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    大腸桿菌胞內L-丙氨酸響應型啟動子的篩選與表征

    2023-11-06 09:05:36聶玉朋徐建中劉立明姜國政王深鏢田延軍
    中國釀造 2023年10期

    聶玉朋,徐建中,劉立明,劉 佳,徐 慧,姜國政,楊 奕,王深鏢,田延軍*

    (1.齊魯工業(yè)大學(山東省科學院)山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設計院,山東 濟南 250014;2.江南大學 生物工程學院工業(yè)生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122;3.江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫 214122;4.煙臺恒源生物股份有限公司,山東 煙臺 265709)

    L-丙氨酸(L-alanine,L-Ala),又稱L-α-氨基丙酸,是人體血液中含量最高的中性氨基酸,被廣泛應用于醫(yī)藥、食品和日化領域[1-2]。L-丙氨酸是美國食品和藥品管理局批準的食品添加劑和營養(yǎng)補充劑[3],用于食品中可以起到增甜提鮮的作用[4];作為一種藥物成分,L-丙氨酸是維生素B6、索非布韋、醋酸格拉替雷等眾多藥品的生產原料,也可用于氨基酸輸液[5-6];此外,L-丙氨酸還被廣泛用作頭發(fā)和皮膚的調理劑,也被用作化妝品和一些個人護理產品的成分[6]。以L-丙氨酸為原料生產新型螯合劑甲基甘氨酸二乙酸(methylglycine-N,N-diacetic acid,MGDA),可替代洗滌劑中的含磷螯合劑,其在水中可以自然降解,避免了對環(huán)境產生的負面影響[7-8]。

    微生物發(fā)酵法生產成本低、反應條件溫和,已成為L-丙氨酸生產的主流方式[9-10]。目前用于L-丙氨酸發(fā)酵生產的主要菌株是大腸桿菌(Escherichia coli)[11-12],其次是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)[13-14]。相比于其他的微生物,大腸桿菌具有遺傳背景清晰、基因改造技術成熟、繁殖速度快和發(fā)酵周期短等優(yōu)點[15-16]。目前,高產L-丙氨酸大腸桿菌細胞工廠的構建主要是通過在大腸桿菌中引入異源的丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase,ADH),丙氨酸脫氫酶可高效催化丙酮酸、氨(NH4+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)生成L-丙氨酸[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)[19],發(fā)酵液中L-丙氨酸的積累會降低大腸桿菌細胞的比生長速率,且異源丙氨酸脫氫酶的高效表達會對菌體造成代謝負擔。ZHOU L等[20]設計了一種溫度調節(jié)的遺傳開關來動態(tài)控制丙氨酸脫氫酶的表達,將發(fā)酵分為細胞生長和L-丙氨酸生產兩個階段,實現(xiàn)了發(fā)酵過程的動態(tài)調控,發(fā)酵40 h,L-丙氨酸產量達120.8 g/L。目前,已有研究報道了響應L-纈氨酸[21]和L-異亮氨酸[22]等氨基酸的生物傳感器,但尚未發(fā)現(xiàn)響應L-丙氨酸的生物傳感器。

    利用轉錄組測序技術篩選響應天然產物的啟動子已經(jīng)是一種比較成熟的啟動子建庫策略[23-24]。LIANG G J等[25]在光滑假絲酵母中利用轉錄組分析篩選得到了響應L-蘋果酸的Pcgr-10啟動子元件,并以此構建了響應L-蘋果酸的動態(tài)調控系統(tǒng),提高了L-蘋果酸產量;汪舒穎等[26]在單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)中利用轉錄組分析篩選到了在厭氧條件下高效表達的Pan4啟動子,用于調控天青蛋白和θ毒素表達。本研究對90 g/LL-丙氨酸壓力下培養(yǎng)的大腸桿菌(Escherichia coli)進行比較轉錄組測序分析,篩選在L-丙氨酸壓力下顯著上調基因的啟動子,利用mKate熒光蛋白進行表征,添加10 g/L的L-丙氨酸進行誘導,從中篩選出響應L-丙氨酸的啟動子,并通過測定不同濃度L-丙氨酸和不同種類氨基酸誘導下啟動子的相對熒光強度,評估啟動子的靈敏性與特異性。本研究旨在從大腸桿菌中篩選出特異性響應L-丙氨酸的啟動子元件,為后續(xù)L-丙氨酸動態(tài)響應系統(tǒng)的構建奠定基礎。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株、質粒和引物

