牛結核病診斷方法的研究進展

黃雅琳，李盛瓊，尹 杰，高 露，楊天俊，鄧 兵，陽愛國*，侯 巍*

（ 1. 四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041 ；2. 富順縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，四川 自貢 643200 ； 3. 安州區(qū)動物疫病預防控制中心，四川 綿陽 622651）

牛結核病是一種無季節(jié)流行性、慢性、消耗性的人畜共患病，感染宿主類型較廣，約有50多種哺乳動物和25種禽類可感染此病。牛結核病最易感染奶牛，可通過呼吸道、消化道傳播，妊娠母牛也可經(jīng)過胎盤傳播給胎兒。牛結核病是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）和禽型分枝桿菌（Mycobacterium avium）引起，使肺、乳房、淋巴等多個組織以及器官內(nèi)出現(xiàn)結節(jié)性肉芽腫和干酪性壞死灶，其中最常見的是肺結核，以漸進性消瘦、干咳和呼吸困難為典型癥狀。目前，牛分枝桿菌等引起的牛結核病不會在世界范圍內(nèi)造成嚴重威脅，但感染率仍呈上升趨勢。要控制牛結核病的傳播與流行，需要加強對牛結核病診斷技術的相關研究。本文簡要概述了牛結核病的診斷方法，以期為牛結核病的早期診斷和及時治療提供參考。

1 牛結核病實驗室診斷方法

1.1 細菌學方法

診斷牛結核病的細菌學方法主要包括涂片鏡檢法、細菌培養(yǎng)法等。涂片鏡檢法是一種利用顯微鏡進行的簡單快速檢測方法，但存在敏感性低、檢出陽性率低、無法區(qū)分死菌和活菌等問題。細菌培養(yǎng)法是通過分離培養(yǎng)疑似結核牛代謝物中的細菌，觀察培養(yǎng)細菌的形態(tài)，從而判斷是否為結核桿菌的方法。目前，有研究通過免疫磁分離法（IMS）獲得完整的細胞，便于后續(xù)的PCR或分枝桿菌生長指示管法（MGIT）培養(yǎng)檢測。Stewart 等[1]對使用IMS 處理和未使用IMS 處理的280 個牛淋巴結（206 個可見病變，74個無可見病變）分別進行牛分枝桿菌檢測，結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IMS 分離、富集后，有70.3%無可見病變淋巴結檢測為陽性，未處理的淋巴結僅有2.7%為陽性[1]，進一步說明IMS方法處理樣品能夠有效濃縮目標物，避免基質(zhì)對檢測過程的干擾，縮短檢測時間，提高靈敏度，提高臨床樣本中的牛分枝桿菌檢測陽性率。但結核桿菌對營養(yǎng)需求較苛刻，生長緩慢，并且在初次培養(yǎng)牛型結核分枝桿菌時，需在36～37 ℃條件下培養(yǎng)5～8 w才會出現(xiàn)菌落，因此檢出率低。目前，此類方法檢出率低，實際生產(chǎn)應用較少。

1.2 分子生物學方法

1.2.1 聚合酶反應（PCR）方法

PCR是常用的診斷方法之一，此方法可以快速診斷結核[2]，縮短確診時間，防止疾病廣泛傳播。Akhtar 等[3]對215頭奶牛的奶樣、鼻腔拭子進行牛結核病的PCR檢測，確定了感染分枝桿菌的類型。Courcoul等[4]對牛結核病的細菌學方法、組織病理學方法和PCR等3種檢測方法進行比較，發(fā)現(xiàn)PCR 方法特異性好，與組織病理學方法的敏感性相似，高于細菌學方法的敏感性。此外，PCR 檢測結果與待檢樣品中脫氧核糖核酸（DNA）提取方式也有關。Cornejo等[5]利用C18-羧丙基甜菜堿處理法提取牛奶中的DNA 后進行牛分枝桿菌的PCR 檢測，敏感性為94.1%，高于玻璃微珠法提取方法。但此方法對試驗條件要求較高，分枝桿菌間的相互交叉干擾、樣品中細菌過低過雜等均會造成假性結果。

