酶的耐酸性改造及在赭曲霉毒素A脫除中的應(yīng)用研究進(jìn)展

趙自通，張真真，張昊祥，阮 麗，梁志宏,2,3,*，王鴻磊

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；2.食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部轉(zhuǎn)基因生物食用安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京），北京 100083；4.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670）

蛋白酶是在現(xiàn)代化生產(chǎn)過(guò)程中廣泛應(yīng)用的一類(lèi)具有高效生物催化功能的蛋白質(zhì)。過(guò)去的幾十年里蛋白酶制劑在生物制藥、精細(xì)化工、食品工業(yè)、生物燃料開(kāi)發(fā)、紡織、造紙、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中的應(yīng)用急劇增加，幾乎涵蓋人們?nèi)粘Ｉ钪谐Ｒ?jiàn)商品的生產(chǎn)制造過(guò)程，與人們的衣食住行息息相關(guān)[1]。生物酶的開(kāi)發(fā)與設(shè)計(jì)是生物制造產(chǎn)業(yè)的核心技術(shù)，工業(yè)化應(yīng)用中對(duì)酶功能特性的升級(jí)需求加速推動(dòng)了對(duì)具有良好催化和經(jīng)濟(jì)特性的改造酶的研究。酶在天然溫和的條件下具有高特異性、區(qū)域選擇性或立體選擇性等特性，有助于發(fā)展更可持續(xù)的化學(xué)過(guò)程；在真菌毒素脫除領(lǐng)域，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種氧化酶、水解酶能夠高效特異性降解如黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）、嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON）、玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等真菌毒素，其已成為繼物理吸附、化學(xué)降解、微生物吸附/降解后解決真菌毒素污染最有前景的方法之一[2]。但應(yīng)用于商業(yè)化的真菌毒素降解酶很少，大部分酶仍然因?yàn)榉€(wěn)定性差、環(huán)境適應(yīng)性差而處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。由于酶催化作用對(duì)體系條件要求苛刻，從天然來(lái)源中分離出的酶通常在溫和條件下非常有效，但在工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中的非自然條件（極端pH值、極端溫度、極端鹽度、有機(jī)溶劑）中活性受到抑制。因此，酶促生物催化的潛力尚未被充分開(kāi)發(fā)，找到有效的策略來(lái)克服這些缺點(diǎn)是該領(lǐng)域研究人員的目標(biāo)，同時(shí)天然酶對(duì)反應(yīng)體系的苛刻要求使其不能適應(yīng)食品及飲料等的工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)境，成為阻礙酶工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。本文總結(jié)了目前酶耐酸性改造的常用策略及其在OTA脫除領(lǐng)域的應(yīng)用前景，以期為工業(yè)酶的耐酸性研究提供參考，也為真菌毒素脫毒酶的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 酶的耐酸性改造策略

分子改造能夠有效提高酶的穩(wěn)定性。近年來(lái)，研究者普遍認(rèn)同的分子改造方法分為定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)、半理性設(shè)計(jì)[3]（圖1）。影響酶蛋白耐酸性的因素主要有活性中心的pKa值[4]，底物結(jié)合位點(diǎn)的pKa值[5]，蛋白質(zhì)表面電荷[6]，蛋白質(zhì)內(nèi)部的分子作用力如氫鍵[7-8]、鹽鍵[9]、芳香堆積[10-11]等，通過(guò)理性設(shè)計(jì)的定點(diǎn)突變改造酶蛋白的分子組成，進(jìn)而改變其性質(zhì)，具有快速、直接、準(zhǔn)確率高的特點(diǎn)，最常用的耐酸性理性設(shè)計(jì)策略有同源序列比對(duì)[12]、表面電荷優(yōu)化[13]、分子間相互作用力優(yōu)化[14]等（圖2）。

圖1 生物酶的蛋白質(zhì)工程改造常見(jiàn)方法示意圖Fig.1 Schematic diagram of common strategies for protein engineering modification of biological enzymes

圖2 生物酶的耐酸性理性設(shè)計(jì)策略示意圖[4,15-16]Fig.2 Schematic diagram of rational design strategy to improve the acid resistance of biological enzymes[4,15-16]

