浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯的變化規(guī)律研究

劉濤濤，蔡 凱，熊曉通，劉勝華，黃智安，王 喆*，肖 夢

（勁牌有限公司 勁牌研究院，湖北 黃石 435100）

中國是青梅的發(fā)源地，栽培歷史已有三千多年，青梅酒也成為我國最古老的果酒之一[1]。青梅酒具有清酸的獨特風(fēng)味以及較高的保健功效和營養(yǎng)價值[2-3]，受眾廣泛。隨著人們健康意識的提高，飲酒安全越來越受到重視，青梅酒具有易污染氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）的特點[4]，這使其安全性受到了一定程度的質(zhì)疑，不利于青梅產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。EC天然產(chǎn)生于發(fā)酵食品和酒精飲料中，對人體具有潛在遺傳毒性和致癌性，于2007年被世衛(wèi)組織列為2A類致癌物[5-8]。人類膳食攝入EC的主要來源是酒精飲料[9]，香港特區(qū)食物安全中心根據(jù)市民食物消費量調(diào)查結(jié)果進行風(fēng)險評估后認(rèn)為[10]：對于長期飲用大量酒精飲料的消費者，不能排除因攝入較高分量的EC而可能對健康構(gòu)成風(fēng)險。

我國青梅產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的70%[11]，由于鮮果酸度高，不適合鮮食，廣受歡迎的各類青梅加工品便應(yīng)運而生，青梅酒便是其中之一。目前市售青梅酒有發(fā)酵型青梅酒、浸泡型青梅酒、發(fā)酵型勾兌浸泡型青梅酒[12]，相關(guān)研究主要針對青梅酒感官優(yōu)化工藝技術(shù)，如口感優(yōu)化、香氣優(yōu)化、降酸、脫苦、澄清、護色、催陳等[12-14]，而對其安全研究主要在于EC污染監(jiān)測、降低氰化物含量方法、EC檢測技術(shù)等[4，15-16]，少見對降低青梅酒EC含量的工藝方法研究。除了商業(yè)化青梅酒，青梅酒愛好者的家庭自制青梅酒在我國也很常見，浸泡工藝是其目前廣泛使用的生產(chǎn)方法[14]，但家庭自制時往往過于粗放，如不去核甚至有意劃破表皮、基酒酒精度高低不一、浸泡和陳放時間長、環(huán)境溫度波動大等，產(chǎn)生和過量攝入EC的潛在風(fēng)險較高。因此，本實驗系統(tǒng)研究了多種因素對家庭自制浸泡型青梅酒中EC含量的影響規(guī)律，明確了有效減控EC含量的工藝參數(shù)，用以彌補家庭自制時缺乏針對安全性的工藝優(yōu)化指導(dǎo)且難以進行安全指標(biāo)監(jiān)控的先天不足，為家庭自制青梅酒愛好者科學(xué)制作和安全飲用浸泡型青梅酒提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青梅鮮果（七至八成熟）：福建省詔安縣；96%vol伏特加（特級）：安徽安特食品股份有限公司；60%vol清香型、55%vol米香型、54%vol醬香型和66%vol濃香型白酒原酒（優(yōu)級）：勁牌有限公司；冰糖（單晶）：廣東南字科技股份有限公司。

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（99.50%）、氨基甲酸乙酯-d5標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：德國DR EHRENSTORFER公司；甲醇、甲酸、乙腈（均為色譜純）：美國Sigma公司；氰化物（cyanide，CN）標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/L）：中國計量科學(xué)研究院；氫氧化鈉、酒石酸、磷酸二氫鉀、氯胺T、1,3-二甲基巴比妥酸、異煙酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

E2695-TQ Detector型液質(zhì)聯(lián)用儀：美國Waters公司；Flex2型純水/超純水一體系統(tǒng)：威立雅水處理技術(shù)（上海）有限公司；AB135-S型分析天平：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；FF-QHWL08型全自動酒類氰化物快速測定儀：北京吉天儀器有限公司；iCAP RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 青梅酒制作工藝流程及操作要點

