微波輔助雙水相提取百合多糖的工藝優(yōu)化及其結(jié)構(gòu)表征

田艷花，楊兆艷，羅愛(ài)國(guó)，張 玲，張立偉

（1.山西藥科職業(yè)學(xué)院食品工程系，山西太原 030031；2.晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，山西晉中 030619；3.山西大學(xué)分子科學(xué)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原 030006）

百合屬于百合科植物卷丹（Lilium lancifoliumThunb）的肉質(zhì)鱗片，它是衛(wèi)生部批準(zhǔn)的首批藥食同源的產(chǎn)品之一。在我國(guó)的宜興、萊陽(yáng)、湖州、隆回、萬(wàn)載和蘭州等地被廣泛種植，其中湖州百合具有“太湖人參”的美譽(yù)[1]。據(jù)中藥產(chǎn)業(yè)大數(shù)據(jù)平臺(tái)統(tǒng)計(jì)在2021 年百合產(chǎn)量3 萬(wàn)噸，并預(yù)計(jì)2025 年超過(guò)8 萬(wàn)噸。因此，對(duì)百合深加工具有廣闊的市場(chǎng)前景和利潤(rùn)空間。大量研究表明百合中富含多糖、生物堿、皂苷、膳食纖維、果膠和各種維生素等活性成分[2]。因此，百合具有很高的醫(yī)學(xué)和藥用價(jià)值，備受人們的喜愛(ài)。多糖是百合中最重要的活性成分之一，一般其含量在9%左右。大量研究已經(jīng)證實(shí)百合多糖具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫和抗衰老等[3-5]。百合多糖的高效提取是其開(kāi)發(fā)和利用的最關(guān)鍵步驟。因此，尋找綠色高效的提取方式至關(guān)重要。

目前，針對(duì)天然多糖的提取主要采用傳統(tǒng)的熱水提取，該方式具有提取操作簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊設(shè)備和提取成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但熱水提取存在提取效率低和耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)[6]。因此，該方式不適合大規(guī)模提取天然多糖。隨著提取技術(shù)的不斷發(fā)展，一些先進(jìn)的提取技術(shù)被應(yīng)用于天然多糖的提取當(dāng)中。如超聲輔助提取、微波輔助提取和超高壓輔助提取等先進(jìn)的方式。其中超聲輔助提取利用超聲產(chǎn)生的空化效應(yīng)加速植物細(xì)胞壁的破裂，強(qiáng)化多糖的提取[7]。但該方式的機(jī)械振蕩易造成多糖中糖苷鍵的斷裂，不利于多糖的提取。微波輔助提取也可以破裂植物細(xì)胞壁，達(dá)到強(qiáng)化提取多糖的目的[8]。目前，微波輔助提取技術(shù)已成功地從橘皮[9]、蓮子心[10]、刺梨[11]和板栗[12]中提取多糖。超高壓輔助提取也可降低細(xì)胞內(nèi)多糖的傳質(zhì)阻力，實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化提取多糖的目的[13]。該方式提取效率高，但該方式提取成本較大，設(shè)備投入要求較高。因此，超高壓輔助提取沒(méi)有被大規(guī)模用于工業(yè)化提取天然多糖。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，提取技術(shù)也有了新的突破。近年來(lái)雙水相提取技術(shù)作為具有發(fā)展?jié)摿Φ木G色的提取技術(shù)在天然產(chǎn)物中已受到越來(lái)越多的關(guān)注。該技術(shù)提取成本較低、效率高、可以連續(xù)化提取天然活性成分[14]。因此，雙水相提取技術(shù)已被成功用于天然多糖、多酚和總黃酮等活性成分的提取[15-17]。將微波提取與雙水相提取相結(jié)合形成微波輔助雙水相提取法（Microwave assisted aqueous twophase extraction，MATPE），該方式更有利于多糖的提取，同時(shí)可以一步完成多糖的提取和初步純化，但該技術(shù)用于百合多糖的提取鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本文首先采用單因素和正交試驗(yàn)確定MATPE 法提取百合多糖的最佳工藝條件，并制備多糖粗提物；然后采用DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-100 柱層析法純化多糖粗提物，并鑒定主要多糖餾分的結(jié)構(gòu)。本文研究結(jié)果以期為百合多糖的高效提取提供綠色可行的方式，并為百合多糖的深度開(kāi)發(fā)提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

