聶玉朋,徐建中,劉立明,劉 佳,徐 慧,姜國政,楊 奕,王深鏢,田延軍*
(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院,山東 濟南 250014;2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室,江蘇 無錫 214122;3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室,江蘇 無錫 214122;4.煙臺恒源生物股份有限公司,山東 煙臺 265709)
L-丙氨酸(L-alanine,L-Ala),又稱L-α-氨基丙酸,是人體血液中含量最高的中性氨基酸,被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和日化領(lǐng)域[1-2]。L-丙氨酸是美國食品和藥品管理局批準(zhǔn)的食品添加劑和營養(yǎng)補充劑[3],用于食品中可以起到增甜提鮮的作用[4];作為一種藥物成分,L-丙氨酸是維生素B6、索非布韋、醋酸格拉替雷等眾多藥品的生產(chǎn)原料,也可用于氨基酸輸液[5-6];此外,L-丙氨酸還被廣泛用作頭發(fā)和皮膚的調(diào)理劑,也被用作化妝品和一些個人護理產(chǎn)品的成分[6]。以L-丙氨酸為原料生產(chǎn)新型螯合劑甲基甘氨酸二乙酸(methylglycine-N,N-diacetic acid,MGDA),可替代洗滌劑中的含磷螯合劑,其在水中可以自然降解,避免了對環(huán)境產(chǎn)生的負面影響[7-8]。
微生物發(fā)酵法生產(chǎn)成本低、反應(yīng)條件溫和,已成為L-丙氨酸生產(chǎn)的主流方式[9-10]。目前用于L-丙氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的主要菌株是大腸桿菌(Escherichia coli)[11-12],其次是谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum)[13-14]。相比于其他的微生物,大腸桿菌具有遺傳背景清晰、基因改造技術(shù)成熟、繁殖速度快和發(fā)酵周期短等優(yōu)點[15-16]。目前,高產(chǎn)L-丙氨酸大腸桿菌細胞工廠的構(gòu)建主要是通過在大腸桿菌中引入異源的丙氨酸脫氫酶(alanine dehydrogenase,ADH),丙氨酸脫氫酶可高效催化丙酮酸、氨(NH4+)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NADH)生成L-丙氨酸[17-18]。有研究發(fā)現(xiàn)[19],發(fā)酵液中L-丙氨酸的積累會降低大腸桿菌細胞的比生長速率,且異源丙氨酸脫氫酶的高效表達會對菌體造成代謝負擔(dān)。ZHOU L等[20]設(shè)計了一種溫度調(diào)節(jié)的遺傳開關(guān)來動態(tài)控制丙氨酸脫氫酶的表達,將發(fā)酵分為細胞生長和L-丙氨酸生產(chǎn)兩個階段,實現(xiàn)了發(fā)酵過程的動態(tài)調(diào)控,發(fā)酵40 h,L-丙氨酸產(chǎn)量達120.8 g/L。目前,已有研究報道了響應(yīng)L-纈氨酸[21]和L-異亮氨酸[22]等氨基酸的生物傳感器,但尚未發(fā)現(xiàn)響應(yīng)L-丙氨酸的生物傳感器。
利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選響應(yīng)天然產(chǎn)物的啟動子已經(jīng)是一種比較成熟的啟動子建庫策略[23-24]。LIANG G J等[25]在光滑假絲酵母中利用轉(zhuǎn)錄組分析篩選得到了響應(yīng)L-蘋果酸的Pcgr-10啟動子元件,并以此構(gòu)建了響應(yīng)L-蘋果酸的動態(tài)調(diào)控系統(tǒng),提高了L-蘋果酸產(chǎn)量;汪舒穎等[26]在單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)中利用轉(zhuǎn)錄組分析篩選到了在厭氧條件下高效表達的Pan4啟動子,用于調(diào)控天青蛋白和θ毒素表達。本研究對90 g/LL-丙氨酸壓力下培養(yǎng)的大腸桿菌(Escherichia coli)進行比較轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選在L-丙氨酸壓力下顯著上調(diào)基因的啟動子,利用mKate熒光蛋白進行表征,添加10 g/L的L-丙氨酸進行誘導(dǎo),從中篩選出響應(yīng)L-丙氨酸的啟動子,并通過測定不同濃度L-丙氨酸和不同種類氨基酸誘導(dǎo)下啟動子的相對熒光強度,評估啟動子的靈敏性與特異性。本研究旨在從大腸桿菌中篩選出特異性響應(yīng)L-丙氨酸的啟動子元件,為后續(xù)L-丙氨酸動態(tài)響應(yīng)系統(tǒng)的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。
1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物
大腸桿菌(E.coli)W3110、E.coliJM109、質(zhì)粒pTET:由本實驗室保藏。本研究所用引物如表1所示。
表1 本研究所用引物Table 1 Primers in the study
1.1.2 化學(xué)試劑