操作要點：

分選：挑選大小均勻（橫向直徑2.0～2.5 cm）、果肉硬實、色澤較青、表皮完好的新鮮青梅。

去蒂、清洗：用鑷子輕挑去蒂，避免破皮；清洗時同樣應(yīng)避免破皮，且末道水使用純凈水，瀝干。

切削：分離果肉和果核。刀具和托盤用前洗凈。切削時應(yīng)避免破壞果核外殼，允許果核外部殘留少許因黏連而分離困難的果肉。流出的且未被污染的汁液盡量回收并歸為果肉。

裝瓶：選擇密封良好的2.5 L規(guī)格玻璃瓶，洗凈、瀝干后分別裝入青梅果肉或果核或整果。

加冰糖：青梅裝瓶后盡快添加冰糖，在頂層青梅處一次性添加。

加漿降度：按目標(biāo)酒精度在高度伏特加或白酒中添加相應(yīng)量純凈水，混勻即為基酒。純凈水用量根據(jù)質(zhì)量守恒原理計算。

加基酒：一次性添加所需基酒，密封后靜置3 d，此過程中冰糖將緩慢溶化，青梅將逐步上浮，以致部分未溶化的冰糖沉底，此時搖瓶助溶。若未加糖，亦在靜置3 d后進行同等程度的搖瓶。靜置15 d后搖瓶混勻一次，之后僅在取樣檢測前進行搖瓶混勻。

靜置：即陳化過程，陳化時避光，且儲存溫度需始終控制在≤25 ℃。

1.3.2 不同因素對酒中EC含量的影響

設(shè)置不同的工藝參數(shù)制作浸泡型青梅酒，考察不同因素對酒中EC含量的影響，具體參數(shù)設(shè)置見表1。

表1 浸泡型青梅酒制備參數(shù)Table 1 Preparation parameters of steeped type greengage wine

（1）原料對EC含量的影響

針對青梅果核、基酒酒精度、冰糖、基酒種類因素，設(shè)置實驗參數(shù)見表1的1#～18#，每組均設(shè)置3個平行樣。

（2）酒、果分離和加糖方式對EC含量的影響

以青梅整果為實驗樣品，設(shè)置3個平行樣，按表1的19#參數(shù)添加青梅和伏特加基酒，不加冰糖，密封；浸泡30 d后分離果渣與酒液；合并3個平行樣的酒液，混勻后均分為3份（即19#、20#、21#），其中第1份不加冰糖，第2份按對應(yīng)青梅鮮果∶冰糖=1∶0.60的質(zhì)量比添加冰糖并搖瓶溶糖，第3份與此前分離出的1/3青梅果渣混合且不加冰糖，每份設(shè)置3個平行樣。

（3）環(huán)境溫度對EC含量的影響

選取表1中已浸泡150 d的15#樣品為實驗對象，分離酒液和果渣，合并3個平行樣的酒液，混勻后分裝至125 mL規(guī)格玻璃瓶，密封；分別置于溫度為1 ℃、12 ℃、20 ℃、37 ℃、50 ℃的避光環(huán)境中存儲30 d，每個溫度條件下設(shè)置3個平行樣。

1.3.3 氨基甲酸乙酯檢測方法

參考熊曉通等[17]的方法，采用液質(zhì)法對青梅酒中氨基甲酸乙酯含量進行測定。

樣品前處理：準(zhǔn)確吸取樣品0.95 mL于1.5 mL離心管中，加50 μL氨基甲酸乙酯-d5內(nèi)標(biāo)使用液，渦旋混勻，置于80～90 ℃烘箱中脫乙醇，待離心管中液面揮至0.4～0.5 mL時取出，冷卻；使用虹吸管加水定容至1 mL，混勻，經(jīng)0.45 μm水系過濾膜過濾后，待上機檢測EC含量。

