基于SPME-GC-MS 技術(shù)分析不同地理標(biāo)志辣椒粉香氣成分差異

陶興林，朱惠霞，王曉巍，劉明霞，張玉鑫

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅蘭州 730070）

辣椒（Capsicum annuumL.）屬于辛辣類蔬菜，廣泛種植在全世界范圍內(nèi)。辣椒果實(shí)富含營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性化合物，包括L-抗壞血酸、酚類化合物、類胡蘿卜素和辣椒素等，具有抗氧化活性和抗炎作用，被消費(fèi)者廣泛接受[1-2]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計(jì)，2020 年全球辣椒種植面積為199.9 萬公頃，產(chǎn)量為3928 萬噸；中國辣椒種植面積為81.4 萬公頃，占全球總種植面積的40.7%，產(chǎn)量為1960 萬噸，占全球辣椒總產(chǎn)量的49.9%，已成為世界辣椒種植面積和產(chǎn)量最高的國家[3]。目前，辣椒廣泛應(yīng)用于烹飪、佐料等產(chǎn)業(yè)，主要以鮮食和加工為主要用途，如泡椒[4]、剁椒[5]、鮮食辣椒[6]、辣椒粉[7]、辣椒醬[8]、豆瓣醬[9]等。

地理標(biāo)志農(nóng)產(chǎn)品具有顯著的區(qū)域性和季節(jié)性，各個(gè)地區(qū)種植的土壤環(huán)境、氣候條件及人工培育等因素存在差異，從而導(dǎo)致辣椒在營養(yǎng)品質(zhì)和風(fēng)味物質(zhì)上會發(fā)生改變, 相互之間產(chǎn)生差異[10-11]。目前，學(xué)者研究表明，品種類型對辣椒產(chǎn)品的色澤、風(fēng)味和營養(yǎng)指標(biāo)間差異的影響較大[12-13]，但區(qū)域性的差異方面研究較少，肖何等[14]對山東和山西兩產(chǎn)地“辣豐33 號”辣椒生長過程中品質(zhì)變化規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩產(chǎn)地辣椒生長過程中品質(zhì)特性變化趨勢基本一致；王雪梅等[15]對5 種不同產(chǎn)地的二荊條辣椒在郫縣豆瓣發(fā)酵過程中品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行分析，提出按不同產(chǎn)地及產(chǎn)品特性選擇辣椒原材料發(fā)酵郫縣豆瓣的觀點(diǎn)。目前，干辣椒原料的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定已有相關(guān)報(bào)道，已經(jīng)鑒定了數(shù)百種揮發(fā)性化合物，許多化合物在干制辣椒產(chǎn)品風(fēng)味和香氣的形成中扮演著重要作用[16-17]。研究發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與辣椒品種、種植產(chǎn)地的光照、降雨量、氣溫和海拔等因素密切相關(guān)[18-20]，王雪雅等[19]揭示了貴州不同品種辣椒的品質(zhì)和揮發(fā)性組分的差異；李莎等[20]發(fā)現(xiàn)四川不同產(chǎn)地辣椒的辣椒素和維生素C 受環(huán)境影響顯著。但對地理標(biāo)志辣椒特征呈香物質(zhì)的分析和在辣椒風(fēng)味構(gòu)成中的作用尚未深入研究。

因此，本研究運(yùn)用SPME-GC-MS 檢測并鑒定不同地理標(biāo)志辣椒產(chǎn)品中普遍存在的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類和含量；分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的相關(guān)性，并進(jìn)行主成分分析，找出不同地理標(biāo)志辣椒的香氣特點(diǎn)，使人們對不同地理標(biāo)志辣椒的特征香氣有更深入的認(rèn)識，為后期地理標(biāo)志辣椒育種工作中風(fēng)味品質(zhì)的改進(jìn)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料 采自甘肅省張掖市高臺縣合黎鎮(zhèn)、陜西省寶雞市隴縣東風(fēng)鎮(zhèn)、新疆維吾爾自治區(qū)塔城地區(qū)沙灣縣安集海鎮(zhèn)、云南省文山壯族苗族自治州丘北縣樹皮鄉(xiāng)、甘肅省天水市甘谷縣禮辛鎮(zhèn)5 個(gè)地理標(biāo)志辣椒主產(chǎn)區(qū)，樣品采集信息見表1。采用網(wǎng)格法取樣，每個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)選取3 個(gè)點(diǎn)采樣，采集前2 茬成熟的紅辣椒混合樣為檢測樣本。