1.2.2 熒光定量PCR

熒光定量PCR克服了普通PCR存在的一些不足，可作為檢測牛結核病的補充診斷方法，結核病病原菌實時熒光PCR 檢測方法已納入國家標準。Sánchez-Carvajal 等[6]對腸系膜淋巴結、氣管和咽喉淋巴結等新鮮組織樣本進行DNA 提取后進行牛分枝桿菌的實時定量PCR 檢測，結果發(fā)現(xiàn)，此方法敏感性和特異性分別為77.1%和99.4%。

1.2.3 巢式PCR

與常規(guī)PCR 相比，巢式PCR 提高了反應的特異性、靈敏性和準確性。Araújo 等[7]運用以rv2807 為引物的巢式PCR方法檢測腦組織中的結核分枝桿菌，結果發(fā)現(xiàn)AN5株和H37Rv 株的檢測靈敏度在DNA 水平上分別可達到1.5 pg 和6.1 pg，特異性為100%。Carvalho 等[8]運用多重PCR、巢式實時PCR方法分別對198頭牛（尸檢為疑似結核病病變）的結核分枝桿菌進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，2 種方法分別在7%、28%樣本中檢出病原菌，說明巢式實時PCR比多重PCR 方法檢測效率更高。Costa 等[9]運用以IS6110 為引物的半巢式PCR 方法與細菌培養(yǎng)法對來自牛、野豬、鹿和狐貍的128個組織樣本進行比較研究，兩種方法檢測結果的kappa系數(shù)為0.859，半巢式PCR方法檢測敏感性和特異性分別為98.2%和88.7%。

1.2.4 多重PCR

多重PCR可同時檢出多種病原體，具有較高的特異性和敏感性，可用于結核分枝桿菌的快速檢測鑒定，由Chambehian在1988年首次提出。Spositto等[10]對牛分枝桿菌的pncA基因（C169G突變）和結核分枝桿菌的IS6110序列進行多重PCR檢測，成功區(qū)分鑒定了牛分枝桿菌和結核分枝桿菌。有研究對50 頭牛鼻拭子進行DNA 分析，以篩選出的RvD1-Rv2031c 和IS6110 為引物進行多重PCR 檢測，可檢測出牛分枝桿菌和其他非牛分枝桿菌[11-12]，這可作為一種有效的、高度特異的宰前輔助方法應用于牛結核的日常監(jiān)測。Chen 等[13]建立了一種結合多重PCR 和變性高效液相色譜分析的新方法，此方法以分枝桿菌屬特異性16S rRNA 基因序列和結核分枝桿菌的IS6110、IS1081 為引物進行多重PCR檢測，對84株菌株進行了驗證，結果均未觀察到交叉反應。此方法可在1 h內(nèi)對提取純化的DNA完成快速檢測，檢測限值為0.8～1.6 pg。豆玲[14]針對炭疽pX01、布魯氏菌BM21 以及結核菌插入片段IS6110 設計3對特異性引物，建立了布病、炭疽、結核病三重PCR方法，該方法有較好的特異性，并且對炭疽、布魯氏菌以及結核桿菌的敏感性分別在345、313 以及322 fg/μL 以下。多重PCR 對臨床多種病原體混合感染的快速診斷提供了技術支撐。

1.2.5 環(huán)介導等溫擴增反應（LAMP）

LAMP 具有簡單快速、靈敏度高、不與其他分枝桿菌DNA 發(fā)生交叉反應等優(yōu)點。Guo 等[15]分別對結核分枝桿菌hspX、gyrB 和IS6110 等3 個特異性基因進行LAMP 檢測，同時與涂片鏡檢法、實時熒光定量PCR 方法進行比較研究。結果發(fā)現(xiàn)，3 種LAMP 方法的檢測特異性均為100%，其中gyrB-LAMP 法可于1 h 內(nèi)在濃度為60 CFU/mL的H37Rv懸液中檢出結核分枝桿菌，靈敏性與實時熒光定量PCR相似，說明LAMP檢測結核分枝桿菌和實時熒光定量PCR 方法有相似的靈敏度。LAMP 不需要PCR儀和昂貴的試劑，未來具有廣泛的應用前景。

