二氫槲皮素對大腸桿菌的抑菌作用機理

蔡 瑾，閆 然，王夢亮，王 琪

（1.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006；3.山西大學(xué) 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006；4.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006）

食品工業(yè)是國民經(jīng)濟的重要組成部分。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展，食品的質(zhì)量和安全問題愈發(fā)引起人們的關(guān)注，其中由大腸桿菌等食源性病菌導(dǎo)致的食品安全問題尤為突出。食用被大腸桿菌污染的食物往往會造成傷害，如群發(fā)性腹瀉、嘔吐等[1]。食品中添加防腐劑可以抑制食物源病菌的增長，有效避免食物源病菌對人體造成的危害[2]。食品防腐劑主要分為兩類，即化學(xué)防腐劑和天然防腐劑[3]。化學(xué)防腐劑是在食品中使用最廣泛的一類防腐劑，但其具有一定的致畸性、致癌性，殘存在食品中也會對環(huán)境產(chǎn)生影響[4-5]；天然防腐劑是從植物、動物和微生物中獲得的具有抗菌和防腐活性的物質(zhì)，安全性高且對環(huán)境友好[6]。天然植物防腐劑的主要成分種類繁多、綠色健康且具有良好抗菌性能，可從植物的根、莖、葉等處提取得到[7]。植物源食品防腐劑符合現(xiàn)代社會對綠色健康消費新趨勢的追求[8]。

二氫槲皮素（dihydroquercetin，DHQ），也稱黃杉素、紫杉葉素、花旗松素，是一種從植物中提取出的二氫黃酮醇類化合物，廣泛存在于松科、薔薇科等植物中[9-10]。有多項研究表明DHQ具有抑菌活性[11-13]，在食品工業(yè)領(lǐng)域可作為食品防腐劑[14-16]。但是目前鮮見DHQ抑菌機理相關(guān)研究的報道，因此本研究測定了DHQ對常見食源性病菌的抑制活性，在確定大腸桿菌作為指示菌的基礎(chǔ)上，觀察大腸桿菌被DHQ作用后的形態(tài)變化，檢測其胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、細(xì)胞受損傷程度、膜電位變化、胞內(nèi)Ca2＋含量以及細(xì)胞周期變化，進而分析大腸桿菌受DHQ抑制的機理。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus、ATCC 25923）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis、ATCC 6633）。革蘭氏陰性菌：大腸桿菌（Escherichia coli、ATCC 25922）、普通變形桿菌（Proteus vulgaris、ATCC 13315）、產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes、ATCC 13048）。酵母菌：熱帶假絲酵母菌（Candida tropicalis、ATCC 750）。所有菌種均保藏于山西大學(xué)微生物學(xué)實驗室。

供試培養(yǎng)基：細(xì)菌培養(yǎng)基（營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基）；酵母菌培養(yǎng)基（酵母甘露醇瓊脂（yeast mannitol agar，YMA）培養(yǎng)基、酵母甘露醇肉湯（yeast mannitol broth，YMB）培養(yǎng)基）。

戊二醛、羅丹明123（rhodamine 123，RH-123）、醋酸鈾、檸檬酸鉛 德國Sigma公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）天津市大茂化學(xué)制劑廠；2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯熒光探針（2’,7’-dichloro dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）南京建成生物工程研究所；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（annexin V-fluorescein isothiocyanate isomer/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）試劑盒 蘇州宇恒生物科技有限公司；鈣熒光探針（fluo-4 acetoxymethyl ester，F(xiàn)luo-4 AM）美國Invitrogen公司；碘化丙啶/核糖核酸酶（propidium iodide/ribonuclease，PI/RNase）染色緩沖液 美國Becton dickinson公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FACS Calibur流式細(xì)胞儀 美國Becton dickinson公司；JSM-35C掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）、JEM-1011透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）日本JEOL公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)