湖州卷丹百合 2022 年6 月購(gòu)買于浙江湖州；DEAE-52 纖維素、Sephadex G-100 北京北實(shí)縱橫科學(xué)公司；葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、巖藻糖 標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99%），成都成科匯博科技有限公司；硫酸銨、濃硫酸、苯酚、氯化鈉、氫氧化鈉 分析純，天津金東天正精細(xì)化學(xué)試劑有限公司；透析袋 北京索萊寶科技有限公司。

MARS6 微波輔助提取儀 培安（中國(guó)）有限公司；VFD-1000 真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CARY 50 紫外分光光度計(jì) 美國(guó)瓦里安公司；650S 傅里葉變換紅外光譜儀 天津港東科股份有限公司；GC7810 氣相色譜 山東金普分析儀器有限公司；ROHS2.0 高效液相色譜儀 蘇州博訊儀器有限公司；SNE-3200M 臺(tái)式掃描電鏡 深圳市武訓(xùn)科技有限公司；AXTG16G 高速離心機(jī) 無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；IKA RV10 Basic 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國(guó)艾卡科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 首先將百合在50 ℃的真空烘箱中干燥，直到百合的含水率低于5%為止，然后利用小型的植物粉粹機(jī)將其粉碎成粉末，隨后過(guò)40 目篩，即獲得百合粉末樣品，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 百合多糖提取物的制備 依據(jù)Li 等[14]制備乙醇-硫酸銨雙水相體系，具體如下：精確稱取一定質(zhì)量的硫酸銨，加入至容積為15 mL 的具塞試管中，然后加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，超聲使固體微粒全部溶解，然后靜置直至體系形成雙水相。在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，準(zhǔn)確稱取5 g 百合粉末樣品，然后加入制備好的雙水相體系，將百合樣品充分混合，然后置于微波輔助提取儀中，通過(guò)微波提取儀的控制面板設(shè)定微波功率和提取時(shí)間，提取結(jié)束后，待兩相分配達(dá)到平衡后，收集下相溶液，將其離心（6000 r/min，15 min）。利用硫酸-苯酚法測(cè)定上清液中百合多糖得率；另一部分上清液將其置于冷凍干燥機(jī)中凍干，制得百合多糖粗提物。

1.2.3 百合多糖得率測(cè)定

1.2.3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取10.00 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL 容量瓶中，利用去離子水定容，配成0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL 試管中，去離子水補(bǔ)至1.0 mL，依次加入1.0 mL 6%苯酚溶液和5.0 mL 濃硫酸，振蕩混勻，沸水水浴20 min，冷卻至室溫，在波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定樣品吸光度[18]。以吸光度（A）對(duì)葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）做線性回歸，得線性方程為：A=8.1325C-0.0061，R2=0.9998，表明葡萄糖濃度在0.02～0.10 mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.3.2 多糖含量測(cè)定 參考Rostami 等[18]的方法測(cè)定多糖得率，首先吸取1.2.2 樣品溶液2 mL，其余步驟參考1.2.3.1，并依據(jù)式（1）計(jì)算多糖得率（Y）。

式中：C 為樣品中多糖的濃度，mg/mL；V 為樣品體積，mL；m 為百合質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 本研究選擇MATPE 法作為百合多糖的提取方法，操作同1.2.2。其中影響多糖得率最主要的因素包括微波功率、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，在本論文中分別選擇上述實(shí)驗(yàn)因素條件進(jìn)行多糖得率的單因素實(shí)驗(yàn)考察。

1.2.4.1 微波功率對(duì)多糖得率的影響 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比分別固定在22%、50%和1:30 g/mL，考察微波功率（80、160、240、320、400 W）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.4.2 硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響 微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比分別固定在240 W、50%和1:30 g/mL ，考察硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（18%、20%、22%、24%、26%）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.4.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖得率的影響 微波功率、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和料液比分別固定在240 W、22%和1:30 g/mL，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%、70%）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.4.4 料液比對(duì)多糖得率的影響 微波功率、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別固定在240 W、22%和50% ，考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）對(duì)多糖得率的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇微波功率（A）、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（B）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）作為實(shí)驗(yàn)因素，以百合多糖得率為目標(biāo)值。設(shè)計(jì)L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及因素水平編碼如表1 所示。

表1 MATPE 法提取百合多糖的L9（34）正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 L9(34) orthogonal experimental factors and levels of MATPE lily polysaccharides