表1 樣品采集信息表Table 1 Sample collection information form

7890A-5975C 氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent 公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取裝置 美國Supelco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 采收的鮮辣椒樣品去掉發(fā)霉、腐爛、綠熟的辣椒，清洗機(jī)清洗，剪去辣椒果柄，裝盤放入烘干室內(nèi)，70 ℃條件下持續(xù)烘干40 h，烘干后粉碎，80 目過篩制成辣椒面（無異味、水分≤5%、灰分≤11.0 g/100 g）作為待測樣品。

1.2.2 感官評價(jià) 感官評定在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，評價(jià)小組由事先接受系統(tǒng)培訓(xùn)的10 名成員組成，對辣椒粉樣品進(jìn)行定量描述性感官分析。通過討論篩選，確定了評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)（表2），選擇了4 個(gè)感官屬性（色澤、辣度、香氣、滋味）進(jìn)行評分，在感官質(zhì)量評定中，色澤權(quán)重占25%，辣度權(quán)重占25%，香氣權(quán)重占35%，滋味權(quán)重占15%，最終評分按照對應(yīng)的權(quán)重占比計(jì)算綜合得分為確保評定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每個(gè)樣品重復(fù)評定3 次。

表2 感官質(zhì)量評定標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Criteria for sensory evaluation

1.2.3 固相微萃取 取待測樣品100 g，置于400 mL固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μmDVB/CAR/PDMS Stable Flex 纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，85 ℃頂空萃取30 min，快速移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（溫度250 ℃）中，熱解吸3 min進(jìn)樣。

1.2.4 GC-MS 操作條件 色譜條件：色譜柱為INNOWAX（60.0 m×0.25 mm×0.50 μm）彈性石英毛細(xì)管柱，柱初始溫度60 ℃（保留1 min），以2 ℃/min的速率升溫至230.0 ℃，繼續(xù)以20 ℃/min 的速率升溫至250 ℃，保持10 min；載氣為高純氦氣（純度99.999%），載氣流量1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為200 ℃，分流比為20:1。

質(zhì)譜條件：離子源為電子轟擊電離源（electron ionization，EI）；電子能量為70 eV，離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；發(fā)射電流34.6 μA；質(zhì)量掃描范圍為35～500 m/z。

1.2.5 風(fēng)味物質(zhì)的測定 將得到的每個(gè)樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過所NIST（national institute of standards and technology）2011 圖庫檢索，結(jié)合文獻(xiàn)資料，對樣品中各揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行核對和確認(rèn)，并用峰面積歸一法計(jì)算各化學(xué)成分的相對含量[21]，解析和確定風(fēng)味成分。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值，用 Excel 2010數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Origin 2020 數(shù)據(jù)繪圖分析軟件進(jìn)行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地理標(biāo)志辣椒的感官評價(jià)分析

對5 種不同地理標(biāo)志辣椒粉的色澤、辣度、香氣及滋味進(jìn)行感官評價(jià)，結(jié)果如表3 所示。方差分析結(jié)果表明不同地理標(biāo)志辣椒的除色澤無顯著差異外（P>0.05），辣度、香氣及滋味均呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）。高臺辣椒的辣度得分最高，其次是甘谷辣椒和丘北辣椒；甘谷辣椒的香氣得分最高，其他的無顯著差異（P>0.05）；丘北辣椒的滋味得分最高，顯著高于其他4 個(gè)地理標(biāo)志辣椒（P<0.05）。綜合得分甘谷辣椒最高，高臺辣椒和丘北辣椒排名第2、3 位。評價(jià)中甘谷辣椒香氣成分表現(xiàn)突出，其獨(dú)特的香味主要是由揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類與含量決定。