    大腸桿菌(E.coli)W3110、E.coliJM109、質粒pTET:由本實驗室保藏。本研究所用引物如表1所示。

    表1 本研究所用引物Table 1 Primers in the study

    1.1.2 化學試劑

    限制性內切酶、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)Marker、Prime Star高保真酶、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶:大連寶生物工程公司;ClonExpress II One step cloning kit:南京諾唯贊生物科技有限公司;細菌基因組提取試劑盒、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、產物純化試劑盒、氯霉素(分析純):上海生工生物工程技術有限公司;L-丙氨酸(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母粉、蛋白胨(均為生化試劑):英國Oxoid公司;其他試劑來自國藥集團化學試劑有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基:酵母粉5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,NaCl10.0g/L,pH自然,121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

    LB固體培養(yǎng)基:酵母粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH自然,121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

    氯霉素抗性平板:酵母粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH自然,121 ℃條件高壓滅菌20 min后,添加終質量濃度為30 μg/mL的氯霉素。

    1.2 儀器與設備

    CFX96聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)儀、Gel Doc凝膠成像儀:美國Bio-Rad公司;BEP-600核酸電泳儀:北京伯蘭特生物科技有限公司;ZQZY-AF8恒溫調速搖床:上海知楚儀器有限公司;5804R冷凍離心機:德國Eppendorf公司;SpectraMaxRM3多功能酶標儀酶標儀:美國Molecular Devices公司。

    1.3 方法

    1.3.1 質粒和基因組的提取

    細菌質粒DNA提取方法參照上海生工生物工程技術有限公司細菌質粒提取試劑盒相關操作說明,基因組提取參照上海生工生物工程技術有限公司細菌基因組提取試劑盒相關操作說明。

    1.3.2 轉錄組測序

    將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌分別在非脅迫(未添加L-丙氨酸的LB培養(yǎng)基)和脅迫(添加90 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基)條件下接種,初始OD600nm值為0.1[27]。培養(yǎng)6 h后,4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集細胞,然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌兩次,在液氮中快速冷凍,并送到蘇州金唯智生物科技有限公司進行轉錄組分析。

    1.3.3 重組質粒構建

    以pTET質粒為模板,pTET-mKate-1/pTET-mKate-2為引物,PCR擴增線性載體,PCR擴增體系:模板DNA 2 μL,Prime Star高保真酶50 μL,引物1、引物2各2 μL,雙蒸水(ddH2O)44 μL。PCR擴增程序:94 ℃預變性10 min,循環(huán)程序(94 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 000 bp/min),循環(huán)程序運行29次,后延伸72 ℃,5 min。將PCR擴增后的產物膠回收后得到線性化載體片段。以E.coliW3110基因組為模板,擴增目的基因前500 bp片段,膠回收后得到目的片段產物。

    使用同源重組酶連接線性化載體片段和目的片段,制作JM109化轉感受態(tài)細胞,將連接好的質粒利用化學轉化法轉入JM109感受態(tài)細胞中,37 ℃、200 r/min搖床孵育1 h后,5 000 r/min離心5 min后去掉上清,用剩余少許培養(yǎng)基將菌體重懸,涂至含有氯霉素抗性的LB固體平板上。挑選氯霉素抗性平板上長出的單菌落,以引物CX-P-1/CX-P-2進行菌落PCR驗證,驗證成功的單菌落送于天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功的質?;D入E.coliW3110中進行下一步試驗。

    1.3.4 24孔板培養(yǎng)

    24孔板裝液量為2 mL,將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種以2%的接種量接入24孔板的LB培養(yǎng)基中(含不同質量濃度的L-丙氨酸),37 ℃、600 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。

    1.3.5 相對熒光強度測定

    取1 mL待測樣品,8 000 r/min離心1 min,用相同體積的PBS清洗兩次,然后用PBS稀釋OD600nm值在0.4~0.6左右,取200 μL稀釋后樣品加入黑色避光的酶標板中,使用酶標儀測量熒光強度,設定激發(fā)波長為588 nm,發(fā)射波長為645 nm,并測定OD600nm值,根據(jù)熒光強度和OD600nm值的比值計算相對熒光強度[27]。