1.2.6 百合多糖的純化 稱取一定量百合多糖粗提物，按照1:30 g/mL 加入80%乙醇沉淀過(guò)夜，收集沉淀，通過(guò)Sevage 法去除蛋白質(zhì)，然后用透析袋（截留分子量為3500 Da）透析48 h，每12 h 更換一次去離子水。將獲得的透析液置于-18 ℃冰箱中預(yù)凍12 h，然后將其置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干。將凍干的樣品用去離子水溶解，并離心（6000 r/min，15 min）以獲得上清液，上清液質(zhì)量濃度為2 mg/mL，以1.0 mL/min 的流速加入DEAE-52 纖維素柱（1.6 cm×70 cm）中，用去離子水和不同濃度的NaCl（0.1、0.2、0.4、0.6 mol/L）溶液依次進(jìn)行洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min。通過(guò)自動(dòng)接樣器收集洗脫餾分于試管中，每管5 mL 洗脫液。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。通過(guò)上述方法分離后獲得2 種多糖餾分（LP1 和LP2），經(jīng)測(cè)定比較，LP2 中多糖含量較高。然后通過(guò)Sephadex G-100 層析柱（1.6 cm×50 cm）進(jìn)一步分離和純化主要餾分（LP2）。洗脫參數(shù)如下：加載濃度為10 mg/mL，加載體積為4 mL，去離子水為洗脫劑，流速為0.4 mL/min。每個(gè)管收集2 mL 餾分，將純化的多糖餾分冷凍干燥以獲得均一的多糖餾分LP2-SG，用于多糖結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.7 結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.7.1 紫外光譜 參考Kia 等[19]所述的方法，將LP2-SG 制備成0.1 mg/mL 的樣品溶液，利用紫外分光光度計(jì)在200～800 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，以確定多糖溶液是否含有蛋白質(zhì)和核酸。

1.2.7.2 單糖組成 參考Hui 等[20]的方法測(cè)定LP2-SG 的單糖組成。具體如下：a.配制單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：準(zhǔn)確稱取7 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg，分別溶于1 mL 0.3 mol/L NaOH 溶液中，得到濃度為20 mg/mL 單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，于4 ℃密封保存。各取100 μL體積單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液混合，得到700 μL 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。b.多糖水解及衍生化反應(yīng)：準(zhǔn)確稱取5 mg 多糖置于血清瓶中，加入1 mL 蒸餾水完全溶解后，加入1 mL 4 mol/L 三氟乙酸（TFA）中，混勻后密封，于110 ℃反應(yīng)4 h。取出后冷卻至室溫，加入1 mL 甲醇旋蒸除去TFA。加入 1 mL 0.3 mol/L NaOH 溶液溶解，再加入 200 μL 0.5 mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）-甲醇溶液，70 ℃水浴反應(yīng)2 h。取出后冷卻 10 min，用0.3 mol/L 鹽酸溶液中和。采用1 mL 氯仿萃取，棄下層，至下層無(wú)色。取上清液用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后即可進(jìn)樣測(cè)定。c.單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品衍生化反應(yīng)：取800 μL 單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，根據(jù)上述步驟中多糖衍生方式進(jìn)行。d.高效液相色譜儀檢測(cè)：采用ROHS2.0 高效液相色譜儀。色譜柱為 Gemini C18柱（4.6×250 mm，5 μm），檢測(cè)器波長(zhǎng)為 254 nm，柱溫為30 ℃。流動(dòng)相A：0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH6.7），流動(dòng)相B：乙腈。進(jìn)樣量為10 μL，流速為1 mL/min。

1.2.7.3 分子量 利用去離子水將LP2-SG 和不同分子量標(biāo)準(zhǔn)品制備成1 mg/mL 的溶液，并以6000 r/min 將其離心15 min，通過(guò)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，然后注入高效凝膠滲透色譜（HPGPC）中，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為 0.05 mol/L NaCl 溶液，流速：0.6 mL/min。HPLC 系統(tǒng)配備有折射率檢測(cè)器（RID）和超水凝膠線性凝膠過(guò)濾柱（8 mm×300 mm）。利用去離子水進(jìn)行洗脫。利用多個(gè)單糖標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建校準(zhǔn)曲線以測(cè)量平均分子量（Mw），標(biāo)準(zhǔn)曲線如式（2）所示：

式中：TR為保留時(shí)間，min；Mw為平均分子量。

1.2.7.4 紅外光譜 利用紅外光譜分析LP2-SG 的紅外吸收特性。將LP2-SG 與KBr 以1:30（w/w）的比例混合并壓縮成切片。LP2-SG 在波數(shù)4000～500 cm-1的范圍進(jìn)行紅外光譜掃描。通過(guò)紅外光譜儀的內(nèi)置軟件分析LP2-SG 的光譜特性。質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、22%、24%三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；采用SPSS 22.0 軟件對(duì)每一組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA），組間差異比較用Duncan 檢測(cè)，P<0.05認(rèn)為組間具有顯著性差異；利用Origin9.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)百合多糖得率的影響