1.3 免疫學方法

1.3.1 牛型提純結核菌素（PPD）皮內(nèi)變態(tài)反應

PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應是最常用的牛結核病診斷方法。此方法成本低，便于在基層推廣，但存在操作過程困難、耗時長、特異性差、重復性差、結果判定主觀性較強、無法鑒別免疫動物和感染動物等問題。此方法的敏感性也會因接種部位不同而變化，Casal 等[16]發(fā)現(xiàn)，在頸前區(qū)進行試驗的陽性結果概率會更高，后面可多考慮在頸前區(qū)部位進行皮試反應，使試驗敏感性最大化。目前，部分地區(qū)將皮內(nèi)變態(tài)反應作為牛結核病的檢疫依據(jù)[17]，此方法減少了檢疫中的交叉反應和假陽性[18]，排除了檢出陽性中包含的非結核分枝桿菌感染和禽結核陽性，提高了特異性。

1.3.2 γ-干擾素（IFN-γ）檢測法

IFN-γ檢測法是一種靈敏度高、特異性強的牛結核病補充檢測方法[19]。該方法直觀性強，重復性好，易于標準化，可區(qū)分牛分枝桿菌和副結核或禽分枝桿菌等感染，是已納入國家標準的牛結核病早期診斷方法。Gan等[20]研究表明，測定血液中γ-干擾素（IFN-γ） mRNA表達水平可確定牛結核病的感染情況，并且RT-qPCR 與ELISA 檢測的相關性較好，準確性高于PPD皮內(nèi)變態(tài)反應。房文斌等[21]運用皮內(nèi)變態(tài)反應、IFN-γ檢測法分別對牛型PPD皮內(nèi)變態(tài)反應陽性牛進行檢測，陽性吻合率分別為81.27%和88.24%；采用γ-干擾素體外檢測法分別對牛型PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應可疑牛40頭、陰性牛24頭進行檢測，檢出陽性率分別為57.5%、20.83%，證明了IFN-γ體外檢測法與比較變態(tài)反應相比具有快速、敏感性高、特異性強、可減少人為因素影響、提高檢測結果準確性的優(yōu)點。Elnaggar 等[22]研究表明，一種ESAT-6、CFP-10 細胞因子的流式細胞術可作為體外檢測IFN-γ 法的替代方法，結核陽性動物在受到PPDB、ESAT-6/CFP-10 刺激后，體內(nèi)的CD4+T（CD45R 0+CD69+）細胞產(chǎn)生IFN-γ，而未感染無變化[22]。但IFN-γ檢測法仍存在一些不足，如IFN-γ測定臨界值的選定對于結果影響很大[23]，檢測成本較高，試驗材料須在采集后盡快在實驗室中刺激培養(yǎng)，操作專業(yè)性較強等。目前，IFN-γ檢測法主要配合皮內(nèi)變態(tài)試驗進行牛結核病平行試驗和系列試驗[24-25]，應用于對皮內(nèi)變態(tài)反應檢出陽性或可疑牛進行復檢。

1.3.3 白細胞介素-2（IL-2）檢測法

IL-2主要由活化的T淋巴細胞釋放，可作為細胞介導免疫反應的指標，也可作為傳染性疾病診斷的潛在生物標志物。也有研究發(fā)現(xiàn)，當特異性分枝桿菌抗原CFP-10-ESAT-6 融合蛋白刺激時，流式細胞術檢測感染牛體內(nèi)CD4+T 細胞分泌IL-2 明顯多于健康動物[26]。此方法比IFN-γ 檢測、IFN-γ 流式細胞術診斷牛結核病的檢測結果符合度高。

1.3.4 ELISA抗體檢測方法

動物感染結核后，病原菌主要引起以細胞免疫為主的免疫應答，體液免疫相對滯后，檢測牛血清抗體的ELISA方法的臨床試驗相對較少，但目前也有研究認為ELISA等抗體檢測方法可作為輔助方法診斷牛結核病。Griffa等[27]試驗發(fā)現(xiàn)，ELISA 抗體檢測重復性高，變異系數(shù)為25%，Pearson 系數(shù)為0.964 8。Cho 等[28]分別以重組MPB70 和SahH（M70S）以及天然20 kda 蛋白（20K）作為抗原建立ELISA 檢測方法，發(fā)現(xiàn)20K-ELISA 的敏感性和特異性分別為94.4%和98.2%，M70S-ELISA 的敏感性和特異性分別為94.4%和97.3%。Joseph 等[29]對123 頭水牛分別通過PPD皮內(nèi)變態(tài)反應、ELISA、PCR等3種試驗方法進行牛結核病檢測，結果發(fā)現(xiàn)，ELISA 和PCR 方法分別檢出陽性率為8.94%和8.13%，ELISA 與PCR 一致性高（kappa 值為0.856），若與皮試變態(tài)反應一起使用，ELISA 和PCR 的敏感性更高，假陰性結果更少。