在NB培養(yǎng)基中接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌，搖床培養(yǎng)（160 r/min、37 ℃、12 h）；將熱帶假絲酵母菌接種在YMB培養(yǎng)基上，搖床培養(yǎng)（160 r/min、25 ℃、12 h）。

1.3.2 抑菌活性檢測和最低抑菌濃度測定

DHQ對上述6 種食源性細(xì)菌的抑制活性通過瓊脂板打孔法測定[17]。用20%（體積分?jǐn)?shù)，下同）DMSO助溶DHQ，加入到無菌水中，使DHQ的質(zhì)量濃度達到8 mg/mL。將1.3.1節(jié)的菌液用生理鹽水稀釋至108CFU/mL。在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上均勻涂布各受試菌液200 μL，用10 mm打孔器在培養(yǎng)基上對稱打兩個孔。在一個孔中加入上述質(zhì)量濃度為8 mg/mL的DHQ溶液200 μL，另一個孔加入200 μL的20% DMSO作為陰性對照。5 種細(xì)菌培養(yǎng)條件為37 ℃、24 h，熱帶假絲酵母菌培養(yǎng)條件為25 ℃、48 h，培養(yǎng)后測量抑菌圈直徑。

DHQ對上述6 種食源性致病菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）使用96 孔板測定[18]。用含7% DMSO液體培養(yǎng)基溶解DHQ，利用二倍稀釋法，使DHQ質(zhì)量濃度范圍達到20～0.02 mg/mL。在96 孔板的各孔中加入200 μL含上述不同質(zhì)量濃度的DHQ液體培養(yǎng)基和5 μL（108CFU/mL）的菌液。陰性對照為只含7% DMSO液體培養(yǎng)基和5 μL菌液，不加DHQ樣品。5 種細(xì)菌的培養(yǎng)條件為37 ℃、24 h，熱帶假絲酵母菌的培養(yǎng)條件為25 ℃、48 h。培養(yǎng)后用肉眼觀察孔中菌液的濁度，選定使菌液澄清透明的最低DHQ質(zhì)量濃度為MIC。

根據(jù)抑菌活性和MIC實驗的結(jié)果，確定下一步實驗的指示菌。

1.3.3 SEM和TEM觀察

使用SEM和TEM來觀察大腸桿菌被DHQ抑制后的外部形態(tài)及內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。將DHQ溶解于含0.8% DMSO液體培養(yǎng)基中，使DHQ的最終質(zhì)量濃度達到1/2 MIC、MIC和2 MIC，并以僅含0.8% DMSO的液體培養(yǎng)基作為陰性對照。吸取100 μL的1.3.1節(jié)培養(yǎng)的大腸桿菌菌液（108CFU/mL）加入到100 mL上述液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)（120 r/min、37 ℃、12 h）。樣品8 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，用2.5%戊二醛在4 ℃下固定過夜，然后用1% OsO4固定3 h。

SEM觀察：固定的樣品依次用體積分?jǐn)?shù)30%、50%、70%和100%乙醇溶液做脫水處理20 min。處理后的樣品在-80 ℃下冷凍干燥，離子噴金，用SEM觀察細(xì)胞表面形態(tài)。

TEM觀察：用Epon 618滲透包埋固定后的樣品，進行切片處理。用醋酸鈾和檸檬酸鉛將切片進行雙染色，兩種染色劑各染15～30 min，用TEM觀察菌體內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。

1.3.4 胞內(nèi)ROS水平檢測

根據(jù)1.3.3節(jié)方法培養(yǎng)菌液，在2 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，下同）洗兩次后，懸浮在20 μmol/L DCFH-DA溶液中，避光孵育（37 ℃、20 min）。3 000 r/min離心5 min收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，在激發(fā)波長488 nm及發(fā)射波長535 nm的條件下使用流式細(xì)胞儀測定其ROS水平。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI檢測