限制性內(nèi)切酶、脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)Marker、Prime Star高保真酶、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶:大連寶生物工程公司;ClonExpress II One step cloning kit:南京諾唯贊生物科技有限公司;細菌基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、產(chǎn)物純化試劑盒、氯霉素(分析純):上海生工生物工程技術(shù)有限公司;L-丙氨酸(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酵母粉、蛋白胨(均為生化試劑):英國Oxoid公司;其他試劑來自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。
1.1.3 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基:酵母粉5.0g/L,蛋白胨10.0g/L,NaCl10.0g/L,pH自然,121 ℃條件下高壓滅菌20 min。
LB固體培養(yǎng)基:酵母粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH自然,121 ℃條件下高壓滅菌20 min。
氯霉素抗性平板:酵母粉5.0 g/L,蛋白胨10.0 g/L,NaCl 10.0 g/L,瓊脂粉20 g/L,pH自然,121 ℃條件高壓滅菌20 min后,添加終質(zhì)量濃度為30 μg/mL的氯霉素。
CFX96聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)儀、Gel Doc凝膠成像儀:美國Bio-Rad公司;BEP-600核酸電泳儀:北京伯蘭特生物科技有限公司;ZQZY-AF8恒溫調(diào)速搖床:上海知楚儀器有限公司;5804R冷凍離心機:德國Eppendorf公司;SpectraMaxRM3多功能酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀:美國Molecular Devices公司。
1.3.1 質(zhì)粒和基因組的提取
細菌質(zhì)粒DNA提取方法參照上海生工生物工程技術(shù)有限公司細菌質(zhì)粒提取試劑盒相關(guān)操作說明,基因組提取參照上海生工生物工程技術(shù)有限公司細菌基因組提取試劑盒相關(guān)操作說明。
1.3.2 轉(zhuǎn)錄組測序
將培養(yǎng)至對數(shù)期的大腸桿菌分別在非脅迫(未添加L-丙氨酸的LB培養(yǎng)基)和脅迫(添加90 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基)條件下接種,初始OD600nm值為0.1[27]。培養(yǎng)6 h后,4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集細胞,然后用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌兩次,在液氮中快速冷凍,并送到蘇州金唯智生物科技有限公司進行轉(zhuǎn)錄組分析。
1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建
以pTET質(zhì)粒為模板,pTET-mKate-1/pTET-mKate-2為引物,PCR擴增線性載體,PCR擴增體系:模板DNA 2 μL,Prime Star高保真酶50 μL,引物1、引物2各2 μL,雙蒸水(ddH2O)44 μL。PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性10 min,循環(huán)程序(94 ℃變性10 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 000 bp/min),循環(huán)程序運行29次,后延伸72 ℃,5 min。將PCR擴增后的產(chǎn)物膠回收后得到線性化載體片段。以E.coliW3110基因組為模板,擴增目的基因前500 bp片段,膠回收后得到目的片段產(chǎn)物。
使用同源重組酶連接線性化載體片段和目的片段,制作JM109化轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞,將連接好的質(zhì)粒利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細胞中,37 ℃、200 r/min搖床孵育1 h后,5 000 r/min離心5 min后去掉上清,用剩余少許培養(yǎng)基將菌體重懸,涂至含有氯霉素抗性的LB固體平板上。挑選氯霉素抗性平板上長出的單菌落,以引物CX-P-1/CX-P-2進行菌落PCR驗證,驗證成功的單菌落送于天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功的質(zhì)粒化轉(zhuǎn)入E.coliW3110中進行下一步試驗。
1.3.4 24孔板培養(yǎng)
24孔板裝液量為2 mL,將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌種以2%的接種量接入24孔板的LB培養(yǎng)基中(含不同質(zhì)量濃度的L-丙氨酸),37 ℃、600 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。