1.1 同源序列比對(duì)策略

在特定的酶家族中，其催化機(jī)理及活性中心具有高度相似性，具體體現(xiàn)為具有相同的保守氨基酸，這些氨基酸對(duì)酶的催化特性及穩(wěn)定性具有重要意義[17]。因此，可以通過(guò)序列比對(duì)工具對(duì)比具有耐酸性的酶和不耐酸的酶在保守序列上的差異，進(jìn)而分析對(duì)目標(biāo)酶耐酸性具有關(guān)鍵影響作用的潛在氨基酸位點(diǎn)，后期通過(guò)定點(diǎn)突變、點(diǎn)飽和突變等方式進(jìn)行驗(yàn)證及篩選得到最佳突變體，目前已有大量研究采用同源序列比對(duì)策略改造了酶的耐酸性。Ma Fuqiang等[18]從木聚糖酶GH11家族序列中收集了113 個(gè)具有注釋pH值的酶構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)序列比對(duì)分析確定了5 個(gè)與pH值相關(guān)的潛在氨基酸位點(diǎn)，其中4 個(gè)突變體的最適pH值發(fā)生顯著變化，其組合突變使突變體的最適pH值降低了1.5。Tishkov等[19]通過(guò)對(duì)糖苷水解酶G12家族的同源序列比對(duì)及三維結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)源于疣孢青霉（Penicillium verruculosum）糖苷水解酶的Asp98Asn更容易與Glu203形成氫鍵，直接影響酶的pH值穩(wěn)定性，活性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Asp98在催化過(guò)程中起著一般酸的作用，突變體的羧甲基纖維素比活力沒(méi)有變化，但其最適pH值由4.0升高至5.1。Shi Xin等[20]采用基于結(jié)構(gòu)的序列比對(duì)分析方法確定了源于米曲霉（Aspergillus oryzae）的β-半乳糖苷酶的篩選突變位點(diǎn)，構(gòu)建突變體并進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)Tyr138Phe和Tyr364Phe的最適pH值從4.5分別變?yōu)?.5和6.0。Li Zhengxue等[21]通過(guò)序列比對(duì)和表面電荷工程的方法，對(duì)源于Bacillus terquilensis的中溫β-葡聚糖酶進(jìn)行耐酸性改造，發(fā)現(xiàn)突變體Gln1Glu、Ile133Leu、Val134Ala、Gln1Glu/Ile133Leu酸穩(wěn)定性提高，其中組合突變體Gln1Glu/Ile133Leu在pH 5.0和pH 6.0條件下處理1 h后，其酸穩(wěn)定性分別為86.9%和100.5%，均顯著高于野生型（38.2%和56.4%）；進(jìn)一步分析認(rèn)為蛋白質(zhì)表面負(fù)電荷比例的增加可能是其耐酸性提高的原因。

1.2 表面電荷優(yōu)化策略

疏水氨基酸掩藏在蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水性氨基酸分布在蛋白質(zhì)的表面，帶電荷氨基酸在蛋白質(zhì)表面可通過(guò)靜電相互作用形成保護(hù)層，穩(wěn)定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)；基于蛋白質(zhì)的這一特點(diǎn)，可以通過(guò)優(yōu)化設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表面的帶電荷氨基酸，使蛋白質(zhì)表面分布的電荷合理化，增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面的靜電相互作用力，從而提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性[6,22]。目前，用于分析蛋白質(zhì)表面電荷分布情況的軟件Modeller、Rosetta等已用被廣泛應(yīng)用，Modeller軟件可以采用遺傳算法來(lái)優(yōu)化設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)表面帶電荷氨基酸的分布[23]；Rosetta軟件支持多種模式（Rosetta supercharge和AvNAPSA supercharge）用以評(píng)估和設(shè)計(jì)酶的表面電荷[15]。天然天冬氨酸酶（aspartase，AspB）（EC 4.3.1.1）的最適pH值為9，在堿性條件下具有較好的催化活性，Wang Yaling等[24]采用理性設(shè)計(jì)的策略改造該酶的耐酸性以用于生產(chǎn)β-氨基丁酸（β-aminobutyric acid，BABA）。其首先采用Rosetta supercharge算法設(shè)計(jì)了多個(gè)單點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變體S133D在pH 8條件下的催化活性比初始酶提高了1.3 倍。然后在單點(diǎn)突變的基礎(chǔ)上擇優(yōu)進(jìn)行組合突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)六位點(diǎn)突變體K19E-N87E-N125DS133D-Q262E-N451E的最適pH值為8.0，且其比活力（120.78 mU/mg）是初始酶的3 倍，酶學(xué)性質(zhì)分析也表明突變體酶的pH值穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性更好。Huang Ziyang等[25]采用定點(diǎn)飽和誘變和表面電荷修飾的半理性設(shè)計(jì)方法，提高了來(lái)源于Pyrococcus horikoshii的幾丁質(zhì)脫乙酰酶（diacetylchitobiose deacetylase derived fromP.horikoshii，PhDac）的催化效率及耐酸性。他們首先通過(guò)定點(diǎn)飽和誘變篩選出PhDac突變體M14，其催化效率（催化常數(shù)（kcat）/米氏常數(shù)（Km））比初始酶提高了2.21倍；比活力達(dá)到5 162.17 U/mg，與野生型相比提高了70.02%。由于天然PhDac的最適pH值為7.0～8.0，在利用其制備氨基葡萄糖（glucosamine，GlcN）的過(guò)程中因環(huán)境酸度較低其催化活性受到抑制，為了進(jìn)一步提高PhDac的耐酸性，利用Rosetta supercharge算法設(shè)計(jì)PhDac的表面電荷，針對(duì)潛在影響耐酸性的位點(diǎn)構(gòu)建突變體并進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，找到6 個(gè)對(duì)最適pH值有較大影響的氨基酸位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行組合突變，最終發(fā)現(xiàn)突變體M20的最適pH值（pH 6.0）較天然PhDac顯著降低，且在pH 5.5時(shí)仍能保持較高的催化活性，比活力最高可達(dá)6 277.28 U/mg，是野生型PhDac的2 倍。