根據(jù)1.3.3節(jié)方法培養(yǎng)菌液，在2 000 r/min離心10 min，收集菌體并重新懸浮在PBS中。根據(jù)Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書所述方法處理重懸液，避光孵育（37 ℃、20 min），在3 000 r/min下離心5 min，收集菌體，PBS洗滌兩次后重懸，使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488 nm及發(fā)射波長530 nm的條件下測定細(xì)胞受損程度。

1.3.6 細(xì)胞膜電位檢測

按1.3.5節(jié)方法得到PBS重懸后的菌液，加入RH-123使染液濃度達到20 μmol/L，避光孵育（37 ℃、20 min），3 000 r/min離心5 min，收集菌體，用PBS洗兩次后重新懸浮，使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長507 nm，發(fā)射波長529 nm的條件下測定樣品的膜電位。

1.3.7 胞內(nèi)Ca2＋含量測定

按1.3.5節(jié)方法得到PBS重懸后的菌液，加入Fluo-4 AM使染料終濃度達到4 μmol/L，避光孵育（37 ℃、30 min），3 000 r/min下離心5 min，收集菌體，用PBS洗兩次后重新懸浮，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長490 nm、發(fā)射波長520 nm的條件下測定。

1.3.8 細(xì)胞周期分析

按1.3.3節(jié)方法培養(yǎng)得到菌液，2 000 r/min離心10 min，收集菌體，PBS洗滌兩次后在4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液固定過夜后，3 000 r/min離心5 min，將菌體重懸于質(zhì)量濃度為50 μg/mL的含有RNase的PI緩沖液，避光孵育30 min，在激發(fā)波長488 nm及發(fā)射波長530 nm的條件下使用流式細(xì)胞儀測定樣品細(xì)胞周期。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有上述實驗都平行進行3 次。用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）或t檢驗。圖中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。使用Origin 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DHQ對6 種食源性病菌的抑菌活性

對各供試菌的實驗組及陰性對照組兩者之間的抑菌圈直徑進行t檢驗，圖1結(jié)果表明DHQ對6 種食源性病菌的抑菌圈直徑均在10 mm以上，均顯著大于陰性對照的抑菌圈直徑（P＜0.05），即DHQ對6 種食源性病菌均有顯著的抑制效果（P＜0.05）。經(jīng)ANOVA分析確定DHQ對6 種食源性病菌抑制作用強弱差異，結(jié)果表明DHQ對大腸桿菌有最佳的抑制作用（21.13 mm）（P＜0.05），對普通變形桿菌和熱帶假絲酵母菌的抑制作用次之（18.88、18.40 mm），對枯草芽孢桿菌以及產(chǎn)氣腸桿菌的抑制作用較弱（14.67、13.90 mm），抑制金黃色葡萄球菌的作用最弱（12.35 mm）。

圖1 DHQ對食源性致病菌的抑制活性Fig.1 Antimicrobial activities of DHQ against foodborne pathogens

美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（Clinical and Laboratory Standards Institute/National Committee for Clinical Laboratory Standards，CLSI/NCCLS）[19]規(guī)定，可以在不攪拌的情況下用肉眼觀察并判斷MIC，將抑制程度劃分為5 個等級：0級，肉眼未見生長或觀察澄清（100%抑制）；1級，肉眼可見輕微模糊（80%抑制）；2級，濁度明顯降低（50%抑制）；3級，濁度輕微降低（輕微抑制）；4級，濁度未降低（無抑制）。如表1所示，當(dāng)DHQ對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣腸桿菌的處理質(zhì)量濃度為0.02～1.25 mg/mL時，培養(yǎng)基呈現(xiàn)不同程度的渾濁現(xiàn)象；當(dāng)處理質(zhì)量濃度為2.5～20 mg/mL時，培養(yǎng)基清澈，沒有病菌生長，因此質(zhì)量濃度2.5 mg/mL被確定為DHQ對金黃色葡萄球菌和產(chǎn)氣腸桿菌的MIC。當(dāng)DHQ以0.020～0.625 mg/mL的質(zhì)量濃度處理枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和熱帶假絲酵母菌時，培養(yǎng)基表現(xiàn)出不同的渾濁度；當(dāng)處理質(zhì)量濃度為1.25～20.00 mg/mL時，培養(yǎng)基是清澈的，確定DHQ對枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌和熱帶假絲酵母菌的MIC為1.25 mg/mL。當(dāng)DHQ對大腸桿菌的處理質(zhì)量濃度為0.020～0.313 mg/mL時，培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象；當(dāng)處理質(zhì)量濃度為0.625～20.000 mg/mL時，沒有病菌生長，確定0.625 mg/mL為DHQ對大腸桿菌的MIC。