    1.3.6 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進行整理和分析,使用Origin 2021作圖。

    2 結果與分析

    2.1 L-丙氨酸壓力下高轉錄啟動子的篩選

    轉錄水平在L-丙氨酸壓力下比正常條件下升高基因的啟動子可能是由L-丙氨酸驅動的啟動子[28]。從測序結果給出的差異表達基因分析列表中,選擇轉錄水平較對照組提高水平靠前的10個基因(ArgK,F(xiàn)lgG,GlgP,CpxP,BetA,GlpA,KdpB,PulG,LivH和YhfX)作為候選基因,結果見圖1。

    圖1 十個候選啟動子的差異表達Fig.1 Differential expression of ten candidate promoters

    由圖1可知,轉錄水平提高最多的基因為KdpB,轉錄水平差異為6.66,其次是FlgG,轉錄水平差異為6.08。

    使用蛋白質直系同源簇數(shù)據(jù)庫(cluster of orthologous groups of proteins,COG)查詢分析10個候選基因的基因功能,結果見表2。由表2可知,該10個基因的功能分別屬于細胞運動和分泌、氨基酸運輸與代謝、碳水化合物運輸和代謝、無機離子轉運和代謝和能量產生和轉化,將這10個基因的啟動子分別編號為PAla-7~PAla-10。

    表2 10個轉錄水平提高的基因Table 2 10 genes with increased transcriptional level

    2.2 熒光報告菌株的構建

    為了構建含有紅色熒光蛋白基因的質粒,以pTET質粒作為骨架質粒,以實驗室已有的mKate基因片段為模板[29],設計含同源臂的引物mKate-1和mKate-2擴增mKate基因片段,得到目的基因片段;以含有同源臂的引物pTET-1和pTET-2擴增pTET質粒,得到線性化載體片段,按方法1.3.3進行質粒構建。挑選五個氯霉素抗性平板上長出的pTETmKate質粒重組菌單菌落進行菌落PCR驗證,結果見圖2。由圖2可知,1號、2號、4號和5號泳道PCR擴增產物堿基長度約為1 000 bp,與mKate基因大小相符,說明mKate基因成功連接到了pTET質粒上。將菌落PCR驗證正確的菌株送至天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功后得到pTET-mKate質粒。

    圖2 pTET-mKate質粒重組菌菌落PCR驗證Fig.2 PCR verification of pTET-mKate plasmid recombinant colony

    基因的前500 bp可能包含潛在的啟動子序列,為了更直觀的表征啟動子的轉錄水平,篩選響應L-丙氨酸濃度的啟動子,通過京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和美國國家生物技術信息中心數(shù)據(jù)庫(national center of biotechnology information,NCBI)查詢并預測10個候選基因前500 bp含有潛在啟動子的序列。以E.coliW3110的基因組為模板,設計同源臂引物,將轉錄組分析篩選出的10個候選基因的前500 bp進行擴增,利用同源重組連接pTET-mKate質粒的紅色熒光蛋白基因mKate,質粒圖譜見圖3。由圖3可知,將10個候選基因的啟動子序列插入到mKate基因前面,即可得到不同啟動子控制的mKate基因表達質粒。

    圖3 熒光蛋白表達質粒構建Fig.3 Construction of fluorescent protein expression plasmid

    挑取氯霉素抗性平板長出的單菌落進行菌落PCR鑒定,結果見圖4。由圖4可知,PCR擴增產物堿基長度約為1500bp,說明500 bp的啟動子片段成功連接到了pTET-mKate質粒上。將驗證成功的菌株送至天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功后提取重組質?;瘜W轉化入E.coliW3110感受態(tài)細胞中,所獲得的菌株分別命名為P1~P10。