1.3.5 熒光偏振檢測方法（FPA）

FPA 是通過熒光偏振儀測量由用熒光素標記的膚綴合物發(fā)射光的偏振狀態(tài)以確定抗體是否存在，以確定感染情況。Surujballi 等[30]以熒光素標記的MPB70 蛋白作為抗原進行FPA檢測，結果發(fā)現(xiàn)，在ROC曲線分析建議的截斷點，F(xiàn)PA 檢測的敏感性、特異性分別為92.9%、98.3%，并對副結核分枝桿菌感染動物無交叉反應，后續(xù)可作為檢測牛分枝桿菌感染的準確指標。

1.3.6 其他方法

動物體內(nèi)的淋巴細胞和髓細胞在不同程度上參與了對結核菌的免疫反應，致敏的外周血淋巴細胞在特異性抗原刺激下會產(chǎn)生增殖反應，因此可以測定淋巴細胞增殖的程度，判斷淋巴細胞被特異性抗原致敏的程度以及機體對牛分枝桿菌的細胞免疫狀態(tài)。中性粒細胞也在免疫反應中發(fā)揮了重要作用，感染牛結核病的牛的陽性血清可誘導健康中性粒細胞核固縮、腫脹、凋亡[31]，而未感染的牛無變化，因此中性粒細胞檢測可成為確定牛結核病感染的輔助診斷方法。

此外，有學者認為，分析生物樣本釋放的揮發(fā)性有機化合物（VOCs）可以進行牛結核病診斷。Brebu 等[32]分析了來自羅馬尼亞3 個農(nóng)場的18 頭被診斷患有牛結核病奶牛和來自同一農(nóng)場的27頭牛結核陰性奶牛，對呼吸、糞便和皮膚釋放的VOC 樣本進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析研究。結果發(fā)現(xiàn)：在通過呼吸釋放出80 種VOCs、糞便釋放出200種VOCs、皮膚釋放出80種VOCs 中，共統(tǒng)計分析出了3種試探性呼吸VOC生物標志物、9種糞便VOC生物標志物和3 種試驗性皮膚VOC 生物標志物。但此種方法仍處于初級研究階段，未來可成為牛結核病篩查的另一種診斷方法。

2 牛結核病診斷方法應用現(xiàn)狀

在牛結核病的診斷方法中，細菌學方法已不能滿足臨床檢測診斷牛結核病的需要，不適于基層應用，未被廣泛應用。分子生物學方法一般具備較強的敏感性和特異性，但檢測過程需要特定的儀器設備，檢測技術要求較強，對操作人員以及實驗室條件提出了一定的要求，此類方法主要在實驗室研究中應用。目前，免疫學方法是牛結核病實驗室診斷方法中應用最廣泛的一類方法。大多數(shù)國家也主要采用PPD 皮內(nèi)變態(tài)反應和體外檢測IFN-γ 法聯(lián)合使用進行診斷以確定結核陽性牛。

目前，我國牛結核病主要以“監(jiān)測、檢疫、撲殺和消毒”相結合的方式進行綜合性防治，分類指導、因場施策、逐步凈化，積極開展場群和區(qū)域凈化工作。在我國現(xiàn)階段的檢測方法中，從價格、實用性、準確性等方面出發(fā)，最優(yōu)選的確診方法主要是先用PPD皮內(nèi)變態(tài)反應進行初篩，再通過IFN-γ 檢測法確診，這兩種方法具有互補關系，也是減少牛結核病流行的有效方法。

3 展望

牛結核病呈現(xiàn)宿主范圍廣、感染基數(shù)大、病程緩慢、發(fā)病數(shù)相對較少的特點，給牛生產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成一定的損失。目前，控制牛結核病的主要措施是通過定期對牛群進行檢疫以根除病牛。

雖然世界各國致力于研究開發(fā)牛結核病的新型快速診斷技術，但目前的牛結核診斷的方法可能只適合疫病進展的一個階段，但不一定適用于其他階段，仍缺乏一種敏感、快速、特異性強、精準診斷牛結核病的方法，這對牛結核病的防控造成了困擾。后續(xù)應進一步對牛結核病診斷方法進行研究，以保障畜牧業(yè)健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。