表3 不同地理標(biāo)志辣椒感官評分結(jié)果Table 3 Sensory scores of different geographical indications chilies

2.2 不同地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

通過GC-MS 對不同品種辣椒粉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測、鑒定與量化，發(fā)現(xiàn)不同辣椒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量存在差異，5 個(gè)樣品中共檢測出11 類65 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，主要包括烷烴類13 種、烯烴類11 種、醛類10 種、醇類8 種、酮類7 種、醚類4 種、酯類5 種、酸類3 種、呋喃類2 種、吡嗪類1 種、胺類1 種（表4 和圖1）。5 種不同辣椒樣品分別鑒定出來揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量為高臺辣椒37 種、寶雞辣椒33 種、安集海辣椒31 種、丘北辣椒30 種、甘谷辣椒45 種，甘谷辣椒樣品種所檢測出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多。

圖1 5 種地理標(biāo)志辣椒GS-MS 色譜圖Fig.1 GC-MS chromatogram of 5 kinds of geographical indications chilies

表4 5 種地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Volatile flavor compounds of 5 kinds of geographical indications chilies

不同地理標(biāo)志產(chǎn)品間揮發(fā)性物質(zhì)含量分析發(fā)現(xiàn)高臺辣椒中2,3,5,6-四甲基吡嗪相對含量最高，寶雞辣椒水楊酸甲酯相對含量最高；安集海辣椒酞酸二乙酯相對含量最高；丘北辣椒醋酸相對含量最高；甘谷辣椒四聚乙二醇單月桂醚相對含量最高。獨(dú)有物質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)月桂醇聚醚-8、2,3-丁二醇、（2R,3R）-（-）-2,3-丁二醇、正己烷4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為高臺辣椒獨(dú)有，呈現(xiàn)柔和的花香和水果香味[22-23]。乙酸甲酯、十二碳烷、3-甲基-1 十二炔-3-醇、5-（1-甲基丙基）-壬烷4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為寶雞辣椒獨(dú)有，呈現(xiàn)芳香氣味或特定水果香味。（1S,3S,4S,6R）-4,7,7-三甲基去甲蒈-3-醇為安集海辣椒獨(dú)有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，呈現(xiàn)特定的花香和水果香味。丘北辣椒獨(dú)有的1,2-丙二胺揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)可以呈現(xiàn)刺激性氣味。5-丙基癸烷和（E）-2-庚烯醛2 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為甘谷辣椒獨(dú)有，呈現(xiàn)果香及花香味。除了不同地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性物風(fēng)味物質(zhì)存在的差異外，（1R,7r）-2,6,6,9-四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯、酞酸二乙酯、乙酸芳樟酯、醋酸這4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在5 種辣椒中均含有，表現(xiàn)出共有的風(fēng)味和香氣特點(diǎn)。

不同地理標(biāo)志辣椒產(chǎn)品間的烯烴類、醛類、醇類等總含量存在顯著差異。高臺辣椒吡嗪類相對含量最高，達(dá)到了18.44%，此類物質(zhì)是由己醛基和氨基酸的縮合反應(yīng)生成的[24-25]，賦予高臺辣椒焙烤、焦香氣味[26-27]；安集海和寶雞辣椒烯烴類相對含量最高，分別達(dá)到了21.54%和18.44%，賦予安集海辣椒和寶雞辣椒特殊的香氣[24]；丘北辣椒酮類相對含量最高，達(dá)到了13.89%，賦予丘北辣椒的飴糖和鮮花香味[28]；甘谷辣椒醛類相對含量最高，達(dá)到了9.57%，此類物質(zhì)是構(gòu)成辣椒粉香氣的重要物質(zhì)，利用斯特拉克爾降解反應(yīng)，賦予甘谷辣椒的杏仁、水果香味及刺激性風(fēng)味[29]。在產(chǎn)地對辣椒揮發(fā)性成分影響研究方面，張曼等[30]在不同產(chǎn)地的5 種鲊?yán)苯分泄茶b定出79 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以酯類最多，數(shù)量達(dá)到31 種，共有的酯類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)15 種；范智義等[31]在6 個(gè)不同產(chǎn)地的辣椒樣品中共檢出各類揮發(fā)性成分73 種，萜類最多，共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)48 種；王雪梅等[15]在5 種不同產(chǎn)地二荊條中共檢測出176 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，以酯類最多，有39 種，共有揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)41 種。上述研究鑒定出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量均高于本研究的5 種地理標(biāo)志辣椒，以酯類和萜類為主要種類，數(shù)量也遠(yuǎn)高于本研究鑒定出14 種烷烴類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。共有成分顯著高于5 種地理標(biāo)志辣椒中共有的4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。說明產(chǎn)地對辣椒風(fēng)味物質(zhì)構(gòu)成有很大的影響。

