加米霉素注射液對(duì)靶動(dòng)物牛的安全性試驗(yàn)

孫晨明，徐亞亞

（ 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300 ）

牛呼吸道疾?。╞ovine respiratory disease，BRD）是犢牛最常見的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均很高，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。目前研究指出，BRD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，致病性細(xì)菌如溶血性曼氏菌（Mannheimia haemolytica）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、睡眠嗜組織菌（Histophilus somni）和支原體（Mycoplasmaspecies）是導(dǎo)致該病發(fā)病率和死亡率高的主要因素[2]。加米霉素屬于第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，其注射劑在美國(guó)已批準(zhǔn)用于在非泌乳牛治療由溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、睡眠嗜組織菌和牛支原體引起的BRD[3-4]。加米霉素具有吸收快、體內(nèi)分布廣泛、體內(nèi)殘留低和安全性高等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，國(guó)內(nèi)也已成功研制了加米霉素注射劑。本研究參考《VICH獸藥靶動(dòng)物安全性研究指導(dǎo)原則》中針對(duì)牛的安全性評(píng)價(jià)內(nèi)容，進(jìn)行了加米霉素注射液在靶動(dòng)物牛的安全性試驗(yàn)，旨在根據(jù)加米霉素注射液在犢牛多次給藥后的體重、血液學(xué)、血液生化、病理學(xué)檢查和皮下注射刺激性的結(jié)果，綜合評(píng)價(jià)加米霉素注射液在牛的安全性[7]，以期為加米霉素應(yīng)用于臨床治療畜禽相關(guān)疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品與試劑

加米霉素注射液，規(guī)格為50 mL∶7.5 g（15%），批號(hào)為1304001，由齊魯動(dòng)物保健品有限公司生產(chǎn)；瑞士染液、結(jié)晶紫染液、中性紅染液和磷酸鹽緩沖液購(gòu)自默克公司；冰醋酸和氯化鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

日立7150 全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）、Sysmex KX-21血細(xì)胞分析儀（日本Sysmex公司）、生物顯微鏡（德國(guó)Zeiss 公司）；組織切片機(jī)及其他病理學(xué)檢查常用儀器設(shè)備。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

24只日齡、體重一致且具有相似背景的健康犢牛，雌、雄各半，采用耳號(hào)標(biāo)記，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，于試驗(yàn)前1 d經(jīng)獸醫(yī)檢查確認(rèn)處于良好的健康情況。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用多劑量水平給藥進(jìn)行研究，24只犢牛隨機(jī)分為空白對(duì)照組、最大推薦劑量組、3倍最大推薦劑量組和5倍最大推薦劑量組，每組6只，雌、雄各半?？瞻讓?duì)照組犢牛皮下注射0.9%氯化鈉溶液0.2 mL/kg BW，注射體積與5倍最大推薦劑量一致；最大推薦劑量組、3 倍最大推薦劑量組、5 倍最大推薦劑量組犢牛皮下注射加米霉素注射液2、6、10 mL/50 kg BW（即6、18、30 mg/kg BW，以加米霉素計(jì)）。每個(gè)處理組共計(jì)給藥3 次，分別于第0、第5 和第10 d 同一時(shí)間各給藥一次。每次注射后應(yīng)標(biāo)記注射部位，以避免相同部位重復(fù)注射，每個(gè)注射部位的注射體積不大于10 mL。初次注射時(shí)，所有犢牛均于左頸中部皮下注射，用于評(píng)價(jià)注射部位的刺激性。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 臨床觀察

給藥后4 h 內(nèi)每小時(shí)觀察一次，末次給藥后繼續(xù)觀察5 d，除給藥后觀察外，試驗(yàn)期間每天上、下午各觀察1 次。臨床觀察內(nèi)容包括動(dòng)物脫水、排便情況，如是否出現(xiàn)稀糞、軟糞或便秘等，以及精神情況、毛發(fā)狀態(tài)和攝食情況等[8]。

1.3.2 體重

試驗(yàn)期間，于第0 d給藥前及第5、第10和第15 d分別稱量并記錄各處理動(dòng)物體重，計(jì)算增重和平均日增重。

1.3.3 血常規(guī)及血液生化指標(biāo)