1.3.5 相對熒光強度測定
取1 mL待測樣品,8 000 r/min離心1 min,用相同體積的PBS清洗兩次,然后用PBS稀釋OD600nm值在0.4~0.6左右,取200 μL稀釋后樣品加入黑色避光的酶標(biāo)板中,使用酶標(biāo)儀測量熒光強度,設(shè)定激發(fā)波長為588 nm,發(fā)射波長為645 nm,并測定OD600nm值,根據(jù)熒光強度和OD600nm值的比值計算相對熒光強度[27]。
1.3.6 數(shù)據(jù)處理
試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進行整理和分析,使用Origin 2021作圖。
轉(zhuǎn)錄水平在L-丙氨酸壓力下比正常條件下升高基因的啟動子可能是由L-丙氨酸驅(qū)動的啟動子[28]。從測序結(jié)果給出的差異表達基因分析列表中,選擇轉(zhuǎn)錄水平較對照組提高水平靠前的10個基因(ArgK,F(xiàn)lgG,GlgP,CpxP,BetA,GlpA,KdpB,PulG,LivH和YhfX)作為候選基因,結(jié)果見圖1。
圖1 十個候選啟動子的差異表達Fig.1 Differential expression of ten candidate promoters
由圖1可知,轉(zhuǎn)錄水平提高最多的基因為KdpB,轉(zhuǎn)錄水平差異為6.66,其次是FlgG,轉(zhuǎn)錄水平差異為6.08。
使用蛋白質(zhì)直系同源簇數(shù)據(jù)庫(cluster of orthologous groups of proteins,COG)查詢分析10個候選基因的基因功能,結(jié)果見表2。由表2可知,該10個基因的功能分別屬于細胞運動和分泌、氨基酸運輸與代謝、碳水化合物運輸和代謝、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝和能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化,將這10個基因的啟動子分別編號為PAla-7~PAla-10。
表2 10個轉(zhuǎn)錄水平提高的基因Table 2 10 genes with increased transcriptional level
為了構(gòu)建含有紅色熒光蛋白基因的質(zhì)粒,以pTET質(zhì)粒作為骨架質(zhì)粒,以實驗室已有的mKate基因片段為模板[29],設(shè)計含同源臂的引物mKate-1和mKate-2擴增mKate基因片段,得到目的基因片段;以含有同源臂的引物pTET-1和pTET-2擴增pTET質(zhì)粒,得到線性化載體片段,按方法1.3.3進行質(zhì)粒構(gòu)建。挑選五個氯霉素抗性平板上長出的pTETmKate質(zhì)粒重組菌單菌落進行菌落PCR驗證,結(jié)果見圖2。由圖2可知,1號、2號、4號和5號泳道PCR擴增產(chǎn)物堿基長度約為1 000 bp,與mKate基因大小相符,說明mKate基因成功連接到了pTET質(zhì)粒上。將菌落PCR驗證正確的菌株送至天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功后得到pTET-mKate質(zhì)粒。
圖2 pTET-mKate質(zhì)粒重組菌菌落PCR驗證Fig.2 PCR verification of pTET-mKate plasmid recombinant colony
基因的前500 bp可能包含潛在的啟動子序列,為了更直觀的表征啟動子的轉(zhuǎn)錄水平,篩選響應(yīng)L-丙氨酸濃度的啟動子,通過京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和美國國家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(national center of biotechnology information,NCBI)查詢并預(yù)測10個候選基因前500 bp含有潛在啟動子的序列。以E.coliW3110的基因組為模板,設(shè)計同源臂引物,將轉(zhuǎn)錄組分析篩選出的10個候選基因的前500 bp進行擴增,利用同源重組連接pTET-mKate質(zhì)粒的紅色熒光蛋白基因mKate,質(zhì)粒圖譜見圖3。由圖3可知,將10個候選基因的啟動子序列插入到mKate基因前面,即可得到不同啟動子控制的mKate基因表達質(zhì)粒。
圖3 熒光蛋白表達質(zhì)粒構(gòu)建Fig.3 Construction of fluorescent protein expression plasmid
挑取氯霉素抗性平板長出的單菌落進行菌落PCR鑒定,結(jié)果見圖4。由圖4可知,PCR擴增產(chǎn)物堿基長度約為1500bp,說明500 bp的啟動子片段成功連接到了pTET-mKate質(zhì)粒上。將驗證成功的菌株送至天霖生物科技(無錫)有限公司測序,測序成功后提取重組質(zhì)?;瘜W(xué)轉(zhuǎn)化入E.coliW3110感受態(tài)細胞中,所獲得的菌株分別命名為P1~P10。
圖4 重組菌株啟動子菌落PCR驗證Fig.4 PCR verification of recombinant strains promoter colony