源于豬的胃蛋白酶A具有極好的耐酸性，Cooper等[26]發(fā)現(xiàn)豬胃蛋白酶A中的Glu和Asp均有43 個(gè)，其酸性氨基酸的比例較高，因而具有非常低的pI值（pI 2～3），這可減少其在低pH值條件下正電荷的累積，提高其酸穩(wěn)定性。B?nisch等[27]也發(fā)現(xiàn)來(lái)源于酸熱硫化葉菌（Sulfolobus acidocaldarius）的嗜酸性鐵硫蛋白的可溶性結(jié)構(gòu)域表面會(huì)積累Asp及Glu等酸性氨基酸，其占比為60%，遠(yuǎn)高于堿性氨基酸的比例，蛋白表面主要呈現(xiàn)負(fù)電勢(shì)，因此蛋白質(zhì)表面電荷優(yōu)化策略也是改善酶蛋白pH值穩(wěn)定性的有效策略之一。武文慧等[28]利用ROSETTA軟件改造谷氨酸脫氫酶，通過(guò)調(diào)整其正或負(fù)電荷殘基類(lèi)型改變蛋白的凈電荷，構(gòu)建的7 個(gè)突變體中Asn16Asp和Lys218Asp的最適pH值均由8.0下降到7.0，優(yōu)化后的酶活力分別提高了2.9 倍和5.4 倍。Liu Yihan等[29]發(fā)現(xiàn)改變蛋白質(zhì)表面的靜電作用能夠顯著提高突變體在低pH值條件下的催化效率和穩(wěn)定性，表明蛋白質(zhì)表面的靜電相互作用對(duì)維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性具有重要作用。已經(jīng)報(bào)道的部分酶在耐酸性改造前后的最適pH值變化如表1所示。

表1 已經(jīng)報(bào)道的部分酶在耐酸性改造前后的最適pH值變化Table 1 Optimal pH of some reported enzymes before and after acid resistance modification

1.3 分子間作用力優(yōu)化策略

酶的耐酸性除了與其表面電荷相關(guān)以外，還受到活性中心及底物結(jié)合中心氨基酸pKa值的影響，一些酶的最適pH值與其活性中心/底物結(jié)合中心關(guān)鍵殘基的pKa值緊密相關(guān)。pKa值表征氨基酸電離平衡常數(shù)，其變化的同時(shí)也改變了局部關(guān)鍵殘基的分子間相互作用力，如氫鍵、芳香堆積作用、鹽橋[7,10,38-39]。因此，以pKa值的變化作為指標(biāo)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，其本質(zhì)也是改變酶的分子間相互作用力。Joshi等[7]研究表明，環(huán)狀芽孢桿菌（B.circulans）木聚糖酶突變體Asn35Asp最適pH值較初始酶降低了1.1，活力增加了20%，這源于A(yíng)sp35和Glu172之間形成了一個(gè)短的氫鍵（2.7 ?），穩(wěn)定了糖基轉(zhuǎn)移的過(guò)渡態(tài)。Shiraki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)色桿菌（Achromobacter lyticus）蛋白酶I在靠近催化三聯(lián)體位置的Trp169-His210處存在一個(gè)獨(dú)特的芳香環(huán)堆積，His210Ala或His210Ser突變體的酸性邊界（pH值）較初始酶降低了1.9。Yang Haiquan等[9]對(duì)源于枯草芽孢桿菌（B.subtilis）的α-淀粉酶進(jìn)行耐酸性改造，將His222、His275、His293、His310突變?yōu)锳sp構(gòu)建單點(diǎn)突變體及組合突變體，發(fā)現(xiàn)突變體的耐酸性顯著提高，主要原因是其形成了新的氫鍵與鹽鍵。Qin Yuqi等[38]篩選得到催化活性提高的內(nèi)切葡聚糖酶II突變體，該突變體Asn342Val在pH值為5.8時(shí)表現(xiàn)出最佳活性，最適pH值比初始酶提高了1，其催化殘基和底物間靜電相互作用產(chǎn)生了變化。

