美味牛肝菌湯的熬制工藝及風(fēng)味基料配方研究

楊 豪，楊圓慧，李為蘭，資璐熙，徐檸檬，郭 磊*

（西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

美味牛肝菌（Boletus edulisBull.Fr.）是珍稀的肉質(zhì)大型真菌，在我國主要分布于西部地區(qū)[1-2]。美味牛肝菌兼具食藥用價值，含有蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分及多糖、多酚和黃酮等多種活性成分[3-5]，具有抗氧化、增強免疫力、預(yù)防腫瘤細胞增殖、調(diào)節(jié)腸胃、促消化、清熱解毒、增強機體清除自由基的能力、抑制肥胖等多種生理功能[6-9]。美味牛肝菌的風(fēng)味成分主要由揮發(fā)性的呈香成分和非揮發(fā)性呈味成分組成。揮發(fā)性呈香成分主要包括醇、酮、酸、酯、醛、烴類化合物等，組成了美味牛肝菌的特征風(fēng)味，其中苯甲醛呈現(xiàn)出櫻桃和堅果氣味，己醛呈現(xiàn)出果香、花香、木香和葉香等[10-13]。目前，頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatographymass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）已廣泛應(yīng)用于檢測果蔬中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，具有方便快捷、靈敏度高、選擇性與重復(fù)性好的特點[14-15]。非揮發(fā)性呈味成分主要包括呈味核苷酸、有機酸、可溶性糖等，其中呈味核苷酸和有機酸可增添口感層次，可溶性糖可產(chǎn)生甜味[16-17]。

我國美味牛肝菌資源豐富，固體風(fēng)味基料能夠較好地保持美味牛肝菌特有的天然風(fēng)味，提高人們對食品的接受度，也符合食品工業(yè)健康營養(yǎng)的要求[18-19]。因此，本研究以料液比、熬制溫度、熬制時間為自變量，以蛋白質(zhì)溶出率為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗優(yōu)化美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝；以美味牛肝菌湯凍干粉為基料，采用HS-SPME/GC-MS分析其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成，并采用均勻設(shè)計優(yōu)化美味牛肝菌湯風(fēng)味基料的配方，為美味牛肝菌湯及其固體風(fēng)味基料的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

美味牛肝菌：2022年6月購自云南玉溪易門；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、氯化鈉（均為分析純）：上海勵瑞生物技術(shù)有限公司；食鹽、白砂糖、味精、檸檬酸：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；DZF-6020型真空干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司；YB-250A型高速多功能粉碎機：永康市速鋒工貿(mào)有限公司；UV-VIS 300紫外分光光度計：美國賽默飛世爾科技有限公司；HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：北京康光儀器有限公司；YTLG-12A型真空冷凍干燥機：上海葉拓科技有限公司；7890B氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國Agilent公司；57328-U型50/30 μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 美味牛肝菌湯的熬制工藝流程

美味牛肝菌→清洗→晾干→切片→真空干燥→粉碎→熬煮→菌湯

操作要點[20]：挑選新鮮美味牛肝菌，洗凈后瀝干水分，切成厚度約為0.5 cm的片狀，70 ℃條件下真空干燥8 h，粉碎后過60目篩后備用。取美味牛肝菌粉1 g，按照料液比1∶70（g∶mL）加入去離子水，密封，70 ℃熬制55 min，待熬制試驗結(jié)束后，過濾去渣后得到濾液，即為美味牛肝菌湯。

1.3.2 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

設(shè)置基礎(chǔ)條件為料液比1∶70（g∶mL）、熬制溫度70 ℃、熬制時間55 min，探究不同料液比（1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90（g∶mL））、熬制溫度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃）、熬制時間（35 min、45 min、55 min、65 min、75 min、85 min）對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響。

（2）響應(yīng)面試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以料液比（A）、熬制溫度（B）和熬制時間（C）為自變量，蛋白質(zhì)溶出率（Y1）為響應(yīng)值，使用Design-Expert 13軟件進行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，試驗因素與水平見表1。

表1 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for cooking process optimization of Boletus edulis soup

1.3.3 蛋白質(zhì)溶出率的計算

采用凱氏定氮法[21]對美味牛肝菌中的蛋白質(zhì)總含量進行測定。采用考馬斯亮藍法[22]對菌湯中的可溶性蛋白質(zhì)含量進行測定，計算蛋白質(zhì)溶出率，其計算公式如下：

式中：C1為菌湯中蛋白質(zhì)含量，mg/mL；V1為菌湯體積，mL；M為蛋白質(zhì)總含量，mg。

1.3.4 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

將美味牛肝菌湯凍結(jié)放入真空冷凍干燥機內(nèi)，干燥24 h得美味牛肝菌湯凍干粉。參考FENG T等[23]的HS-SPME-GCMS法略微修改，測定美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

萃取頭老化：采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭，初次使用時需在GC進樣口以250 ℃老化30 min，之后每次使用前均老化10 min。