表1 DHQ對食源性致病菌的MICTable 1 Minimum inhibitory concentration of DHQ against foodborne pathogens

結(jié)合抑菌圈直徑和MIC檢測結(jié)果，可以看出DHQ對大腸桿菌具有最強的抑制活性，因此選擇大腸桿菌作為進一步研究DHQ抑菌機理的指示菌。

2.2 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)的影響

SEM和TEM的結(jié)果能夠直觀地反映大腸桿菌被DHQ破壞的情況（圖2）。對照組中大腸桿菌細(xì)胞表面光滑，呈現(xiàn)出規(guī)則的桿狀結(jié)構(gòu)（圖2A-1、圖2E-8）。經(jīng)DHQ處理后，大腸桿菌的形態(tài)與對照組相比有明顯不同（圖2B～D、F～H）。圖2B、F為由1/2 MIC的DHQ處理的大腸桿菌，雖然有些菌體細(xì)胞形態(tài)完好，但已經(jīng)開始出現(xiàn)溶脹聚集現(xiàn)象（圖2B-2），內(nèi)容物溢出形成了空洞（圖2F-9、10），有些細(xì)胞出現(xiàn)輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象（圖2F-11）。經(jīng)質(zhì)量濃度為MIC的DHQ處理（圖2C、G）后，細(xì)胞出現(xiàn)折疊黏連現(xiàn)象（圖2C-3、4、5），亦有空泡結(jié)構(gòu)（圖2G-12），質(zhì)壁分離明顯（圖2G-13）。大腸桿菌被2 MIC的DHQ處理后，亦有折疊現(xiàn)象（圖2D-6），菌體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的變形（圖2H-14、15）、破裂（圖2H-16）、降解（圖2D-7）。DHQ的化學(xué)名為3,5,7,3’,4’-五羥基-2,3雙氫黃酮醇，具有黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)。DHQ的多羥基位于其結(jié)構(gòu)內(nèi)部斥電子的大P-π共軛體系中，羥基中的氫原子容易脫離。因此，推測DHQ作用大腸桿菌后，羥基中的氫原子可能與細(xì)胞膜中的磷脂分子以氫鍵的形式相結(jié)合，使得膜結(jié)構(gòu)變得疏松[20-21]，導(dǎo)致膜通透性增加，出現(xiàn)菌體腫脹、質(zhì)壁分離等現(xiàn)象。當(dāng)DHQ的質(zhì)量濃度進一步增加，菌體結(jié)構(gòu)變形，并出現(xiàn)黏連破裂等現(xiàn)象。

2.3 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS是生物細(xì)胞在代謝過程中產(chǎn)生的一種有氧代謝物，它能維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡，與細(xì)胞的生長和死亡密切相關(guān)[22]，ROS水平失衡將會引發(fā)細(xì)胞的一系列功能障礙。DCFH-DA自身不會發(fā)出熒光，能夠自由進出細(xì)胞，并能在細(xì)胞內(nèi)被水解為DCFH，DCFH不能穿透細(xì)胞膜，使探針更易在細(xì)胞內(nèi)被裝載。無熒光的DCFH能夠被ROS氧化為有熒光的DCF，因此細(xì)胞內(nèi)的ROS水平可以通過DCF的熒光強度反映。