液相色譜條件：Xselect HSS T3色譜柱（3.5 μm，2.1 mm×100 mm）；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；洗脫方式為梯度洗脫，流速0.3 mL/min，具體程序見表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution procedure

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electron sprayionization，ESI）；掃描模式為正離子模式；霧化器溫度400 ℃；離子源溫度150 ℃；霧化氣流速800 L/h；毛細(xì)管電壓3 kV；錐孔氣體流速100 L/h；碰撞氣流速0.17 mL/min。多反應(yīng)監(jiān)測采集條件見表3。

表3 多反應(yīng)監(jiān)測采集條件Table 3 Acquisition conditions for multiple reaction monitoring

1.3.4 氰化物含量測定

采用流動注射檢測方法，取50 μL試樣于5 mL容量瓶中，用氫氧化鈉溶液（1.0 g/L）定容至刻度混勻，將樣品溶液倒入進樣管中，放到自動進樣器上進樣，測定氰化物含量。

蠕動泵梯度設(shè)置：泵速20 r/min；到達閥時間300 s；注射時間80 s；樣品周期220 s；進樣時間140 s；清洗時間30 s；進樣針清洗時間10 s；加熱模塊1溫度118 ℃；加熱模塊2溫度85 ℃；前端采集增益100 K。

1.3.5 酒精度和銅含量檢測

酒精度采用GB 5009.225—2023《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒和食用酒精中乙醇濃度的測定》中第二法測定；銅含量采用GB 5009.13—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中銅的測定》中第三法測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、圖表制作，采用Origin 9.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果核對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖1a可知，果核酒和整果酒中EC含量均隨著浸泡時間的增加而持續(xù)極顯著地增加（P＜0.01），果肉酒中則先增后減，且三者在≥30 d后的相同時間點的差異均極顯著（P＜0.01）：果肉酒中EC增速極其緩慢（≤7.58 μg/L）且遠(yuǎn)低于果核部位的3 033.89 μg/L，整果酒的EC含量309.96 μg/L則介于果核酒和果肉酒之間。表明浸泡型青梅酒中的EC主要源于青梅果核，且果核的暴露程度越小越有利于減緩EC的增長。

圖1 果核對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯（a）及氰化物（b）含量的影響Fig.1 Effect of kernels on ethyl carbamate (a) and cyanide (b)contents in steeped greengage wine

青梅果核中含有苦杏仁甙，苦杏仁甙在酸性條件下易水解為氫氰酸[18]，而氰化物是酒精飲料中EC的主要前體物質(zhì)之一[7，19-20]。由圖1b可知，果核酒中氰化物含量高且增速快，30 d即達峰值17 968.60 μg/L，而果肉酒中則含量極低（≤29.55 μg/L）且未持續(xù)增長，二者在不同時間點相差約534～1 583倍，這與EC在果核酒、果肉酒中的含量高低表現(xiàn)一致。文獻亦報道通過去果核的方式減少果酒中氰化物的含量，可控制EC的形成[21]，與實驗結(jié)論一致。

2.2 基酒酒精度對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖2可知，各酒樣中EC含量總體上隨著基酒酒精度的提高而極顯著地升高（P＜0.01，僅在60%vol且90 d時P＜0.05），亦隨著浸泡時間的延長而極顯著地升高（P＜0.01）；其中，浸泡150 d后，基酒酒精度為60%vol時酒樣的酒精度為29.9%vol，EC含量高達964.39 μg/L，約是20%vol基酒時（酒樣酒精度為10.2%vol）的4.2倍，約是其自身在浸泡30 d時的4.7倍。這是由于EC是由其前體物質(zhì)與乙醇反應(yīng)生成[22]，更高的乙醇含量可提高反應(yīng)物分子在單位時間內(nèi)的碰撞幾率，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，符合化學(xué)反應(yīng)碰撞理論[23]，因此降低體系酒精度可顯著降低浸泡型青梅酒中的EC累積。

