)性化合物的GC-IMS圖譜如圖5所示，橫坐標1.0處紅色豎線為經歸一化處理后的反應離子峰（reactive ion peak，RIP），RIP兩側的每一個點代表一種揮發(fā)性有機物。根據色點的有無或者顏色深淺可以直觀地看出物質濃度的高低，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深濃度越高[31]。從圖5中可以看出，不同樣本中的特征揮發(fā)性組分可以通過GC-IMS技術得到很好的分離，超聲處理組與未超聲處理組具有不同GC-IMS的特征譜信息，超聲處理組中紅點數量多于未超聲處理組，如圖中圓圈標注的位置，兩者之間存在著明顯的差異。

圖5 超聲處理組（A）與未超聲處理組（B）中揮發(fā)性化合物的GC-IMS圖譜Fig.5 GC-IMS spectra of volatile compounds in ultrasonic (A) and control (B) treatment groups

將兩組揮發(fā)性化合物的保留時間和遷移時間與GC-IMS自帶軟件Library Search中現(xiàn)有的NIST 2014氣相色譜保留指數數據庫和G.A.S.的IMS遷移時間數據庫進行比對，最終分析出48 種揮發(fā)性化合物，主要包括醛類12 種、醇類9 種、酮類13 種、雜環(huán)類8 種、芳香類及其他化合物6 種（表4）。

表4 酶解液GC-IMS測定結果Table 4 GC-IMS results of enzyme digests

為進一步研究超聲對發(fā)酵液揮發(fā)性化合物的影響，通過LAV軟件對經超聲處理和未經超聲處理的發(fā)酵液（發(fā)酵12 d）揮發(fā)性化合物進行三維對比，每個實驗重復3 次，形成樣品指紋圖譜，如圖6所示。圖6中每一行代表一個樣品中選取的全部信號峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機物在不同樣品中的信號峰，從圖中可以直觀地比較出每種樣品之間揮發(fā)性有機物的差異，亮點的深淺表示化合物含量的高低。A、B區(qū)的物質是未超聲處理組樣品中的特征風味物質，包括2,5-二甲基吡嗪、甲二磺醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-丁醇、二甲基二硫醚、噻吩等；C區(qū)代表超聲處理組樣品中的特征風味物質，包括1-丙醇、1-丁醇、1-辛醇、2-庚基呋喃、2-丁基呋喃、異戊酸乙酯等。與對照組相比，超聲處理組中酯類、酮類、醇類物質含量有所增加，醇類通常具有植物香、芳香氣味，適量的酮類貢獻甜的花香和果香味。以上結果表明，超聲輔助處理可以促進鮐魚酶解液的發(fā)酵進程，加速其香味物質的形成，提高香氣質量。

圖6 超聲與未超聲處理組GC-IMS指紋圖譜Fig.6 GC-IMS fingerprints of ultrasonic and non-ultrasonic treatment groups

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵法可以作為一種綠色的發(fā)酵技術，能夠有效改善水產品風味[32]?，F(xiàn)階段采用的發(fā)酵菌種主要為酵母菌，它們中大部分為能夠產生芳香類化合物的風味菌，有利于促進發(fā)酵食品風味的形成，提高其風味品質[33]。朱文慧等[34]將耐鹽酵母接種于鱈魚骨酶解液中，結果顯示，發(fā)酵后的魚骨酶解液香氣活性化合物含量明顯增加。李學偉等[35]發(fā)現(xiàn)在醬油發(fā)酵生產過程中添加耐鹽酵母后，其產物醬酯香和醇香更加濃郁，風味改善明顯。本研究將超聲波技術與酵母菌產香發(fā)酵技術相結合，利用超聲波技術對鮐魚酶解液促進發(fā)酵增香，改善了發(fā)酵液的風味品質。