2.3 不同地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析

由圖2 可知，不同地理標(biāo)志辣椒粉的前2 個(gè)PC 值的貢獻(xiàn)率分別為57.7%和23.2%，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到了80.9%，說明前2 個(gè)PC 包含了不同地理標(biāo)志辣椒粉中大部分揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的信息，可用于分析辣椒中揮發(fā)性風(fēng)味在不同地理標(biāo)志產(chǎn)品中的動(dòng)態(tài)變化。同一地理標(biāo)志樣品相對距離較近，證明檢測重復(fù)性較好，不同地理標(biāo)志辣椒粉樣品存在明顯的差距表明不同地理標(biāo)志辣椒粉之間的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異性較明顯。5 種地理標(biāo)志辣椒粉分布在三個(gè)象限中，其中高臺辣椒分布在第一象限內(nèi)，寶雞辣椒和安集海辣椒在第二象限，甘谷辣椒和丘北辣椒都分布在第三象限，從象限分布可以看出，寶雞辣椒和安集海辣椒、甘谷辣椒和丘北辣椒的風(fēng)味差異較小。

圖2 5 種地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析圖Fig.2 Volatile substance principal component analysis of 5 kinds of geographical indication chilies

從表5 可知，第一主成分的特征值為92.6718，貢獻(xiàn)率為57.6940%，與其特征向量中載荷較高的風(fēng)味物質(zhì)2,3,5,6-四甲基吡嗪、四聚乙二醇單月桂醚、反式-肉桂醛呈正相關(guān)，與載荷較低的水楊酸甲酯、（1R,7r）-2,6,6,9-四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯、（+）-苜蓿烯呈負(fù)相關(guān)。表明第一主成份含量高的高臺辣椒和甘谷辣椒分別具有焙烤、焦香味和杏仁、水果味的香氣特點(diǎn)。第二主成分的特征值為37.2649，貢獻(xiàn)率為23.1998%，與其特征向量中載荷較高的風(fēng)味物質(zhì)水楊酸甲酯、植烷、2,3,5,6-四甲基吡嗪呈正相關(guān)，與載荷較低的8-甲基-十七烷、四聚乙二醇單月桂醚、B-紫羅酮呈負(fù)相關(guān)。表明第二主成分中含量高的寶雞辣椒具有味飴糖和鮮花香的香氣特點(diǎn)。第三主成分的特征值為18.4564，貢獻(xiàn)率為11.4903%，與其特征向量中載荷較高的風(fēng)味物質(zhì)植烷、（1R,7r）-2,6,6,9-四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯、醋酸呈正相關(guān)，與載荷較低的酞酸二乙酯、β-欖香烯、反式-肉桂醛呈負(fù)相關(guān)，表明第三主成分含量高的寶雞辣椒和甘谷辣椒具有萜烯類物質(zhì)產(chǎn)生的香氣特點(diǎn)。第四主成分的特征值為12.0237，貢獻(xiàn)率為7.4855%，與特征向量載荷高的風(fēng)味物質(zhì)10-甲基十九烷、（1R,7r）-2,6,6,9-四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯、（+）-苜蓿烯呈正相關(guān)，與載荷較低的醋酸、8-甲基-十七烷、6-甲基-3,5-戊二烯-2-酮呈負(fù)相關(guān)。說明第四主成分含量高的寶雞辣椒和安集海辣椒具有萜烯類物質(zhì)產(chǎn)生的香氣特點(diǎn)。由此說明可以根據(jù)不同風(fēng)味物質(zhì)的主成分分析來區(qū)分不同地理標(biāo)志辣椒類型及其表現(xiàn)出的風(fēng)味特征。