HS-SPME條件：稱取美味牛肝菌凍干粉樣品0.500 g于20 mL頂空瓶中，在79 ℃條件下萃取28 min后，將老化好的萃取頭插入頂空瓶吸附23 min，然后迅速將萃取頭插入氣相色譜進樣口進行解吸。

GC條件：HP-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為高純氦氣（He），流速1.0 mL/min，不分流模式進樣，進樣口溫度250 ℃。升溫程序為初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫至260 ℃，保持2 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70 eV，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，掃描方式為全掃描，30～400 m/z。

定性、定量分析：經(jīng)美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）Library 14.0譜圖庫檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻報道確定其成分，相對百分含量按峰面積歸一化法計算[24]。

1.3.5 美味牛肝菌湯固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗

以美味牛肝菌凍干粉為基料，參考費英敏等[25]的試驗設(shè)計，以食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、檸檬酸（X4）為輔料，以感官評分（Y2）為評價指標，采用Excel 2021設(shè)計U9（95）均勻試驗優(yōu)化固體風(fēng)味基料的配方，試驗因素與水平見表2。

表2 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.6 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的感官評價

以美味牛肝菌湯凍干粉為原料調(diào)配固體風(fēng)味基料，由10名（男性女性各5名）經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的感官評價人員組成評價小組，從香味、滋味及色澤三個方面對其進行感官評價。在感官評價過程中，對樣品進行隨機編號，使感官評價人員進行獨立客觀的評價，具體感官評分標準見表3[26]。

表3 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料感官評分標準Table 3 Sensory score standards of Boletus edulis solid flavor base material

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均平行測定3次，結(jié)果以“平均數(shù)±標準差”表示。試驗數(shù)據(jù)處理由Excel 2021完成，作圖由Origin 2017和Design-Expert 13完成，方差分析由SPSS 20.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響

料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖1。由圖1可知，美味牛肝菌湯中蛋白質(zhì)溶出率隨料液比的增加呈現(xiàn)先急劇增加后趨于減小的趨勢，當料液比為1∶70時，蛋白質(zhì)溶出率達到最高，為18.11%。料液比越小，美味牛肝菌與溶劑混合越充分、均勻，溶質(zhì)分子更容易分散于溶劑中，有利于蛋白質(zhì)溶出，但原料中蛋白質(zhì)含量是一定的，存在溶解平衡，當料液比持續(xù)減小時蛋白質(zhì)溶出率不會進一步增加，反而會呈現(xiàn)降低的趨勢[27]，故確定最佳料液比為1∶70（g∶mL）。

圖1 料液比對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響Fig.1 Effect of solid and liquid ratio on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.1.2 熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響

熬制溫度對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖2。由圖2可知，隨熬制溫度的升高，美味牛肝菌湯中的蛋白質(zhì)溶出率呈先增大后減小的趨勢，當熬制溫度為70 ℃時，蛋白質(zhì)溶出率達到最大，為18.34%，分析原因可能是由于高溫條件下蛋白質(zhì)會變性造成溶解度下降[28]，故確定最佳熬制溫度為70 ℃。

2.1.3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響

熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響見圖3。由圖3可知，美味牛肝菌湯的蛋白質(zhì)溶出率隨著熬制時間的延長呈先增大后減小的趨勢，當熬制時間為45 min時，蛋白質(zhì)溶出率最大，達18.77%，此時菌湯中含氮化合物含量最高。熬制時間＞45 min后，蛋白質(zhì)溶出率急劇下降，可能是蛋白質(zhì)在長時間熬制下發(fā)生水解反應(yīng)，蛋白質(zhì)的水解速率大于溶出速率[29]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶出率降低，因此，確定最佳熬制時間為45 min。

圖3 熬制時間對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響Fig.3 Effect of cooking time on the protein dissolution rate of Boletus edulis soup

2.2 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立及分析

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以料液比（A）、熬制溫度（B）和熬制時間（C）為自變量，蛋白質(zhì)溶出率（Y1）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 13設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗設(shè)計及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 美味牛肝菌湯熬制工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for cookingprocess optimization of Boletus edulis soup

采用Design-Expert 13軟件對表4結(jié)果進行多元回歸擬合，得到回歸方程：Y1=20.58+1.02A-0.0375B+0.02C+0.645AB-0.035AC+0.26BC-2.05A2-1.7B2-0.745 5C2。

由表5可知，該模型顯著（P＜0.05），失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型具有較強的統(tǒng)計學(xué)意義。由P值可知，一次項A，二次項A2、B2、C2對蛋白質(zhì)溶出率的影響極顯著（P＜0.01），交互項AB對蛋白溶出率影響顯著（P＜0.05），其他項對蛋白質(zhì)溶出率影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率影響的大小順序為料液比（A）＞熬制溫度（B）＞熬制時間（C）。

2.2.2 各因素間交互作用分析

采用Design-Expert 13軟件繪制料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)面及等高線圖見圖4。

