一測(cè)多評(píng)法測(cè)定醋延胡索中5 種生物堿的含量

秦迎丹，宋 璇，孫 晨，劉 勃，郝玲花，孫玉琦,*

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧錦州 121001；2.廣州粵美醫(yī)藥科技有限公司，廣東廣州 510700）

延胡索又名元胡，具有悠久的食用和藥用歷史，其粉末加入紅糖水中可緩解腹痛[1]，加入三七大蒜糊中可緩解癌痛[2]。根據(jù)“醋注肝經(jīng)，且資住痛”理論，延胡索醋制后歸肝經(jīng)作用增強(qiáng)，因此多采用其醋制品來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[3]。生物堿類化合物是一類重要的天然產(chǎn)物，是（醋）延胡索發(fā)揮活性的主要成分[4-5]，主要包括原小檗堿類（叔胺類延胡索甲素、延胡索乙素和季胺類鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀）、原阿片類（原阿片堿）等生物堿類成分[6]，其中原阿片堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗癌等作用[7-8]；延胡索甲素、延胡索乙素同為延胡索行血鎮(zhèn)痛的主要活性成分，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保護(hù)胃腸道等作用[9-10]，鹽酸巴馬汀具有抗炎、抗菌、抗?jié)兊茸饔肹11-12]，鹽酸小檗堿具有抑菌、降糖、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[13-14]。上述5 種生物堿為其發(fā)揮活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[15]，因此將原阿片堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、延胡索乙素以及延胡索甲素選為指標(biāo)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

目前對(duì)醋延胡索的質(zhì)量控制中，一般僅針對(duì)延胡索乙素，難以全面控制其質(zhì)量，也有采用色譜法測(cè)定醋延胡索中多種生物堿類成分含量的報(bào)道[16-17]，但面臨指標(biāo)性成分選擇困難，對(duì)照品價(jià)格昂貴的問題。一測(cè)多評(píng)法（quantitative analysis of multi-componentsby single marker，QAMS）是利用有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，在僅測(cè)定一個(gè)成分（內(nèi)參物）的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分同步檢測(cè)的方法[18]，該方法通過建立內(nèi)參物與待測(cè)成分之間的相對(duì)校正因子（relative correction factory，RCF），作為計(jì)算多種待測(cè)成分含量的依據(jù)，解決單一指標(biāo)成分控制質(zhì)量不夠全面，多指標(biāo)成分控制質(zhì)量對(duì)照品價(jià)格昂貴、難以獲得全部的問題，已廣泛應(yīng)用于斑花黃堇、鉤藤、苦參等含有多種生物堿成分的中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)中[19-23]。

雖有采用一測(cè)多評(píng)法測(cè)定延胡索中多種生物堿含量的報(bào)道[24-25]，但關(guān)于一測(cè)多評(píng)方法應(yīng)用于醋延胡索的研究較少。因此本研究采用統(tǒng)一的醋制法對(duì)不同產(chǎn)地延胡索按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行炮制，旨在避免因炮制方法不同而導(dǎo)致的中藥材質(zhì)量差異，隨后通過梯度洗脫HPLC 色譜技術(shù)，選取價(jià)廉易得的延胡索乙素為內(nèi)參物，擬合延胡索乙素與各生物堿類成分的相對(duì)校正因子，通過只測(cè)定延胡索乙素的含量，實(shí)現(xiàn)對(duì)醋延胡索中原阿片堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及延胡索甲素延胡索含量的同步，減少了對(duì)照品的使用數(shù)量，降低了檢測(cè)成本，為醋延胡索中生物堿類成分的含量測(cè)定提供了新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

延胡索 10 批不同產(chǎn)地樣品，信息來源見表1，經(jīng)鑒定均為罌粟科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖；氨水（分析純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；米醋 廣東李錦記食品有限公司；乙腈（色譜純） 北京Dimka 公司；磷酸（分析純） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醇（分析純） 天津大茂化學(xué)試劑廠；超純水；原阿片堿（批號(hào)：110853-201805，純度：99.6%）、延胡索甲素（批號(hào)：110720-202019，純度：99.5%）、鹽酸巴馬汀（批號(hào)：110732-201913，純度：85.7%）、延胡索乙素（批號(hào)：110726-202020，純度：99.3%）、鹽酸小檗堿（批號(hào)：110713-202015，純度：85.9%） 中國食品藥品檢定研究院。

表1 延胡索樣品來源信息Table 1 Source information of Corydalis yanhusuo samples

日立Chromaster 液相色譜儀（配有5410 型檢測(cè)器、5310 型柱溫箱、5210 型自動(dòng)進(jìn)樣器、5110 二元梯度洗脫泵） 日本HITACHI 公司；VGT-1990QTD型超聲波清洗器 蘇州江東精密儀器限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；JJ124BF型天平 上海精勝科學(xué)儀器有限公司；YB-2500A 粉碎機(jī) 永康式速峰工貿(mào)有限公司；DF 型真空干燥箱 上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、延胡索甲素對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成濃度為96.00 μg/mL原阿片堿、24.00 μg/mL 鹽酸巴馬汀、62.50 μg/mL 鹽酸小檗堿、120.50 μg/mL 延胡索乙素與100.50 μg/mL延胡索甲素的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。取1 mL 上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，制成含19.20 μg/mL 原阿片堿、4.80 μg/mL 鹽酸巴馬汀、12.50 μg/mL 鹽酸小檗堿、24.10 μg/mL 延胡索乙素與20.10 μg/mL 延胡索甲素的混合對(duì)照品溶液。