表5 5 種地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分的方差貢獻(xiàn)率和載荷矩陣表Table 5 Cumulative variance contribution rate and loading matrix of volatile substance principal components of 5 kind of geographical indication chilies

2.4 不同地理標(biāo)志辣椒聚類熱圖分析

根據(jù)不同揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量差異，對5 種地理標(biāo)志辣椒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行聚類分析。如圖3 所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分為2 類，第一類由四聚乙二醇單月桂醚和2,3,5,6-四甲基吡嗪2 種物質(zhì)組成。這2 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在高臺辣椒中含量最高，賦予其堅(jiān)果味的特征香氣。第二類聚集了水楊酸甲酯、庚酸二乙酯、四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)63 種，這些風(fēng)味物質(zhì)在不同地理標(biāo)志辣椒粉中含量存在差異，使得不同地理標(biāo)志辣椒出現(xiàn)香味的差異。此外，依據(jù)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對5 種不同地理標(biāo)志辣椒粉進(jìn)行聚類分析，分成了2 大類，高臺辣椒單獨(dú)為一類，其他4 種地理標(biāo)志辣椒為一類，這與前面風(fēng)味物質(zhì)的聚類分析結(jié)果一致。

圖3 5 種地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性成分含量的聚類熱圖Fig.3 Cluster heat maps of volatile component content of 5 kinds of geographical indication chilies

3 結(jié)論

本研究采用固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，分析了5 種不同地理標(biāo)志辣椒風(fēng)味物質(zhì)的差異和特點(diǎn)，明確不同地理標(biāo)志辣椒的呈香特點(diǎn)，進(jìn)一步提升地理標(biāo)志辣椒品牌形象和市場知名度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 種地理標(biāo)志辣椒共檢出11 類65 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，不同地理標(biāo)志辣椒的風(fēng)味物質(zhì)存在差異，高臺辣椒、寶雞辣椒、安集海辣椒、丘北辣椒、甘谷辣椒鑒定出來揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的數(shù)量依次為37、33、31、30、45；風(fēng)味物質(zhì)相對含量最高的分別為2,3,5,6-四甲基吡嗪、水楊酸甲酯、酞酸二乙酯、醋酸、四聚乙二醇單月桂醚。不同地理標(biāo)志辣椒產(chǎn)品間的烯烴類、醛類、醇類等總含量存在顯著差異。風(fēng)味物質(zhì)種類總含量最高的分別為吡嗪類、烯烴類、烯烴類、酮類、醛類。說明高臺辣椒具有焙烤、花香、水果香及焦香味；寶雞辣椒具有薄荷、冬青及水果香味；安集海辣椒具有特殊香味及水果香味；丘北辣椒具有酸和鮮花香味；甘谷辣椒具有杏仁、水果香味。除了不同地理標(biāo)志辣椒揮發(fā)性物物質(zhì)存在的差異外，（1R,7r）-2,6,6,9-四甲基雙環(huán)[5.4.0]-2,8-十一二烯、酞酸二乙酯、乙酸芳樟酯、醋酸這4 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在5 種辣椒中均含有，表現(xiàn)出共有的風(fēng)味和香氣特點(diǎn)。本研究雖然從揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類上基本上可以鑒別不同地理標(biāo)志辣椒的香味，但是部分具體的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的呈香特點(diǎn)還不清楚。因此，本研究為深入研究地理標(biāo)志辣椒產(chǎn)地環(huán)境與呈香關(guān)聯(lián)性奠定基礎(chǔ)。