試驗(yàn)期間，于第0 d給藥前及第5、第10和第15 d分別采集血液樣品，每頭犢牛采集10 mL，其中5 mL 抗凝血用于血常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，5 mL未抗凝血用于血液生化各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)[9]。

血常規(guī)指標(biāo)包括：白細(xì)胞（WBC）、紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HGB）、血細(xì)胞比容（HCT）、平均血紅蛋白濃度（MCHC）、紅細(xì)胞分布寬度（RDW）、血小板（PLT）。

血液生化指標(biāo)包括：鉀離子（K+）、鈉離子（Na+）、氯離子（Cl-）、氯化鈣（CaCl2）、葡萄糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、直接膽紅素（DBIL）、乳酸脫氫酶（LD）、堿性磷酸酶（ALP）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）。

1.3.4 病理學(xué)檢查

試驗(yàn)期間，所有死亡犢牛均需進(jìn)行尸檢，通過相關(guān)診斷技術(shù)明確死亡原因。試驗(yàn)第15 d 采血后對(duì)所有存活的犢牛進(jìn)行安樂死，進(jìn)行與藥物損傷相關(guān)的眼觀病理學(xué)檢查，采集主要臟器和組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。眼觀和組織病理學(xué)檢查的臟器組織包括：肝臟、腎臟、心臟、脾臟、胃臟、肺臟、胸腺和淋巴結(jié)。

如主要臟器組織的病理學(xué)檢查結(jié)果顯示出與藥物相關(guān)的毒性，則需增加對(duì)其余臟器組織的檢查；若與空白對(duì)照組相比，5 倍最大推薦劑量組未出現(xiàn)與藥物相關(guān)的組織病理學(xué)變化，則最大推薦劑量組和3倍最大推薦劑量組無(wú)須進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3.5 注射部位刺激性

試驗(yàn)期間，分別在第1、第4、第5、第10 d 眼觀評(píng)估初次注射部位，并于第15 d病理學(xué)檢查時(shí)對(duì)注射部位進(jìn)行剖檢，通過眼觀和剖檢對(duì)注射部位評(píng)估[10-11]，評(píng)估分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)比較空白對(duì)照組與各給藥組間各項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的差異顯著性[12]。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛健康情況的影響

試驗(yàn)期間無(wú)犢牛死亡。注射后10 min 時(shí)，3 倍最大推薦劑量組和5倍最大推薦劑量組中個(gè)別犢牛出現(xiàn)注射部位不適，表現(xiàn)為躁動(dòng)不安，后癥狀逐漸緩解。除此之外，試驗(yàn)期間未觀察到與處理相關(guān)的其他異常情況，犢牛精神、飲食與糞便等均良好。

2.2 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛體重的影響（見表2）

由表2 可知，與空白對(duì)照組相比，5 倍和3 倍最大推薦劑量組犢牛的體重增加均稍有減緩，最大推薦劑量組平均日增重最高，但不同階段3個(gè)給藥組犢牛體重與空白對(duì)照組相比差異均不顯著（P＞0.05）。

2.3 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛血常規(guī)及血液生化指標(biāo)的影響（見表3、表4）

表3 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛血常規(guī)指標(biāo)的影響Tab.3 Effects of different doses of gamithromycin on routine indexes of bovine blood in target animals

表4 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛血液生化指標(biāo)的影響Tab.4 Effects of different doses of gamithromycin on blood biochemical indices of target animal cattle

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，各給藥組犢牛血常規(guī)指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。

由表4可知，與空白對(duì)照組相比，各給藥組犢牛血液生化指標(biāo)差異均不顯著（P＞0.05）。

2.4 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛注射部位的影響

眼觀病理學(xué)檢查未觀察到與藥物毒性相關(guān)的病變，空白對(duì)照組與5倍最大推薦劑量組犢牛主要臟器組織病理學(xué)切片見圖1。

圖1 空白對(duì)照組與5倍最大推薦劑量組犢牛主要臟器組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.1 Histopathological sections of major organs of calves in blank control group and five times maximum recommended dose group