    圖4 重組菌株啟動子菌落PCR驗證Fig.4 PCR verification of recombinant strains promoter colony

    2.3 重組菌株相對熒光強度測定

    為了比較不同菌株在L-丙氨酸壓力下的相對熒光強度,將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌株接種到未添加L-丙氨酸和添加10 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)8 h后取樣測定熒光強度和OD600nm值,通過熒光強度和OD600nm值的比值計算相對熒光強度,結果見圖5。由圖5可知,PAla-4、PAla-8和PAla-10啟動子顯示出了較高的相對熒光強度,在不添加L-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后,相對熒光強度分別達到1 421、1 121和1 226,但是在添加10 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,相對熒光強度分別下降了21.2%、18.4%和51.5%,說明PAla-4、PAla-8和PAla-10啟動子并不會響應L-丙氨酸濃度來提高基因的轉錄水平。PAla-7和PAla-9啟動子的熒光報告菌株在添加10g/LL-丙氨酸壓力下的相對熒光強度均高于未添加L-丙氨酸,分別是未添加L-丙氨酸相對熒光強度的1.5倍和3.8倍。其他啟動子菌株在添加10 g/LL-丙氨酸壓力下的相對熒光強度均低于未添加L-丙氨酸,可能是L-丙氨酸會抑制熒光蛋白基因的表達。因此,選擇PAla-7和PAla-9啟動子進行下一步的評估驗證。

    圖5 10個啟動子菌株在10 g/L L-丙氨酸質量濃度下相對熒光強度比較Fig.5 Comparison of relative fluorescence intensity of 10 promoters strains at mass concentration of 10 g/L L-alanine

    2.4 啟動子響應L-丙氨酸濃度的靈敏性分析

    將含有PAla-7和PAla-9啟動子的菌株P7和P9分別接種到添加0~60 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中進行誘導,觀察PAla-7和PAla-9啟動子對不同L-丙氨酸濃度響應的靈敏性,結果見圖6。

    圖6 PAla-7和PAla-9啟動子在不同L-丙氨酸質量濃度下相對熒光強度比較Fig.6 Comparison of relative fluorescence intensity of PAla-7 and PAla-9 promoters at different L-alanine mass concentrations

    由圖6可知,在不同濃度L-丙氨酸的誘導下,PAla-9啟動子并未隨著L-丙氨酸濃度的增加而增加。在不同濃度L-丙氨酸的誘導下,PAla-7啟動子的相對熒光強度隨著L-丙氨酸濃度的而增加,相對于未添加L-丙氨酸,添加10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L和60 g/LL-丙氨酸誘導后的相對熒光強度分別增加了49%、122%、181%、275%、432%和705%,PAla-7啟動子在0~60 g/LL-丙氨酸誘導下顯示出了良好的靈敏性。

    2.5 啟動子響應L-丙氨酸濃度的特異性分析

    為了分析PAla-7啟動子是否對L-丙氨酸具有特異性響應,選擇11種常見的氨基酸(甲硫氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸)分別進行誘導。將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌株P7接種至含10 g/L和20 g/L的不同氨基酸的LB培養(yǎng)基中,測定誘導后的相對熒光強度,結果見圖7。由圖7可知,L-丙氨酸誘導質量濃度從10 g/L增加到20 g/L時,相對熒光強度增加了52.4%,而其他氨基酸隨著濃度的增加,相對熒光強度并沒有隨著有明顯的增加。因此,PAla-7啟動子對L-丙氨酸具有特異性響應。

    圖7 PAla-7啟動子在不同種類氨基酸下相對熒光強度比較Fig.7 Comparison of relative fluorescence intensity of PAla-7 promoter under different kinds of amino acids

    3 結論

    通過對不同質量濃度L-丙氨酸壓力下的大腸桿菌進行轉錄組學分析,從中篩選了可能是L-丙氨酸誘導的10個候選基因的啟動子。隨后,利用紅色熒光蛋白進行表征,篩選得到了特異性響應L-丙氨酸濃度的PAla-7啟動子,該啟動子在0~60 g/LL-丙氨酸范圍內具有良好的靈敏性。值得注意的是,其余啟動子雖不能響應L-丙氨酸濃度表達,但可作為組成型啟動子,用于后續(xù)啟動子優(yōu)化、調控基因表達水平和平衡代謝流等研究。該研究篩選得到的PAla-7啟動子可作為生物傳感器的調控元件,也為后續(xù)L-丙氨酸動態(tài)調控系統(tǒng)的構建提供了理論基礎。

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