為了比較不同菌株在L-丙氨酸壓力下的相對熒光強度,將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌株接種到未添加L-丙氨酸和添加10 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)8 h后取樣測定熒光強度和OD600nm值,通過熒光強度和OD600nm值的比值計算相對熒光強度,結(jié)果見圖5。由圖5可知,PAla-4、PAla-8和PAla-10啟動子顯示出了較高的相對熒光強度,在不添加L-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)8 h后,相對熒光強度分別達到1 421、1 121和1 226,但是在添加10 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)后,相對熒光強度分別下降了21.2%、18.4%和51.5%,說明PAla-4、PAla-8和PAla-10啟動子并不會響應(yīng)L-丙氨酸濃度來提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。PAla-7和PAla-9啟動子的熒光報告菌株在添加10g/LL-丙氨酸壓力下的相對熒光強度均高于未添加L-丙氨酸,分別是未添加L-丙氨酸相對熒光強度的1.5倍和3.8倍。其他啟動子菌株在添加10 g/LL-丙氨酸壓力下的相對熒光強度均低于未添加L-丙氨酸,可能是L-丙氨酸會抑制熒光蛋白基因的表達。因此,選擇PAla-7和PAla-9啟動子進行下一步的評估驗證。
圖5 10個啟動子菌株在10 g/L L-丙氨酸質(zhì)量濃度下相對熒光強度比較Fig.5 Comparison of relative fluorescence intensity of 10 promoters strains at mass concentration of 10 g/L L-alanine
將含有PAla-7和PAla-9啟動子的菌株P(guān)7和P9分別接種到添加0~60 g/LL-丙氨酸的LB培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo),觀察PAla-7和PAla-9啟動子對不同L-丙氨酸濃度響應(yīng)的靈敏性,結(jié)果見圖6。
圖6 PAla-7和PAla-9啟動子在不同L-丙氨酸質(zhì)量濃度下相對熒光強度比較Fig.6 Comparison of relative fluorescence intensity of PAla-7 and PAla-9 promoters at different L-alanine mass concentrations
由圖6可知,在不同濃度L-丙氨酸的誘導(dǎo)下,PAla-9啟動子并未隨著L-丙氨酸濃度的增加而增加。在不同濃度L-丙氨酸的誘導(dǎo)下,PAla-7啟動子的相對熒光強度隨著L-丙氨酸濃度的而增加,相對于未添加L-丙氨酸,添加10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L和60 g/LL-丙氨酸誘導(dǎo)后的相對熒光強度分別增加了49%、122%、181%、275%、432%和705%,PAla-7啟動子在0~60 g/LL-丙氨酸誘導(dǎo)下顯示出了良好的靈敏性。
為了分析PAla-7啟動子是否對L-丙氨酸具有特異性響應(yīng),選擇11種常見的氨基酸(甲硫氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、脯氨酸、賴氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、精氨酸)分別進行誘導(dǎo)。將培養(yǎng)至對數(shù)期的菌株P(guān)7接種至含10 g/L和20 g/L的不同氨基酸的LB培養(yǎng)基中,測定誘導(dǎo)后的相對熒光強度,結(jié)果見圖7。由圖7可知,L-丙氨酸誘導(dǎo)質(zhì)量濃度從10 g/L增加到20 g/L時,相對熒光強度增加了52.4%,而其他氨基酸隨著濃度的增加,相對熒光強度并沒有隨著有明顯的增加。因此,PAla-7啟動子對L-丙氨酸具有特異性響應(yīng)。
圖7 PAla-7啟動子在不同種類氨基酸下相對熒光強度比較Fig.7 Comparison of relative fluorescence intensity of PAla-7 promoter under different kinds of amino acids
通過對不同質(zhì)量濃度L-丙氨酸壓力下的大腸桿菌進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,從中篩選了可能是L-丙氨酸誘導(dǎo)的10個候選基因的啟動子。隨后,利用紅色熒光蛋白進行表征,篩選得到了特異性響應(yīng)L-丙氨酸濃度的PAla-7啟動子,該啟動子在0~60 g/LL-丙氨酸范圍內(nèi)具有良好的靈敏性。值得注意的是,其余啟動子雖不能響應(yīng)L-丙氨酸濃度表達,但可作為組成型啟動子,用于后續(xù)啟動子優(yōu)化、調(diào)控基因表達水平和平衡代謝流等研究。該研究篩選得到的PAla-7啟動子可作為生物傳感器的調(diào)控元件,也為后續(xù)L-丙氨酸動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)的構(gòu)建提供了理論基礎(chǔ)。