由圖1可知，除5倍最大推薦劑量組牛肺輕度瘀血外，其余組織均未觀察到病理學(xué)變化。

2.5 不同劑量加米霉素對(duì)靶動(dòng)物牛注射部位的刺激性評(píng)估

試驗(yàn)期間，3 倍和5 倍最大推薦劑量組中均有個(gè)別犢牛在每次注射后表現(xiàn)出注射部位不適癥狀，觸摸注射部位時(shí)犢牛呈現(xiàn)敏感和輕微的疼痛癥狀，但數(shù)分鐘后即緩解。試驗(yàn)期間給藥組注射部位觀察結(jié)果包括一過性腫脹、發(fā)熱、水腫、疼痛以及注射部位硬度增加。第15 d 對(duì)注射部位進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，眼觀病理變化主要為注射部位皮膚增厚，高劑量組腫脹較明顯，空白對(duì)照組則吸收較迅速。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，空白對(duì)照組與最大推薦劑量組均恢復(fù)良好，3 倍最大推薦劑量組中2 頭犢?？梢杂^察到輕度皮膚增厚，5 倍最大推薦劑量組中4 頭犢牛仍能觀察到注射部位外表稍微腫脹。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，5 倍最大推薦劑量組注射部位肌肉變性、組織纖維化，損傷面積在6 cm2。綜上所述，加米霉素注射液最大推薦劑量在犢牛皮下注射，注射部位具有較好的耐受性。

3 討論

本試驗(yàn)根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則的規(guī)定，設(shè)最大推薦劑量組、3 倍最大推薦劑量組和5 倍最大推薦劑量組以及一個(gè)空白對(duì)照組，按既定的給藥方案皮下注射加米霉素注射液和0.9%氯化鈉溶液，給藥后根據(jù)犢牛臨床表現(xiàn)、體重和增重、血常規(guī)和血液生化指標(biāo)以及眼觀和組織病理學(xué)檢查，綜合評(píng)價(jià)加米霉素注射液的安全性[7]。試驗(yàn)期間所有受試牛存活，除注射后10 min 內(nèi)3 倍和5 倍最大推薦劑量組犢牛出現(xiàn)一過性的注射部位不適外，未觀察到與藥物安全性相關(guān)的其他異常，所有處理組犢牛健康情況均良好。試驗(yàn)各階段，給藥組犢牛體重與空白對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且呈現(xiàn)與劑量相關(guān)的明顯變化趨勢(shì)。給藥組與空白對(duì)照組紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等7項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)以及鉀離子、肌酐和總膽固醇等16項(xiàng)血液生化指標(biāo)均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。組織病理學(xué)檢查顯示，5 倍最大推薦劑量組肺輕度瘀血，除此之外眼觀和組織病理學(xué)檢查均發(fā)現(xiàn)與加米霉素安全性相關(guān)的病理變化。

目前關(guān)于加米霉素在豬和牛的安全性研究相對(duì)較多，無(wú)加米霉素對(duì)肺有損傷的報(bào)道。本試驗(yàn)中對(duì)其余給藥組犢牛肺部進(jìn)行額外的組織病理學(xué)檢查，亦無(wú)病變，因此5倍最大推薦劑量組觀察到的輕度肺瘀血可能與采樣操作、動(dòng)物生理情況等有關(guān)，而非由藥物毒性導(dǎo)致[13-15]。試驗(yàn)期間，3 倍和5 倍最大推薦劑量組犢牛注射部位表現(xiàn)出一過性的刺激，且臨床觀察和病理學(xué)結(jié)果均顯示注射部位刺激性；而最大推薦劑量組和空白對(duì)照組犢牛注射部位均未呈現(xiàn)刺激性，恢復(fù)良好。

4 結(jié)論

加米霉素注射液在靶動(dòng)物犢牛安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，加米霉素注射液按照5倍最大推薦劑量給藥未呈現(xiàn)毒性，按推薦劑量給藥具有較大的安全性；最大推薦劑量皮下注射無(wú)刺激性，3 倍和5 倍最大推薦劑量皮下注射給藥會(huì)對(duì)皮膚產(chǎn)生一定的損傷。