豬乳外泌體中miRNA對豬繁殖與呼吸綜合征的防御作用

奚德鑫，付詩涵，蔡錦順

（ 延邊大學農(nóng)學院，吉林 延吉 133000 ）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種接觸性傳染病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起，俗稱藍耳病。PRRS是一種可導致母豬生育能力下降以及仔豬的呼吸道發(fā)生病變等一系列惡性結果的高危傳染病，特征表現(xiàn)是高發(fā)病率和死亡率、高熱、高病毒血癥以及與其他細菌的合并感染，一旦發(fā)病很難治愈，可對養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟發(fā)展產(chǎn)生嚴重影響。PRRSV的遺傳多樣性非常高，且這種多樣性可能對疫苗的開發(fā)產(chǎn)生嚴重影響，開發(fā)更新和普遍有效的PRRSV 疫苗具有挑戰(zhàn)性[1]。目前分離到的PRRSV 分為美洲型和歐洲型兩種，近年來我國研究者在本土分離到的PRRSV絕大多數(shù)為美洲型，只有極少數(shù)的歐洲型[2]。豬的呼吸道是PRRSV的主要入侵部位，豬群的接觸、繁育等是導致PRRS傳播的主要行為，被污染的豬舍、器械和染病的豬等是PRRS 的主要傳染源，此外，仔豬對PRRSV 比成豬更易感。大量研究表明，斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因而推測是母乳中的一些成分抑制了PRRSV的繁殖。本課題組經(jīng)過前期大量的資料查詢及總結，發(fā)現(xiàn)母乳中存在一部分外泌體，外泌體包裹著大量的miRNA，而有些miRNA又會通過某些通路釋放信號，給細胞一定刺激使其作出反應，進而促進或抑制病毒復制，由此推測可能是母乳中外泌體內(nèi)的miRNA 發(fā)揮了作用抑制了PRRSV 的復制，但目前仍缺乏相關研究?；诖?，文章論述了PRRSV的致病機制及預防研究進展，總結了外泌體中miRNA 的作用機制及對PRRSV 的作用，為后續(xù)豬乳外泌體分離檢測以及篩選出相關miRNA、推進后續(xù)PRRS疫苗研發(fā)提供參考。

1 PRRSV致病機制及預防研究進展

1.1 PRRSV

PRRSV 是一種具有包膜的單鏈陽性RNA 病毒，高度局限于單核細胞或巨噬細胞譜系的細胞，如豬肺泡巨噬細胞（PAM）。由PRRSV 引起的PRRS 是豬中最嚴重的傳染病之一，該疾病的特征是母豬繁殖失敗和呼吸系統(tǒng)問題。由于病毒侵入免疫細胞后會破壞免疫系統(tǒng)，導致免疫抑制，發(fā)生繼發(fā)性細菌感染，并干擾其他商業(yè)疫苗對豬圓環(huán)病毒和經(jīng)典豬瘟病毒的免疫保護作用。而且，在感染PRRSV的豬中還觀察到長期病毒血癥（＞30 d）和抗體依賴性增強現(xiàn)象。PRRSV 通過一系列機制損害豬肺部的局部免疫反應，包括黏膜纖毛轉運系統(tǒng)受損，PAMs的功能和數(shù)量減少，誘導免疫細胞凋亡以及造成促炎細胞因子和抗炎細胞因子之間的不平衡，可能使病毒在宿主中持續(xù)存在。PRRSV還可降低巨噬細胞的殺菌活性，導致對繼發(fā)感染的易感性上升[3]。受感染的豬會產(chǎn)生強烈且快速的體液反應，但這些初始抗體不能提供保護，甚至可能通過介導抗體依賴性增強疾病而對機體有害。相反，中和抗體（NA）的發(fā)育被延遲，細胞介導的免疫反應產(chǎn)生最初是不穩(wěn)定的，如PRRSV 特異性干擾素（IFN-γ）分泌細胞。盡管如此，有效接種疫苗似乎需要誘導強而快速的NA 和IFN-γ反應。PRRSV 可調(diào)節(jié)宿主的免疫反應，抑制關鍵細胞因子，如干擾素-α（IFN-α）；并可能誘導調(diào)節(jié)細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）。NAC 的發(fā)育似乎因糖蛋白5 中存在靠近主要中和表位的誘餌表位而受到損害。這種調(diào)節(jié)宿主免疫反應的能力可能因菌株或分離株而異。