圖4 料液比與熬制溫度間交互作用對蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.4 Response surface plot and contour lines of effects of interaction between solid and liquid ratio and cooking temperature on protein dissolution rate

由圖4可知，料液比和熬制溫度間交互作用對美味牛肝菌湯蛋白質(zhì)溶出率影響的響應(yīng)面陡峭，等高線呈橢圓形，說明其對菌湯蛋白質(zhì)溶出率的影響顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 驗證試驗

采用Excel 2021對回歸方程進行求解，得美味牛肝菌湯熬制的最佳工藝條件為料液比1∶73.69（g∶mL）、熬制溫度68.76 ℃、熬制時間53.10 min，此條件下蛋白質(zhì)溶出率預(yù)測值為20.10%?？紤]實際操作，將試驗條件調(diào)整為料液比1∶74（g∶mL）、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min，在此條件下蛋白質(zhì)溶出率實際值為20.12%，與理論值相差0.02%，說明該回歸模型與實際試驗過程匹配度高，可以有效地優(yōu)化美味牛肝菌的熬制工藝。

2.3 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

采用HS-SPME-GC-MS對美味牛肝菌湯凍干粉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進行分析，結(jié)果見表6。

表6 美味牛肝菌湯凍干粉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析結(jié)果Table 6 Results of volatile flavor components of Boletus edulis soup lyophilized powder analyzed by GC-MS

由表6可知，從美味牛肝菌湯凍干粉中共檢測出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中烴類4種、醇類1中、醛類4種、酮類5種、酸類1種、酯類2種、醚類1種、含硫化合物3種及含氮化合物8種。酮類化合物相對含量（31.66%）最高，其次為含氮化合物（26.46%）和酸類化合物（19.00%）。美味牛肝菌湯凍干粉中揮發(fā)性C8化合物和含硫化合物因含量豐富、識別閾值較低，且對食用菌的風(fēng)味品質(zhì)影響較大，被認為是食用菌中的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[30]。在檢測到的C8化合物中，苯乙醛是具有類似水果的香氣[31]，相對含量為0.93%。含硫化合物主要有2-異丁基5-丙基噻吩（4.58%）、3-甲硫基丙醛（0.45%）和甲硫醇（0.36%）。吡嗪類化合物相對含量為1.67%，是羰基化合物與氨基化合物在一定條件下發(fā)生美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物[32]。

2.4 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗

以美味牛肝菌湯凍干粉為基料，食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）和檸檬酸（X4）為輔料，感官評分（Y2）為評價指標，通過均勻試驗U9（95）優(yōu)化配方，結(jié)果見表7，方差分析見表8。

表7 美味牛肝菌固體風(fēng)味基料配方優(yōu)化均勻試驗設(shè)計及結(jié)果Table 7 Design and results of uniform tests for formula optimization of Boletus edulis solid flavor base material

表8 均勻試驗結(jié)果的方差分析Table 8 Variance analysis of uniform tests results

采用Excel 2021對表7試驗結(jié)果進行線性回歸分析，得到食鹽（X1）、白砂糖（X2）、味精（X3）、檸檬酸（X4）對感官評分（Y2）的線性回歸方程：Y2=92.847+6.672X1-2.193X2+3.127X3-4.934X4。由表8可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），表明建立的回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。決定系數(shù)R2=0.996，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.986，說明該數(shù)學(xué)模型與試驗結(jié)果擬合較好[33]。根據(jù)t檢驗可知，影響固體風(fēng)味基料感官評價的因素主次順序為X1＞X4＞X2＞X3。對回歸方程求解得到美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的最優(yōu)配方為：食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%，在此條件下預(yù)測得到的感官評分為93.13分。通過驗證試驗得固體風(fēng)味基料感官評分為93.22分，與理論值相差0.09，制備得到的固體風(fēng)味基料顏色成淺棕褐色，具有濃郁的美味牛肝菌風(fēng)味，表明所建立的模型與試驗結(jié)果具有較好的一致性，能夠?qū)腆w風(fēng)味基料配方進行優(yōu)化。

3 結(jié)論

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到美味牛肝菌湯的最佳熬制工藝為料液比1∶74（mL∶g）、熬制溫度70 ℃、熬制時間50 min，在此條件下的蛋白質(zhì)溶出率達20.12%。通過HS-SPME/GC-MS鑒定美味牛肝菌湯凍干粉，共檢出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，酮類化合物（31.66%）、含氮化合物（26.46%）和酸類（19%）是相對含量最高的三類。以菌湯凍干粉為基料，采用均勻設(shè)計研制出美味牛肝菌固體風(fēng)味基料的最佳配方為食鹽4.5%、白砂糖3.0%、味精1.8%、檸檬酸0.1%，制備得到的固體風(fēng)味基料顏色成淺棕褐色，具有濃郁的美味牛肝菌風(fēng)味，感官評分為93.22分。本研究結(jié)果為美味牛肝菌深加工及風(fēng)味調(diào)味料的研究奠定一定的理論基礎(chǔ)，有著廣闊的市場發(fā)展前景。