降低親核試劑的pKa值不僅可以提高其催化活性，而且可能有助于改變其最優(yōu)pH值[4,37]。Wang Chenghua等[4]通過(guò)降低活性中心pKa值的方法提高來(lái)源于B.subtilis的α-淀粉酶（α-amylase，Amy7C）的耐酸性，在距離活性中心4.5 ?的范圍內(nèi)基于計(jì)算機(jī)同源序列比對(duì)和pKa值預(yù)測(cè)分析構(gòu)建了多個(gè)突變體，結(jié)果表明突變體Ala270Lys/Asn271His的最適pH值降低了2，催化效率較初始酶提高了約3.94 倍；突變體的結(jié)構(gòu)分析表明其耐酸能力的改善可能是催化親核試劑和質(zhì)子供體殘基pKa值的降低所致。Xie Ting等[37]利用相同的方法改變普魯蘭酶（PulPY2，EC 3.2.1.41）的耐酸性及催化活性，他們首先通過(guò)在距離活性中心6 ?的范圍內(nèi)引入組氨酸，設(shè)計(jì)多個(gè)突變體，經(jīng)過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)Gln3His的最適pH值由6.4降低為5.0，最大催化活力為54.2 U/mg，比初始PulPY2（32 U/mg）提高了69.3%；然后對(duì)其進(jìn)行表面電荷優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)突變體Ile25Glu的最適pH值降低至5.4，其催化活力比初始酶高1.4 倍；最終結(jié)合改變活性中心pKa值和表面電荷優(yōu)化單點(diǎn)突變?cè)O(shè)計(jì)兩者的組合突變，結(jié)果表明突變體Gln3His/Ile25Glu的最適pH值為5，最大酶比活力為63.9 U/mg，是初始PulPY2的2 倍，同時(shí)突變體Q13H/I25E在pH值為5時(shí)的活力較初始酶提高了3.3 倍，其酸耐受性顯著提高，在pH 4.8～7.0的范圍內(nèi)最大比活力高于70%。Liu Zhongmei等[16]基于表面電荷、序列比對(duì)以及已報(bào)道突變綜合分析等方法改造納豆激酶，構(gòu)建了11 個(gè)突變體，發(fā)現(xiàn)Tyr217Lys的耐酸性增強(qiáng)，最適pH值較初始酶降低了1，可能的原因是His64的pKa值發(fā)生改變，穩(wěn)定了其質(zhì)子化狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致納豆激酶的耐酸性發(fā)生變化。

1.4 剛化柔性區(qū)域策略

酶的耐酸性與熱穩(wěn)定性之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，在利用剛化柔性區(qū)域策略進(jìn)行酶的熱穩(wěn)定性改造的過(guò)程中經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)酶的耐酸性、最適pH值也隨之發(fā)生變化；這說(shuō)明增加酶的剛性在一定程度上也會(huì)增加酶的耐酸性。目前已報(bào)道的能夠提高酶耐酸性的剛化柔性區(qū)域策略有截短突變、引入二硫鍵等。

截短突變是剛化柔性區(qū)域的常用策略。天然酶的loop環(huán)由6～16 個(gè)表面氨基酸殘基組成，對(duì)于蛋白質(zhì)的折疊、功能和穩(wěn)定性具有重要作用，具有較強(qiáng)的柔性。嗜熱酶表面具有較短和較少的loop結(jié)構(gòu)，有利于維持其熱穩(wěn)定性，磷脂酶D的2 個(gè)loop環(huán)截短突變體Δ37-45和Δ38-46的半衰期較初始酶分別延長(zhǎng)了11.7 倍和8.0 倍[40]。Kong Xiangya等[41]為了提高山羊溶酶體α-甘露糖苷酶外源表達(dá)產(chǎn)物活性及表達(dá)量，通過(guò)截短該酶部分結(jié)構(gòu)域的方式構(gòu)建了多個(gè)突變體進(jìn)行外源表達(dá)，結(jié)果表明突變體chLAMt具有催化活性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)截短突變體的耐酸耐熱性均提高，在79 ℃條件下突變體能保留40%的活性，同時(shí)其最適pH值由6.0降低到5.5。Pan Xian等[42]對(duì)β-甘露糖苷酶只保留核心區(qū)的截短序列以及對(duì)其全長(zhǎng)堿基序列進(jìn)行外源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)截短后的突變體（MAN330）與其全長(zhǎng)蛋白（MAN493）的最適pH值、最適溫度和底物特異性相似，但在pH 9.0～11.0范圍內(nèi)，MAN330的穩(wěn)定性比MAN493高約7%；在60～80 ℃范圍內(nèi)，MAN330的穩(wěn)定性比MAN493高約10%，說(shuō)明截短表達(dá)的突變體pH值穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性比全長(zhǎng)蛋白高。Yin Xin等[43]通過(guò)將木聚糖酶的N端替換為耐熱木聚糖酶片段構(gòu)建多個(gè)突變體，篩選后發(fā)現(xiàn)突變體re-NhXyn1157的最適溫度由55 ℃升高到85 ℃，pH耐受范圍拓寬，可在pH 4.0～8.5內(nèi)保持85%以上的活性。