由圖3可知，與對照組熒光強度（36.65）相比，DHQ處理組的熒光強度分別增加到了41.14（1/2 MIC）、56.99（MIC）以及65.94（2 MIC）。經(jīng)DHQ處理的大腸桿菌細(xì)胞的熒光強度顯著高于陰性對照的熒光強度（P＜0.05）。ROS主要通過氧化呼吸鏈產(chǎn)生和累積。細(xì)菌的呼吸作用主要由細(xì)胞膜上相關(guān)的酶催化反應(yīng)進行，因此細(xì)胞膜是細(xì)菌產(chǎn)生ROS的主要位點。經(jīng)DHQ處理后，DCFH-DA探針的熒光強度顯著增強，推測DHQ可以刺激胞內(nèi)的ROS過度產(chǎn)生。細(xì)胞膜中的脂質(zhì)會因為過多的ROS而過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動性降低[23-25]。

圖3 不同質(zhì)量濃度DHQ作用下大腸桿菌胞內(nèi)ROS水平Fig.3 Intracellular ROS levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.4 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞膜通透性和完整性的影響

磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）通常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，并會在細(xì)胞受損的早期階段從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)向外側(cè)移動；Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，具有與PS特異性結(jié)合的高親和力。Annexin V被FITC熒光素標(biāo)記后可以作為熒光探針，用于定量檢測PS從內(nèi)側(cè)向外側(cè)的轉(zhuǎn)移，可在流式細(xì)胞儀中檢測細(xì)胞受損的進展情況[26]。PI是一種核酸染料，在細(xì)胞膜的完整性受到破壞后會將核酸染成紅色[27]。因此，以Annexin V-FITC/PI染色后可以通過流式細(xì)胞儀檢測出大腸桿菌活細(xì)胞、受傷細(xì)胞和死亡細(xì)胞。AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記圖顯示4 種不同狀態(tài)的細(xì)胞，左下（LL）、右下（LR）、右上（UR）、左上（UL）分別表示活細(xì)胞、受傷細(xì)胞、死細(xì)胞、壞死細(xì)胞與碎片[28]。

結(jié)合圖4A～D可以看出，大腸桿菌在LL區(qū)的占比隨著DHQ質(zhì)量濃度的增加而逐漸減少，而LR區(qū)域大腸桿菌的占比增加。從圖4E、F可以看出，與陰性對照相比，MIC和2 MIC DHQ處理后，正常的大腸桿菌占比顯著下降（P＜0.05），受損細(xì)胞占比顯著上升（P＜0.05）。由此推測，DHQ的處理可以使大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性增加，完整性被破壞，從而影響細(xì)胞的正常生理活動，使活細(xì)胞減少。

圖4 不同質(zhì)量濃度DHQ作用下大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性Fig.4 Evaluation of cell membrane permeability of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.5 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞膜電位的影響

膜電位是由細(xì)胞膜內(nèi)外電勢差產(chǎn)生的，反映了菌體新陳代謝。因此，細(xì)胞膜電位是細(xì)胞的一種功能性參數(shù)，在細(xì)菌代謝活動中起著重要作用，可反映細(xì)胞膜的完整性和菌體生理狀態(tài)[29]。RH-123是一種陽離子親脂性熒光物質(zhì)，可以通過跨膜電位進入細(xì)胞，其熒光強度通過流式細(xì)胞儀檢測后可反映膜電位的變化[30]。如圖5所示，陰性對照表現(xiàn)出較強的熒光強度，為68.97，隨著DHQ質(zhì)量濃度的增加，熒光強度逐漸降低，1/2 MIC、MIC、2 MIC DHQ處理后的大腸桿菌熒光強度分別為43.38、35.07、34.69。與陰性對照相比，DHQ處理后的大腸桿菌細(xì)胞熒光強度顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，RH-123進入細(xì)胞內(nèi)的動力減弱，即細(xì)胞膜內(nèi)外電勢差減少，由此可以推測出DHQ會引起大腸桿菌細(xì)胞膜去極化，使膜電位降低，進一步造成胞內(nèi)離子紊亂，細(xì)胞的正常生理功能受到損傷。