1.2 PRRS的預防相關研究進展

目前，商業(yè)疫苗（改良活疫苗）是效果良好，但其無法誘導高水平的中和抗體，因此不能提供有效的保護，防止PRRSV 感染。此外，這些疫苗還存在其他缺陷，如長期病毒血癥、易與田間菌株重組等。因此，為更好地預防和控制PRRS，還需進一步研究PRRSV的致病機制。以miRNA介導而生產(chǎn)的PRRS 疫苗經(jīng)過大量的研究得到了認證，這種新型疫苗將為PRRS的預防和治療起到關鍵性作用。

miRNA主要參與調(diào)控基因表達，使基因沉默。有研究利用miRNA 沉默技術作為弱化疫苗毒性的一種補充，miRNA 反應原件（MREs）摻入病毒核蛋白質的開放性讀碼框中，由miRNA介導的基因沉默可弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。經(jīng)過大量試驗證明，由miRNA 介導的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。我國目前仍采用以傳統(tǒng)疫苗為主的病毒防治措施，但由于滅活疫苗不能長期抵御PRRSV的侵襲，因而加快開發(fā)和生產(chǎn)非常迫切，而且生物技術疫苗和佐劑等研究也是工作的重點[4]。其中活疫苗預防效果比較好，缺點是缺少交叉保護能力；滅活苗與其他疫苗相比最為安全，但能力不強，不易起效；亞單位疫苗優(yōu)點是妊娠母豬可注射；DNA疫苗可與活疫苗聯(lián)合注射以加強預防效果；載體疫苗目前尚未投入市場[5]。綜上所述，現(xiàn)階段我國尚無一種疫苗可以針對性地預防PRRS，只能通過科學技術手段配合疫苗定向使用。RT-PCR檢測技術和ELISA檢測是目前檢測PRRSV的主要技術手段，RT-PCR檢測技術可檢測毒株類型，ELISA檢測技術則可測出注射疫苗的效果以及宿主體內(nèi)病毒的情況。

林德銳等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用肌肉注射與噴鼻接種的方法，不論是單獨接種豬瘟活疫苗還是同時接種豬瘟活疫苗和HP-PRRSV活疫苗，接種后免疫效果無明顯差異。丁尊俄等[7]發(fā)現(xiàn)，弱毒疫苗和滅活疫苗聯(lián)合免疫的效果明顯優(yōu)于單獨免疫。劉歡歡等[8]發(fā)現(xiàn)，PRRS弱毒活疫苗除了可以抑制PRRSV，還可以減少產(chǎn)生病毒血癥的數(shù)量和持續(xù)時間，減輕呼吸系統(tǒng)疾病和繁殖障礙。王俊等[9]研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的VLPs 疫苗比最大劑量弱毒苗的免疫效果好，且兩者中和抗體的產(chǎn)生量只有細微差別，因此VLPs 疫苗也是一種既安全又高效的預防PRRSV的疫苗。蘇瑋瑋等[10]發(fā)現(xiàn)，微載體懸浮培養(yǎng)技術在HP-PRRSV活疫苗工業(yè)化生產(chǎn)及產(chǎn)品質量控制方面具有顯著的優(yōu)勢。劉曉東等[11]研究發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV弱毒疫苗非常安全，對母豬進行普免后不會引發(fā)不良反應，并且適用于所有豬群。張洪亮等[12]發(fā)現(xiàn)，高致病性PRRSV 活疫苗對類NADC30 PRRSV可提供一定的交叉保護。李少麗等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PRRS 滅活疫苗的加強免疫，尤其與同源性更高的PRRS 二價滅活疫苗聯(lián)合免疫，可加速試驗豬體內(nèi)排毒、提高豬的日增重。但需要注意，在對患病豬進行第一次PRRS 疫苗接種時應做好安全試驗工作，避免出現(xiàn)不良反應[14]。

控制和根除PRRS是一個世界性問題。解決病毒的發(fā)病機制和病毒-宿主相互作用的機制至關重要，是預防和控制病毒的關鍵前提和基礎。由于PRRSV感染導致豬的免疫抑制，因此很難開發(fā)出理想的疫苗產(chǎn)生高水平的中和抗體。利用CRISPR/Cas9技術育種抗病豬、開發(fā)抗病毒分子可能是PRRS 防治的重要方向[15]。Xu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV-ADE 感染顯著增加了線粒體呼吸鏈復合物的表達，并干擾了先天免疫信號、抗病毒蛋白、泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和核糖體的功能，這些發(fā)現(xiàn)為闡明PRRSV-ADE感染的機制、篩選治療ADE 感染的新靶點以及開發(fā)新型PRRSV疫苗提供了新方向。PRRSV減毒疫苗株作為一種單鏈RNA 病毒，可在豬體內(nèi)表達外源蛋白并誘導強烈的免疫反應。Li等[17]研究建立了mAb，可以作為評估重組病毒中p17表達水平的有用工具。此外，間接ELISA方法在特異性和有效檢測重組病毒體內(nèi)抗體水平方面具有巨大潛力，對未來PRRSV的疫苗研究具有重要意義。