引入二硫鍵也是剛化柔性區(qū)域的常用策略。Yang Min等[44]發(fā)現(xiàn)在海藻酸裂解酶（EC 4.2.2.3）中引入二硫鍵后，突變體半衰期延長(zhǎng)2.25 h，熔融溫度（Tm）升高1.7 ℃。Turunen等[45]在內(nèi)切-1,4-木聚糖酶II（XynII）的α-螺旋中引入二硫鍵（S110C-N154C），結(jié)果表明突變體在65 ℃下的半衰期由小于l min延長(zhǎng)到14 min，同時(shí)其pH值穩(wěn)定性提高，在pH 4.0～9.0的范圍內(nèi)突變體酶活性均高于野生型。Suzuki等[46]在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的N末端引入一個(gè)二硫鍵（D3C-G283C），發(fā)現(xiàn)突變體熱穩(wěn)定性得到顯著改善，其中55 ℃條件下的半衰期較初始酶延長(zhǎng)了1.79 倍，由29.2 min延長(zhǎng)到81.5 min，半失活溫度由57 ℃升高到66 ℃。Teng等[47]在嗜酸性木聚糖酶中引入兩個(gè)二硫鍵（T2C-T29C、S39C-S186C）后，突變體在pH 3.0～5.0的酸性環(huán)境中保持相對(duì)穩(wěn)定的同時(shí)，其最適溫度從50 ℃升高到70 ℃，比活力較初始酶提高了3.76 倍，kcat/Km提高了2.14 倍。因此，基于目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道及國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，采用剛化柔性區(qū)域的理性設(shè)計(jì)策略，能夠同時(shí)篩選出耐酸性及耐熱性提高的突變體，進(jìn)而得到具有更高環(huán)境耐受性的重組酶制劑。

1.5 突變體的篩選策略

通過(guò)隨機(jī)突變或理性設(shè)計(jì)策略進(jìn)行脫毒酶改造的過(guò)程中，發(fā)生有益突變的概率非常低（低于1/105），因此對(duì)突變體快速高通量篩選以獲得最佳突變體尤為重要[48]。傳統(tǒng)的篩選方法是采用瓊脂平板或微孔板進(jìn)行篩選；酶（如纖維素酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、多聚半乳糖醛酸酶等[49-51]）對(duì)顯色底物具有降解作用，其可以在菌落周?chē)a(chǎn)生水解圈，因此常用于篩選高活性菌株[52]。與瓊脂平板篩選法相比，微孔板篩選可借助計(jì)算分析平臺(tái)，通過(guò)如吸光度、熒光強(qiáng)度等信號(hào)高通量篩選有益突變體，其篩選量可達(dá)104～105個(gè)/周[53]，顯著提高了篩選速率。最近的研究表明，流式細(xì)胞術(shù)及微流控技術(shù)聯(lián)合生物傳感器、電化學(xué)傳感器可以輕松篩選106～1010個(gè)突變體文庫(kù)，為生物酶改造中的快速高通量篩選提供了有力支撐[48]。

盡管采用蛋白質(zhì)工程方法改造生物酶的技術(shù)已經(jīng)相當(dāng)成熟，但針對(duì)真菌毒素脫毒酶進(jìn)行改造并導(dǎo)向?qū)嶋H應(yīng)用的研究仍然處在初步階段。在眾多已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的真菌毒素脫毒酶中，目前僅有少數(shù)研究采用理性設(shè)計(jì)策略改造OTA脫毒酶、ZEN脫毒酶的耐酸性、熱穩(wěn)定性及催化活性。雖然理性設(shè)計(jì)具有無(wú)需高通量大量篩選突變體的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)也存在改造效果不理想的情況，以及可能遺漏活性更好的突變體等問(wèn)題。因此，為了獲得更加理想的真菌毒素脫毒酶突變體以用于實(shí)際的脫毒應(yīng)用，未來(lái)可以借助日趨成熟的高通量篩選技術(shù)對(duì)脫毒酶進(jìn)行改造。