雙水相法提取百合多糖的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1 所示。

圖1 提取因素對(duì)百合多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction factors on the yield of lily polysaccharides

由圖1A 可知，當(dāng)微波功率低于320 W 時(shí)，多糖得率隨微波功率增加而顯著增加（P<0.05）。這是由于微波功率越大，微波輻射導(dǎo)致百合細(xì)胞壁破裂，加快細(xì)胞內(nèi)多糖的快速溶出，進(jìn)而提高多糖得率[19]。但微波功率超過(guò)320 W 時(shí)，提取率反而下降。該研究結(jié)果與李樂(lè)等[21]在探究微波提取無(wú)花果多糖的結(jié)果一致。綜上，本研究選擇微波功率240、320 和400 W三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖1B 可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在18%～22%范圍內(nèi)，隨硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加百合多糖得率顯著增加（P<0.05）。這種現(xiàn)象歸因于硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)，下相中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，多糖在硫酸銨溶液中的溶解度增加，同時(shí)擴(kuò)散系數(shù)增加，從而提高多糖得率[14]。但下相中硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，下相中硫酸銨質(zhì)量已經(jīng)飽和，繼續(xù)增加硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)也不會(huì)提高多糖的溶解度，相反會(huì)提高多糖雜質(zhì)溶解度，進(jìn)而與多糖的溶解產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，不利于多糖的提取。該研究結(jié)果與Xue 等[22]采用超聲輔助雙水相提取百合多糖的結(jié)果一致。綜上，本研究選擇硫酸銨

由圖1C 可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%～40%范圍內(nèi)，多糖得率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加呈顯著增加的趨勢(shì)（P<0.05），即多糖得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。在乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%時(shí)，多糖得率取得最大值9.78%±0.12%。其原因是乙醇體積分?jǐn)?shù)在40%時(shí)，乙醇和硫酸銨質(zhì)量形成的雙水相體系對(duì)多糖的溶解度和擴(kuò)散系數(shù)最大，更有利于多糖溶解在雙水相的下相中進(jìn)而提高多糖得率[23]。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于40%時(shí)，乙醇和硫酸銨質(zhì)量形成的雙水相體系對(duì)多糖溶解度降低。但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)在50%～60%范圍內(nèi)，多糖得率仍顯著高于乙醇體積分?jǐn)?shù)在30%時(shí)所得的多糖得率（P<0.05）。該研究結(jié)果與Chen等[24]采用微波輔助雙水相提取決明子多糖的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上，本研究選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%三個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由圖1D 可知，當(dāng)料液比在低于1:30 g/mL 范圍內(nèi)，百合多糖得率隨料液比增加而顯著增加（P<0.05）。其原因是較大的料液比會(huì)使得百合細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度逐漸增加，濃度梯度作為多糖的傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力，較高的濃度梯度促進(jìn)多糖由內(nèi)向外擴(kuò)散，進(jìn)而提高多糖得率[22]。當(dāng)料液比超過(guò)1:30 g/mL 時(shí)，百合多糖得率隨料液比增加無(wú)顯著變化（P>0.05）。該結(jié)果與周小偉等[25]通過(guò)超聲-微波協(xié)同輔助提取猴頭菇多糖結(jié)果一致。因此，本研究選擇料液比為1:30 g/mL，后續(xù)不再進(jìn)行優(yōu)化。

2.2 微波輔助雙水相提取多糖的正交試驗(yàn)結(jié)果

百合多糖經(jīng)MATPE 法提取后的正交試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。利用極差大小可判斷實(shí)驗(yàn)因素對(duì)百合多糖得率的影響程度。由表2 可知，實(shí)驗(yàn)因素對(duì)多糖得率影響的主次順序?yàn)椋篊>B>A，最優(yōu)水平組合為A3B1C2，即微波功率400 W、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%和乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。利用優(yōu)化得到的工藝參數(shù)進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得百合多糖得率為10.15%±0.11%，說(shuō)明利用正交試驗(yàn)使得MATPE 法提取百合多糖的工藝得到優(yōu)化。

表2 MATPE 法提取百合多糖的L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental design L9(34) and results of MATPE of lily polysaccharides