2 外泌體中miRNA的作用機制及對PRRSV的作用

2.1 miRNA對病毒的作用機制

在經(jīng)過查閱大量相關資料發(fā)現(xiàn)，miRNA 是高度保守、長度很短的非編碼單鏈核苷酸，miRNA在轉錄后基因表達調(diào)節(jié)中起到重要作用，還可以調(diào)節(jié)病毒與宿主間的相互作用。病毒在侵入細胞后，miRNA能夠通過兩種方式與病毒發(fā)生相互作用，其一是調(diào)控miRNA 的表達控制病毒的增殖；另一種相互作用方式是宿主miRNA 與病毒的RNA 結合，以促進或抑制病毒在體內(nèi)的復制、翻譯等行為，從而改變病毒的致病機制，即通過阻礙病毒mRNA的翻譯以抑制病毒的復制或通過提高病毒mRNA的穩(wěn)定性，進而促進病毒的復制[18]。通過miRNA 能夠靶向病毒的RNA，達到抑制病毒復制的特性，現(xiàn)已成為一種新的抗病毒的防御機制。miRNAs 是基因表達的重要轉錄后調(diào)節(jié)因子，對抗菌反應具有積極作用，同時，由病原體相關分子模式參與的宿主病原體識別受體也在激活針對微生物感染的先天免疫中發(fā)揮關鍵作用，微生物調(diào)節(jié)的miRNA和重要的PRRS信號通路之間的相互作用影響宿主對微生物病原體的免疫反應[19]。而miRNA的運輸則是依靠外泌體完成。

外泌體是一種具有膜結構的囊泡，是常見的膜結合納米囊，由細胞的胞吐作用形成并釋放到細胞間隙中，囊內(nèi)包裹各種核酸和蛋白質等成分，可被靶細胞攝取以達到傳遞信號的作用等，還能夠作為生物標志物、疫苗和藥物載體，并對其進行合理的修飾以進行治療干預[20]。豬乳外泌體中含有非常多的與免疫相關的miRNAs，而且外泌體具有很強的抵抗力。有研究對飼喂初乳的幼豬進行體內(nèi)血清檢測，發(fā)現(xiàn)其miRNA 的表達量遠遠高于飼喂常乳的幼豬，表明這些miRNA可通過外泌體進入幼畜機體內(nèi)；并且初乳中的miRNA 數(shù)量高于常乳，推測動物的母乳可影響幼崽的免疫系統(tǒng)發(fā)育，將miRNA傳遞給新生動物，并發(fā)揮其生物學作用。這些免疫相關的miRNA均會功能性地靶向編碼細胞活素和其他免疫調(diào)節(jié)蛋白，以及免疫反應信號通路上的其他組分等特異性轉錄本，進而行使其免疫調(diào)控功能[21]。

2.2 外泌體中miRNA的作用以及對PRRSV的影響

已有許多研究以miRNA 為基礎對病毒進行干擾、抵抗等，開展了達到防御病毒等目的的試驗。郭雪坤[22]發(fā)現(xiàn)，有25 種可能抑制PRRSV 復制的候選miRNA，其中miR-181 的功能得到了具體驗證。Zheng 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，感染PRRSV 時，豬肺泡巨噬細胞（PAMs）中miR-10a的表達水平升高，并通過下調(diào)宿主分子信號識別顆粒14（SRP14）蛋白的表達而進一步抑制病毒的復制，發(fā)現(xiàn)了一種新的抗PRRSV 感染的IRF8-miR-10a-SRP14 調(diào)控途徑。Shi 等[24]發(fā)現(xiàn)，PRRSV-2 可能劫持宿主miR-541-3p以抑制宿主先天免疫應答，miR-541-3p 能夠通過靶向干擾素調(diào)節(jié)因子7（IRF7）負調(diào)控Ⅰ型干擾素的轉錄，PRRSV-2 感染上調(diào)了miR-541-3p 的表達，從而促進miR-541-3p 在MARC-145 細胞中的復制，進而促進自身復制。還有研究發(fā)現(xiàn)，PRRSV 誘導的miR-218 下調(diào)有助于抑制Ⅰ型干擾素反應，并可能為治療PRRSV 和其他病毒感染提供新的治療靶點[25]。張小霞等[26]研究找到了豬感染PRRSV時潛在的候選lncRNA和靶基因。