2 脫毒酶耐酸性改造在OTA脫除中的潛在應(yīng)用

2.1 OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)及污染現(xiàn)狀

赭曲霉毒素（ochratoxins，OTs）是由曲霉屬和青霉屬等霉菌產(chǎn)生的一類(lèi)氯酚類(lèi)真菌毒素，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過(guò)20 種OTs家族的化合物[54]，主要包括OTA和赭曲霉毒素B（ochratoxin B，OTB），其中OTA暴露范圍最廣泛，毒性最強(qiáng)，1994年被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)和世界衛(wèi)生組織列為IIB類(lèi)致癌物質(zhì)[55]。近期研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低劑量接觸OTA有引起兒童自閉癥惡化的潛在風(fēng)險(xiǎn)[56]。GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》對(duì)葡萄酒（2.0 μg/kg）、咖啡（5.0 μg/kg）等都有OTA限量要求；歐盟EC/1881—2006Setting Maximum Levels for Certain Contaminants in Foodstuffs規(guī)定葡萄酒中OTA限量同樣是2.0 μg/kg，但其2020年將食品及輔料中的OTA限量修訂為0.5（嬰兒食品）～20 μg/kg（干辣椒）；食品法典委員會(huì)（Codex Alimentarius Commission，CAC）認(rèn)為受到OTA污染嚴(yán)重的農(nóng)產(chǎn)品/食品排序依次為谷物＞葡萄及其制品＞咖啡及其制品＞白酒＞其他[57]，葡萄和咖啡是受污染最嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)作物（表2）。根據(jù)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)監(jiān)督管局及歐盟食品飼料類(lèi)快速預(yù)警系統(tǒng)（The Rapid Alert System for Food and Feed，RASFF）發(fā)布的通知，葡萄、咖啡及其制品等產(chǎn)品中檢出OTs的頻率較高，2021年RASFF發(fā)布的預(yù)警中，在葡萄、咖啡及其制品等產(chǎn)品中檢出OTA的頻率為44.1%[58]。綜上，葡萄酒及咖啡中的OTs污染造成了巨大的食品安全隱患。

表2 不同農(nóng)產(chǎn)品中OTA的檢出率和污染水平Table 2 Detection rates and contamination levels of OTA in different agricultural products

2.2 耐酸OTA脫毒酶的應(yīng)用前景

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羧肽酶A（carboxypeptidase A，CPA）、酰胺酶、酯酶、蛋白酶等具有OTA降解活性，其能夠催化OTA降解為赭曲霉毒素α（ochratoxin α，OTα）和苯丙氨酸，是OTA無(wú)害化處理的理想方式[71]。其中源于牛胰臟的CPA發(fā)現(xiàn)最早，而且同時(shí)具有降解OTA及OTB的能力[72-73]，能夠在短時(shí)間內(nèi)將OTA完全降解，最適作用pH值為8.0，CPA降解OTA的pH值范圍為6.0～9.0，超出此范圍其OTA降解活性急劇下降[74]。此外，源于枯草芽孢桿菌（B.subtilisCW14）及溶桿菌（Lysobactersp.CW239）菌株的羧肽酶DacA及rCP4同樣具有OTA降解活性，其最適pH值均為7，在酸性環(huán)境中其OTA降解活性均受到一定程度的抑制[72,75]。除了羧肽酶以外，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)來(lái)源于寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas acidaminiphila）和黑曲霉（Aspergillus niger）的酰胺酶AHD3和OTase同樣具有OTA降解活性，且其降解活性高于牛胰臟CPA，其最適pH值均為7，在酸性環(huán)境中的催化活性受到抑制[74,76]。

研究表明，OTA在pH＞12的堿性條件下不穩(wěn)定，能夠通過(guò)打開(kāi)內(nèi)酯環(huán)或者降解酰胺鍵的方式產(chǎn)生毒性低于OTA的產(chǎn)物[77]；但是在自然或者酸性條件下OTA非常穩(wěn)定，很難發(fā)生降解[78]。由表3可知，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的OTA降解酶的最適pH值均為中性或者偏堿性，且大多數(shù)酶的活性范圍較窄，在pH值低于5的酸性環(huán)境中其OTA降解活性受到強(qiáng)烈抑制，因此獲得具有更好耐酸性的酶是解決酸穩(wěn)定性O(shè)TA脫除問(wèn)題的必然選擇。宋佳等[79]研究了重組酰胺水解酶Af-Otd降解OTA的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明該酶在弱堿性條件下的活力更高，最適pH值為7.5，但是在酸性條件下活力明顯降低；同時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)乙醇濃度對(duì)該酶活力有顯著影響，在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)8%時(shí)Af-Otd失去OTA降解活性。易受OTA污染的葡萄酒乙醇體積分?jǐn)?shù)在8%～15%之間，且食品、飼料的pH值均為偏酸性（表2）；所以在未來(lái)的實(shí)際脫毒應(yīng)用中偏酸性的食品體系會(huì)導(dǎo)致OTA降解酶失活，進(jìn)而失去脫毒能力，這是阻礙OTA脫毒酶工業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。因此，利用理性設(shè)計(jì)的策略對(duì)目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的具有OTA降解活性、背景明確的OTA脫毒酶進(jìn)行分子改造，使其最適pH值向偏酸性轉(zhuǎn)移，或者增強(qiáng)OTA降解酶的耐酸性，是解決目前OTA降解酶活性作用范圍與實(shí)際脫毒環(huán)境條件不匹配問(wèn)題的關(guān)鍵。OTA降解酶的催化活性及pH值范圍如表3所示。