圖5 不同質(zhì)量濃度DHQ作用下大腸桿菌細(xì)胞膜電位水平Fig.5 Cell membrane potential levels of Escherichia coli under different mass concentrations of DHQ

2.6 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋含量的影響

胞內(nèi)Ca2＋是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的重要因子，可以作為第二信使廣泛參與細(xì)胞運動、代謝等多種功能活動，還參與維持細(xì)胞跨膜運輸[31]。如圖6所示，與對照組的熒光強度（44.31）相比，DHQ處理組的熒光強度減少到了33.13（1/2 MIC）、29.82（MIC）以及28.33（2 MIC）。大腸桿菌被DHQ處理后的熒光強度與陰性對照相比顯著降低（P＜0.05）。在正常細(xì)胞中，胞內(nèi)Ca2＋的含量處在穩(wěn)定水平，當(dāng)細(xì)胞膜通透性受損后，會導(dǎo)致Ca2＋的外漏。因此，胞內(nèi)Ca2＋含量的變化可以反映出細(xì)胞膜通透性的變化。以上結(jié)果表明DHQ處理后的大腸桿菌胞內(nèi)Ca2＋含量減少，推測DHQ可導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、Ca2＋外漏，并直接影響到由Ca2＋所參與的菌體的正常生長代謝和功能活動。

2.7 DHQ對大腸桿菌細(xì)胞周期的影響

原核細(xì)胞周期中的I期為DNA復(fù)制準(zhǔn)備期，R期為DNA復(fù)制期。圖7顯示了DHQ處理后對大腸桿菌細(xì)胞周期的影響。經(jīng)DHQ處理后，處于I期的大腸桿菌占比從82.99%（陰性對照）下降到了73.26%（1/2 MIC）、71.96%（MIC）、64.84%（2 MIC），處于R期的大腸桿菌占比從17.01%（陰性對照）上升到了26.74%（1/2 MIC）、28.04%（MIC）、35.16%（2 MIC）。DHQ處理后大腸桿菌處于I期的占比與對照組相比顯著下降（P＜0.05），處于R期的占比顯著上升（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，DHQ對大腸桿菌的抑制作用與其干擾細(xì)胞周期有關(guān)。推測原因可能為DHQ損傷菌體的細(xì)胞膜，進入細(xì)胞內(nèi)部，引起ROS在菌體內(nèi)聚集，破壞了與DNA合成有關(guān)的酶或蛋白質(zhì)，從而干擾了大腸桿菌正常的細(xì)胞周期[32]。

3 結(jié)論

從植物中提取的DHQ可以抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌和熱帶假絲酵母菌的生長，其中對大腸桿菌的抑菌效果最好，所以選擇大腸桿菌作為抑菌機理實驗的指示菌。DHQ會使得菌體內(nèi)ROS含量增加，細(xì)胞膜的完整性和通透性受到損壞，細(xì)胞嚴(yán)重變形，出現(xiàn)黏連、折疊等現(xiàn)象；細(xì)胞膜電位降低，發(fā)生去極化現(xiàn)象，造成胞內(nèi)離子紊亂，導(dǎo)致Ca2＋等離子外漏，影響細(xì)胞生長代謝；使細(xì)胞周期滯留在R期，正常的細(xì)胞周期受到了干擾。本實驗證實了DHQ對大腸桿菌等食源性病原菌具有顯著抑制活性，并闡述了其抑菌機理。實驗結(jié)果可為DHQ作為植物源食品防腐劑應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域提供理論參考。