有研究者對感染PRRSV豬的血清外泌體進行了鑒定和生物信息學分析，獲得了多種PRRSV 相關途徑和差異表達的miRNA，在PRRSV誘導的免疫應答、侵襲和外泌體攝取中起到潛在作用。此外，由于單個miRNA 可以靶向多個基因，并且單個基因也受到多個miRNA的調(diào)控，因此有許多miRNA在上述途徑中執(zhí)行多種功能。一些miRNA已被驗證可以通過作用于關鍵受體或直接靶向病毒基因組調(diào)節(jié)PRRSV 感染[27]。miR-122 的過表達在轉錄后水平上負調(diào)控SOCS3蛋白的表達水平，導致IFN信號增強并減少病毒復制[28]。

研究表明，PRRSV感染通過延遲中和抗體的形成和細胞因子表達的失調(diào)影響先天性和適應性免疫應答。轉錄因子（TFs）的研究提高了對異?；虮磉_調(diào)控潛在機制的理解。在PRRSV 感染的情況下，TFs 介導PRRSV 的結構和非結構蛋白，用于調(diào)節(jié)炎癥基因表達、免疫細胞、非編碼RNA和其他相關宿主因子以及逃避宿主免疫反應，從而促進病毒復制。TF還有助于清除未被宿主免疫系統(tǒng)消除的病毒并抑制病毒入侵。靶向特定TFs的小分子藥物的使用廣泛用于各種人類疾病的治療；因此，由于其在許多生物過程中的重要性及其在PRRSV感染期間的異?；钚裕琓Fs應被視為未來的治療靶點[29]。

有研究發(fā)現(xiàn)，仔豬中斷奶仔豬感染PRRS 的概率顯著高于成豬和哺乳期仔豬，因此推測是母乳中的一些成分抑制了PRRSV 的繁殖，如母乳中外泌體中的miRNA 發(fā)揮了作用。此前，本課題組進行了提取豬乳中外泌體的試驗，并將提取的外泌體對感染PRRSV的MARC-145細胞進行病毒滴度測定，結果表明，豬乳外泌體中miRNA 可抑制PRRSV復制[30]。

盡管在過去三十年中對PRRS的研究取得了巨大的進展，但對PRRSV 發(fā)病機制的分子和細胞機制的理解仍然有限，一些研究數(shù)據(jù)往往相互矛盾，難以解釋。如最近有大量信息可用于miRNA，一些miRNA 促進PRRSV 復制，而另一些則抑制病毒復制，但其對PRRSV 的致病作用還需進一步研究。PRRS 研究還面臨著一些挑戰(zhàn)和困難，首先，豬缺乏合適的免疫生化試劑和工具，并且豬的許多蛋白質的細胞功能沒有得到適當?shù)谋碚鳌Ｆ浯?，PRRSV缺乏標準化的實驗動物模型。第三，PRRSV的應變變化似乎對宿主反應影響很大。即使在相同的亞型中，不同的PRRSV菌株也可以表現(xiàn)出高序列變異，并顯示出不同的表型。

疫苗研發(fā)方面也沒有利用豬乳外泌體中的miRNA，相關研究人員尚未使用外泌體中miRNA制備PRRS疫苗，只是研發(fā)了一些傳統(tǒng)疫苗但是效果微弱，利用miRNA 沉默技術作為弱化疫苗毒性的一種補充，是現(xiàn)階段疫苗研發(fā)的方向和重點，由miRNA 介導的基因沉默可以弱化病毒活性，產(chǎn)生減毒活疫苗的重配株。大量試驗證明，由miRNA介導的基因沉默新方法弱化的疫苗比傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的疫苗活性更弱，安全性更高。

3 展望

目前，對于miRNA 在抵御病毒方面的研究仍然是一項難題，miRNA 不好把握且數(shù)量較少，尤其是豬乳外泌體中存在的miRNA更甚，但該研究方向的前景很廣，一旦突破將會為PRRS的治療及預防起到幫助，也會為miRNA防御病毒提供參考。更好地了解PRRSV結合反向遺傳學對宿主反應的調(diào)節(jié)可加快研發(fā)新一代以miRNA 為主導的PRRS 疫苗。這種分子方法將填補知識空白，并引導更加精細地了解PRRSV 的發(fā)病機制。隨著科技進步，新型的PRRS疫苗必將在臨床中得到廣泛的應用。