表3 OTA降解酶的催化活性及pH值范圍Table 3 Catalytic activity and pH range of OTA-degrading enzymes

2.3 脫毒酶耐酸性改造研究

盡管已經(jīng)有大量可降解OTA的羧肽酶、酰胺酶、酯酶、蛋白酶等被發(fā)現(xiàn)/挖掘、鑒定和研究（表3），但其在耐酸性及耐熱性方面仍然無(wú)法滿(mǎn)足工業(yè)應(yīng)用的要求。為了提高CPA降解OTA的穩(wěn)定性，馬蕾等[87-88]采用沸石咪唑酯骨架化合物（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）對(duì)CPA進(jìn)行負(fù)載與保護(hù)，結(jié)果使CPA的底物轉(zhuǎn)化率提高了3 倍，并使其穩(wěn)定性及OTA降解能力顯著提高。雖然采用酶固定技術(shù)可以提高酶的表觀(guān)穩(wěn)定性，但沒(méi)有改變酶本身的環(huán)境抗逆性，不能從根本上解決脫毒酶穩(wěn)定性差的問(wèn)題。因此，基于脫毒酶的晶體結(jié)構(gòu)，采用理性設(shè)計(jì)改造酶的耐酸耐熱能力逐漸引起了研究人員的關(guān)注。Xiong Lu等[89]通過(guò)對(duì)CPA進(jìn)行截短表達(dá)，發(fā)現(xiàn)去除CPA酶原中的信號(hào)肽及前導(dǎo)肽后在畢赤酵母中表達(dá)的成熟CPA（mature CPA，M-CPA）在pH值為3～4及pH 11的環(huán)境中比從牛胰臟中直接提取商用CPA（commercial CPA，M-CPA）具有更好的穩(wěn)定性及催化活性，可能是截短后提高了CPA分子的剛性所致（圖3A）。Ming Yue等[90]預(yù)測(cè)了CPA的柔性區(qū)域，以剛化柔性區(qū)域的方式構(gòu)建了多個(gè)突變體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體r133-139的熱穩(wěn)定性顯著提高，其半衰期延長(zhǎng)了40.3 min，半失活溫度升高了6.7 ℃，熔融溫度Tm升高了3.1 ℃，其熱穩(wěn)定性的提高可能與局部氫鍵的形成有關(guān)（圖3B）。

圖3 基于理性設(shè)計(jì)的真菌毒素脫毒酶改造Fig.3 Rational design-based modification of mycotoxin degradation enzymes

除了針對(duì)OTA 降解酶的改造外，關(guān)于ZEN 降解酶（ZHD101）的改造研究也有報(bào)道（圖3C）。Yu Xinrui等[92]基于結(jié)構(gòu)和同源序列比對(duì)分析，使突變體ZHDM1和Ile160Tyr對(duì)ZEN的催化活力較初始酶分別提升了2.9 倍和3.4 倍。Lin Min等[93]采用優(yōu)化表面電荷的方法提高了ZHD101耐酸性，通過(guò)引入帶正電荷的賴(lài)氨酸改變ZHD101的活性位點(diǎn)pKa值，發(fā)現(xiàn)突變體M2（Asp157Lys）和突變體M9（Glu171Lys）在酸性條件下催化效率提高；同時(shí)，突變體M8（Asp133Lys）和突變體M9（Glu171Lys）的kcat分別比初始酶提高了2.73 倍和2.06 倍。陳權(quán)等[94]通過(guò)剛化柔性區(qū)域策略改造ZEN水解酶ZHD101的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)突變體Asn156Phe、Ser194Thr和Thr259Phe的熔融溫度升高（ΔTm＞4 ℃），且酶活力與初始酶類(lèi)似甚至更高（相對(duì)酶活力分別為95.8%、131.6%和169.0%）；進(jìn)一步將3 個(gè)突變體進(jìn)行迭代組合突變，發(fā)現(xiàn)Asn156Phe/Ser194Thr的熱穩(wěn)定性最好，Tm較初始酶升高了6.7 ℃。許中霞等[95]通過(guò)在ZHD101分子中引入二硫鍵構(gòu)建7 個(gè)雙點(diǎn)突變體，其中突變體Asp143Cys/Pro181Cys在50 ℃孵育后的殘余酶活力是初始酶的2 倍。