圖2 基酒酒精度對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.2 Effect of alcohol content of base liquor on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.3 冰糖用量對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖3可知，當(dāng)青梅與冰糖比例從1∶0上升至1∶0.15時，各酒樣中EC含量均有增長且≥90 d時增幅顯著，150 d時達到368.55 μg/L，這是由于冰糖溶解后提高了溶液的滲透壓，高滲環(huán)境促使果核中EC前體物質(zhì)加速滲出，繼而轉(zhuǎn)化出更多的EC。繼續(xù)提高冰糖比例，EC含量總體呈顯著或極顯著下降趨勢（P＜0.05或P＜0.01），但這種下降是冰糖用量不斷增大引起體積增大后EC被稀釋所導(dǎo)致。此外，青梅酸度極高，浸泡型青梅酒需要輔以較多的冰糖才具適口性，綜合考量青梅與冰糖的比例介于1∶0.45～1∶0.60為宜。

圖3 冰糖用量對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.3 Effect of crystal sugar addition on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.4 基酒種類對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖4可知，伏特加、清香型白酒、米香型白酒、醬香型白酒、濃香型白酒作為基酒的青梅酒中EC含量均隨著儲存時間的延長而極顯著地增長（P＜0.01）。浸泡150 d后的EC凈增量分別為368.55 μg/L、244.32 μg/L、243.05 μg/L、233.71 μg/L、236.32 μg/L，其中清香型、米香型、醬香型和濃香型白酒作為基酒的酒樣中EC凈增量相近，差異不顯著（P＞0.05）；伏特加基酒中雖未檢出EC，但對應(yīng)酒樣中的EC凈增量卻明顯高于白酒基酒，對比差異極顯著（P＜0.01），可能是因為白酒中某些微量成分具有一定的減緩浸泡型青梅酒中EC轉(zhuǎn)化速率的作用，相關(guān)機理有待進一步研究。此外，濃香型白酒、醬香型白酒酒香濃郁，與青梅酒清爽的香氣調(diào)性匹配度弱于清香型白酒、米香型白酒。綜合考慮，浸泡型青梅酒基酒選擇優(yōu)質(zhì)清香型或米香型白酒為宜。

圖4 不同基酒種類對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.4 Effect of different types of base liquor on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.5 酒、果分離和加糖方式對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖5可知，酒、果分離后，EC含量雖仍隨著浸泡時間的延長而增長，但明顯慢于不分離的酒樣，且是否添加冰糖對EC含量的增速差異在180 d時極顯著（P＜0.01），分離后添加冰糖條件下，180 d時的EC含量（247.61 μg/L）高達酒、果分離初始時（59.67 μg/L）的4.2倍，分離后不添加冰糖條件下則僅約2.1倍；4種酒樣的EC含量在180 d時兩兩之間差異均顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。不分離且不加糖酒樣的EC含量在≤150 d時高于或接近不分離且0 d時就加糖酒樣，這是由于本組實驗青梅與冰糖的比例為1∶0.6，加糖與否的體積相差較大所導(dǎo)致?？傊?，冰糖對浸泡型青梅酒中EC累積起到的作用不限于前述的促進EC前體物質(zhì)滲出，還疊加促進了前體物質(zhì)向EC的轉(zhuǎn)化，對冰糖與伏特加的銅含量進行測定，結(jié)果表明冰糖的含銅量（0.019 2 mg/kg）遠(yuǎn)高于伏特加基酒（未檢出），且銅離子是氰酸鹽向EC轉(zhuǎn)化的重要催化劑[22]。因此及時進行酒、果分離以及推遲冰糖添加時間點對減緩EC增速均有積極作用。

圖5 酒、果分離和加糖方式對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.5 Effect of separation of wine and fruit and method of adding sugar on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