2.3 百合多糖純化

利用80%乙醇沉淀在最優(yōu)工藝參數(shù)組合下獲得的百合多糖提取物，然后經(jīng)透析和真空冷凍干燥后獲得百合多糖粗提物。百合多糖粗提物首先通過(guò)DEAE-52 纖維素柱層析法分離，分別利用去離子水和0.1 mol/L NaCl 溶液洗脫獲得兩個(gè)餾分（命名為L(zhǎng)P1 和LP2），其洗脫曲線如圖2A 所示。經(jīng)硫酸-苯酚法測(cè)定LP1 和LP2 得率分別為8.15%和12.73%。接下來(lái)本研究對(duì)主要餾分LP2 采用Sephadex G-100柱層析法（1.6 cm×50 cm）進(jìn)一步純化，濃縮和冷凍干燥，其結(jié)果如圖2B 所示。由圖2B 可知，LP2 經(jīng)Sephadex G-100 柱層析法純化后，獲得單一峰，命名為L(zhǎng)P2-SG，其純度為98.13%，冷凍干燥后，進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。

圖2 百合多糖粗提物的純化Fig.2 Purification of crude extracts of lily polysaccharide

2.4 百合多糖的紫外分析

利用紫外分光光度計(jì)對(duì)LP2-SG 在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，其結(jié)果如圖3 所示。由圖3 可知，LP2-SG 在260 nm 和280 nm 沒(méi)有吸收峰，表明LP2-SG 不含蛋白質(zhì)和核酸。

圖3 LP2-SG 紫外圖譜Fig.3 UV spectrum of LP2-SG

2.5 百合多糖的單糖組成和分子量

分子量是多糖的一個(gè)重要結(jié)構(gòu)指標(biāo)，它影響多糖的理化特性和生物學(xué)活性。通過(guò)HPGPC 法測(cè)定LP2-SG 的平均分子量，其結(jié)果如圖4A 所示。由圖4A 可知，LP2-SG 顯示了一個(gè)單一且對(duì)稱的峰，表明LP2-SG 是一種均一的多糖餾分。LP2-SG 的保留時(shí)間（TR）為16.83 min（圖4A），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方程（2）可計(jì)算LP2-SG 的平均分子量為530.51 kDa。該研究結(jié)果所得的百合多糖平均分子量大于Xue 等[22]文獻(xiàn)中報(bào)道的。這種現(xiàn)象可能歸于與百合原料的物種差異，提取、分離和純化的方式有關(guān)。為判斷LP2-SG 中單糖的組成，本研究利用GC 進(jìn)一步分析LP2-SG 的單糖組成，其結(jié)果如圖4B 所示。由圖4B可知，LP2-SG 由甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為11.63:29.85:8.46。結(jié)果表明，LP2-SG 屬于一種具有不同單糖組成的雜多糖，其中葡萄糖是主要單糖。

圖4 LP2-SG 分子量分布（A）和單糖組成（B）Fig.4 Molecular weight distribution (A) and monosaccharide composition (B) of LP2-SG

2.6 紅外光譜分析

利用紅外光譜儀對(duì)LP2-SG 在500～4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描，其結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，LP2-SG 在3345 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明該峰是由LP2-SG 結(jié)構(gòu)中的O-H 伸縮振動(dòng)引起的[14]；LP2-SG 在2925 cm-1處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明該峰是由LP2-SG 結(jié)構(gòu)中的C-H 伸縮振動(dòng)引起的[20]；LP2-SG在1732 cm-1處呈現(xiàn)出弱峰，這是由于LP2-SG 結(jié)構(gòu)中C=O 伸縮振動(dòng)引起的[22]。在1020、1080 和1151 cm-1處的三個(gè)拉伸峰表明LP2-SG 結(jié)構(gòu)中存在C-O 鍵和糖的吡喃糖形式[23]，進(jìn)一步表明LP2-SG 屬于均一的多糖餾分。

圖5 LP2-SG 的紅外圖譜Fig.5 IR spectra of LP2-SG

3 結(jié)論

本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化微波輔助雙水相提取百合多糖的工藝，最佳的工藝參數(shù)組合為：微波功率400 W、硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%和料液比1:30 g/mL，百合多糖得率為10.15%±0.11%。粗多糖經(jīng)依次通過(guò)DEAE-52 和Sephadex G-100 柱色譜法純化最終得到均一多糖餾分（LP2-SG），其分子量為530.51 kDa，單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾比為11.63:29.85:8.46。此外，LP2-SG 中無(wú)蛋白質(zhì)和核酸，具有典型的吡喃糖形式多糖吸收特性。本研究結(jié)果為百合多糖高效提取和深度加工 提供重要的科學(xué)依據(jù)。