ZEN降解酶的改造還涉及對(duì)底物特異性及降解活性的研究。Xu Zhongxia等[96]將ZHD101中活性中心附近153位的纈氨酸突變?yōu)閹в袠O性殘基的組氨酸（Val153His），提高了其與底物α-玉米赤霉烯醇（α-zearalenol，α-ZOL）的氫鍵相互作用，最終使Val153His對(duì)毒性更強(qiáng)的α-ZOL的降解活性提高了3.7 倍。隨后，Wang Meixing等[97]通過(guò)將ZHD518與ZHD101進(jìn)行序列比對(duì)分析獲得突變體Asn156His，發(fā)現(xiàn)其對(duì)α-ZOL的催化活性提高了3.3 倍，且對(duì)ZEN、α-玉米赤霉醇（α-zearalanol，α-ZAL）、β-玉米赤霉醇（β-zearalanol，β-ZAL）的降解活性也顯著提高。Zheng Yingying等[98]解析了源于Rhinocladiella mackenziei的ZEN降解酶RmZHD的晶體結(jié)構(gòu)，通過(guò)與ZHD101的結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比分析，將160位的酪氨酸突變成體積更小的丙氨酸，使底物結(jié)合口袋具有更大的空間以結(jié)合底物α-ZOL，最終突變體RmZHD對(duì)α-ZOL的水解活性是初始酶的1.7 倍。目前對(duì)黃曲霉毒素脫毒酶、DON脫毒酶也有研究和初步應(yīng)用，為了適應(yīng)工業(yè)化需求，真菌毒素降解酶的改造是近期及未來(lái)的研究熱點(diǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

酶制劑具有催化效率高、專(zhuān)一性強(qiáng)等特點(diǎn)，在食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。從天然來(lái)源中分離出的酶通常在天然條件下非常有效，但在實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用的苛刻條件（極端pH值、極端溫度、極端鹽度、有機(jī)溶劑）下極易失去催化活性。因此，對(duì)天然酶進(jìn)行改造使其適應(yīng)實(shí)際生產(chǎn)需求是目前的研究熱點(diǎn)，也是推動(dòng)酶制劑工業(yè)化應(yīng)用的關(guān)鍵。理性設(shè)計(jì)是目前常用的酶改造方法，其通過(guò)分析現(xiàn)有的結(jié)構(gòu)信息提出可能有效的突變策略，然后利用定點(diǎn)突變技術(shù)引入突變位點(diǎn)，并篩選出活性或者穩(wěn)定性增強(qiáng)的突變體酶，具有功能靶向性高、相比于定向進(jìn)化和半理性設(shè)計(jì)工作量小等優(yōu)點(diǎn)。大量研究結(jié)果表明理性設(shè)計(jì)是提高酶耐酸性的有效策略，基于對(duì)目標(biāo)酶背景的調(diào)查，可采用同源序列比對(duì)、表面電荷優(yōu)化、分子內(nèi)作用力優(yōu)化等策略進(jìn)行突變體設(shè)計(jì)，經(jīng)過(guò)異源表達(dá)、純化驗(yàn)證篩選得到穩(wěn)定性增強(qiáng)的重組酶突變體。但是目前酶的耐酸性改造仍然存在成功率偏低、改造過(guò)程中對(duì)酶催化活性的影響具有不確定性、最適pH值改變幅度小等問(wèn)題；未來(lái)可以進(jìn)一步深化計(jì)算機(jī)輔助突變體設(shè)計(jì)，嘗試綜合多種改造策略，進(jìn)一步提高改造成功率。同時(shí)，基于調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)易受到OTA污染的食品及食品原料的酸度較低，而目前發(fā)現(xiàn)的具有較好實(shí)際應(yīng)用前景的OTA降解酶的最適pH值均為中性或者偏堿性，其活性在偏酸性條件下受到抑制；因此，利用理性設(shè)計(jì)的策略對(duì)目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的OTA脫毒酶進(jìn)行分子改造，使其最適pH值向偏酸性轉(zhuǎn)移，或者增強(qiáng)OTA降解酶的耐酸性，是解決目前OTA降解酶活性作用范圍與實(shí)際脫毒環(huán)境條件不匹配問(wèn)題的關(guān)鍵，也是酶制劑脫毒工業(yè)化推廣的必由之路。