2.6 溫度對浸泡型青梅酒中EC的影響

由圖6可知，與初始值相比，EC含量隨著存儲溫度的上升而非勻速增長，且在≤12 ℃的低溫條件下增速緩慢，差異不顯著（P＞0.05）；20～37 ℃時增速明顯加快，差異極顯著（P＜0.01）；50 ℃的高溫條件下增速更快，差異極顯著（P＜0.01）。這與黃酒[24]、白酒[25]、葡萄酒[26]、發(fā)酵型青梅酒[27]等酒精飲料體系中溫度對EC轉(zhuǎn)化的正相關(guān)影響規(guī)律一致。因此，降低環(huán)境溫度至20 ℃以下可有效減緩浸泡型青梅酒中EC的累積。

圖6 存儲溫度對浸泡型青梅酒中氨基甲酸乙酯含量的影響Fig.6 Effect of storage temperature on ethyl carbamate contents in steeped greengage wine

此外，綜合前文實驗現(xiàn)象可發(fā)現(xiàn)，非冷藏條件下，EC的上升趨勢在實驗周期內(nèi)均未見終止，說明在前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化完畢或達到某種平衡前，EC的上升可能會持續(xù)較長時間，因此即使采取了各種工藝優(yōu)化措施，亦不宜在常溫條件下長時間陳放不去核工藝的浸泡型青梅酒。

2.7 家庭自制浸泡型青梅酒EC污染風(fēng)險評估及防控建議

2.7.1 EC污染風(fēng)險評估

我國尚未制定飲料酒的EC限量標(biāo)準(zhǔn)，參考韓國對青梅酒400 μg/L的EC限量標(biāo)準(zhǔn)[4]進行污染風(fēng)險評估。由圖1～圖6可知，1#去核酒樣的EC超標(biāo)風(fēng)險極小，可忽略不計；其他工藝條件的酒樣隨著時間的延長，均存在EC超標(biāo)風(fēng)險或趨勢。其中，19#和20#酒樣，由于適時進行了酒、果分離，阻斷了果核持續(xù)釋放EC前體物質(zhì)的源頭，實驗周期內(nèi)EC雖仍呈上升趨勢，但速度相對最慢且未超標(biāo)；酒精度的負(fù)面影響最明顯，當(dāng)基酒酒精度≥40%vol時，EC累積速度明顯快于基酒酒精度≤30%vol酒樣，前者在90～150 d內(nèi)超標(biāo)；若加嚴(yán)參考加拿大等國對蒸餾酒150 μg/L的EC限量標(biāo)準(zhǔn)[28-29]，除了1#去核酒樣，其他酒樣在浸泡30～150 d內(nèi)均超標(biāo)。

2.7.2 EC污染防控建議

相較于商業(yè)化青梅酒，家庭自制浸泡型青梅酒更易發(fā)生EC偏高問題，與實際調(diào)查結(jié)果一致[16]。為控制EC生成和減少攝入量，2種浸泡型青梅酒家庭自制工藝和飲用方法推薦見表4，可為自制浸泡型青梅酒提供參考。

表4 浸泡型青梅酒家庭自制工藝和飲用方法推薦Table 4 Suggestions on the process and drinking methods of homemade steeped greengage wine

3 結(jié)論

本研究探討了不同因素作用下浸泡型青梅酒中EC的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)浸泡型青梅酒易污染EC且增速較快，其前體物質(zhì)主要來源于果核。果核暴露程度、酒精度、冰糖添加方式、浸泡及陳放時間、環(huán)境溫度均是影響EC累積的顯著因素；清香型、米香型、醬香型和濃香型白酒作為基酒時的EC新增污染程度相差無幾，但極顯著低于伏特加基酒（P＜0.01）。可見，以當(dāng)前主流家庭自制工藝制作的浸泡型青梅酒具有應(yīng)當(dāng)引起人們重視的食品安全風(fēng)險，去核工藝可一勞永逸的消除該風(fēng)險，否則應(yīng)降低基酒酒精度、推遲加糖時間點、減少浸泡和陳放時間、降低存儲溫度，以達到降低EC含量的目的。