另有研究發(fā)現(xiàn)超聲輔助處理能夠加快發(fā)酵食品的成熟，促進微生物增長繁殖、提高其代謝性能，使發(fā)酵產物的風味品質得到進一步的提高，如Yu Zhou等[36]研究發(fā)現(xiàn)超聲處理對食品的發(fā)酵和熟化有促進作用，超聲處理后的發(fā)酵食品質地、顏色、風味和口感等感官屬性均得到改善。孟祥勇等[37]同樣發(fā)現(xiàn)，經超聲處理的黃酒醪液，發(fā)酵時間縮短，其風味物質含量明顯提高，口感更加和諧。本研究利用超聲技術輔助鮐魚酶解液發(fā)酵增香。結果表明，在同一發(fā)酵時間下，超聲處理組中的菌落數、氨基酸態(tài)氮含量和感官評分均大于未超聲處理組。這可能是由于低頻超聲波能產生穩(wěn)定且較溫和的空化效應對菌體細胞造成可修復的損傷，增加了細胞膜的通透性，加速細胞內外物質的傳輸，提高了新陳代謝速率。此外，超聲波還可以將微生物在培養(yǎng)過程中形成的細胞束松散開來，提高菌體對營養(yǎng)物質的利用率，促進了菌體的生長繁殖和代謝，提高了微生物的生物量，從而改善了發(fā)酵液的風味品質。這與汪雨晨等[38]的研究結果相似。

GC-IMS是食品中揮發(fā)性化合物分離和定量的常用方法，因具有強分離能力、高靈敏度、快速響應、二維分離和痕量分析等特點[39]而備受關注。江津津等[40]采用GC-IMS技術對不同產地的海蝦醬進行風味分析，發(fā)現(xiàn)不同蝦醬的揮發(fā)性成分種類和含量差異顯著，2-乙基己醇、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、二甲胺、二甲基三硫和3-甲硫基丙醛等化合物是海蝦醬的特征揮發(fā)性化合物。石月等[41]通過GC-IMS對魚骨泥及酶解液進行風味分析，共檢測出29 種風味物質。魚骨泥中主要揮發(fā)性風味物質是醛類和酮類，而酶解液中主要呈味物質為酮類和酯類，揮發(fā)性風味物質的種類及含量差異明顯。本研究在兩組發(fā)酵液中共檢測出48 種風味物質。其中，未經超聲處理組的發(fā)酵液醛類物質閾值較低，這是發(fā)酵液在發(fā)酵過程中脂質氧化造成的[42]。一般來說，飽和直鏈醛具有令人不愉快的氣味，容易給發(fā)酵液的風味造成負面影響。相比之下，經超聲輔助處理組的發(fā)酵液醛類物質閾值升高，發(fā)酵產物中醇類、酮類、酯類物質種類明顯增加，說明超聲處理能提高酶解液脂質抗氧化能力，這與Meng Xiangyong等[43]的研究結果一致。

發(fā)酵產物中的游離氨基酸對鮮味有很大的貢獻，可以與其他組成成分相互作用改善產物的風味，也是評價發(fā)酵產物的重要營養(yǎng)指標[44]。發(fā)酵12 d后,與未超聲處理組相比，超聲處理組的發(fā)酵產物中游離氨基酸總量增多，鮮味氨基酸Ala、Glu含量也明顯增加，使得發(fā)酵產物的鮮味更加醇厚，品質得到了明顯的提升。另外，一些具有抗氧化能力的氨基酸如His、Tyr、Cys-s等含量均有明顯的提高，有利于抑制發(fā)酵過程中油脂的氧化，提高發(fā)酵液的風味。

綜上所述，經超聲處理的鮐魚酶解液發(fā)酵產物香味濃郁、營養(yǎng)價值較高，可作為海鮮調味品的基料使用，有利于大幅度提高鮐魚酶解液的附加值。

4 結論

本研究通過考察菌落數、氨基酸態(tài)氮含量、感官評價、電子鼻信息PCA結果、游離氨基酸含量以及GC-IMS等指標，探究了超聲技術對發(fā)酵產物風味品質的影響。結果表明，在發(fā)酵過程中，同一發(fā)酵時間下，超聲處理組發(fā)酵產物的菌落數、感官評分與氨基酸態(tài)氮含量均高于未超聲處理組，且鮮香味濃郁、風味品質較好。經12 d發(fā)酵后，超聲處理組中發(fā)酵產物的EAAI為82.90，營養(yǎng)品質較高。GC-IMS分析結果表明，與未超聲處理組相比，超聲處理組中不飽和醇類、酮類等香氣活性物質含量提高，而飽和直鏈醛等具有不良風味的物質含量降低。但本研究僅探究了超聲輔助處理對發(fā)酵鮐魚酶解液風味品質的影響，下一步還需重點研究超聲催化鮐魚發(fā)酵液風味化合物形成的機制。