1.2.2 醋延胡索樣品的制備 將10 批延胡索樣品，按《中國藥典》2020 年版[26]醋灸法炮制：取凈延胡索薄片，稱重，取20 g 延胡索藥材，用4 g 米醋拌勻，置于密閉容器中，加蓋悶潤，待醋被吸進(jìn)后，翻炒至表面顏色略為加深，取出、置于真空干燥箱中，干燥后用中藥粉碎機(jī)粉碎，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 取“1.2.2”項(xiàng)下醋延胡索粉末（過三號(hào)篩）0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入濃氨試液-甲醇（1:20）混合溶液50 mL，稱重，60 ℃回流提取1 h，冷卻，再稱重，用濃氨試液-甲醇（1:20）補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干，加甲醇溶解殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)移到5 mL 量瓶中，加入甲醇定容，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得[27]。

1.2.4 液相色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（三乙胺調(diào)至pH6.0，B）；梯度洗脫（0～15 min，22%A；15～35 min，22%～80% A；35～50 min，80% A）；檢測(cè)波長為280 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；理論塔板數(shù)按延胡索乙素計(jì)不低于3000；分離度>1.5.

1.2.5 QAMS 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限 精密取“1.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，精確取0.25、0.5、1、2、4 mL 的混和對(duì)照品溶液液，分別置于5 mL 容量瓶中，加甲醇定容，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以不同對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，計(jì)算回歸方程。取“1.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋，按“1.2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算信噪比（S/N），以S/N=3 時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析物濃度為檢出限，S/N=10 時(shí)對(duì)應(yīng)的待分析物濃度為定量限。

1.2.5.2 相對(duì)校正因子 采用多點(diǎn)校正法[28]，精密取混合對(duì)照品溶液，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣1、2、5、8、10、20 μL。記錄各成分色譜峰峰面積，以延胡索乙素為內(nèi)參物（S），按下列公式計(jì)算各成分的相對(duì)校正因子（fi/s）：

式中： fi/s表示相對(duì)校正因子；AS表示內(nèi)參物的峰面積，mAU·min；CS表示內(nèi)參物的濃度，μg/mL；Ai表示待測(cè)成分的峰面積，mAU·min；Ci表示待測(cè)成分的濃度，μg/mL。

1.2.5.3 待測(cè)組分色譜峰定位 利用相對(duì)保留時(shí)間法[29]ri/s=ti/ts（ti：待測(cè)成分的保留時(shí)間，min；ts：內(nèi)參物的保留時(shí)間，min；ri/s為二者的比值即相對(duì)保留時(shí)間）。對(duì)不同儀器和色譜柱、不同體積流量、不同柱溫的待測(cè)組分色譜峰進(jìn)行定位；根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算公式，已知內(nèi)參物延胡索乙素的保留時(shí)間，根據(jù)對(duì)原阿片堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、延胡索甲素的相對(duì)保留時(shí)間以及各生物堿的峰型進(jìn)行定位。

1.2.5.4 精密度、重復(fù)性、重復(fù)性和平均回收率 精確移取“1.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1 份，進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)；精密稱定醋延胡索樣品（S1）1 份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄5 種生物堿的峰面積并計(jì)算RSD值，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)；精密稱定醋延胡索樣品（S1）1 份，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣測(cè)定，記錄5 種生物堿的峰面積并計(jì)算RSD 值，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)；精密稱定醋延胡索樣品（S1）9 份，每份0.25 g，分別精密加入相當(dāng)于供試品中待測(cè)成分含量的80%、100%、120%的混合對(duì)照品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)。

1.2.5.5 耐用性和系統(tǒng)適用性 精密取混合對(duì)照品溶液10 μL，按“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，考察不同實(shí)驗(yàn)室的兩套液相色譜Hitachi Chromaster、Hitachi ELITE LaChrom 系統(tǒng)及三種不同色譜柱Promosil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同柱溫（25、30、35 ℃）對(duì)相對(duì)校正因子的影響。

1.2.6 生物堿含量測(cè)定 分別取經(jīng)炮制的10 批醋延胡索藥材，按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液、“1.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，每份測(cè)定三次，分別采用外標(biāo)法[30]（external standard method，ESM）Cx=Cr×Ax/Ar（Cx 為樣品濃度，μg/mL；Cr 為對(duì)照濃度，μg/mL；Ax 為樣品峰面積，mAU·min；Ar 為對(duì)照峰面積，mAU·min）和建立的QAMS 測(cè)定醋延胡索樣品中原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、延胡索甲素5 種生物堿的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和分析，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 27.0 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 QAMS 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 線性關(guān)系 記錄5 種生物堿混合對(duì)照品色譜圖如圖1。以不同對(duì)照品溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，這5 種生物堿在線性范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r>0.9992。以S/N=3 時(shí)計(jì)算得出檢出限為0.036～0.089 μg/mL，S/N=10 時(shí)計(jì)算得出定量限為0.127～0.314 μg/mL。

圖1 5 種生物堿混合對(duì)照品溶液HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatographic diagram of five alkaloid mixed reference solutions

表2 對(duì)照品的線性關(guān)系、檢出限與定量限Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of reference substance

2.1.2 相對(duì)校正因子 按“1.2.5.2”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，以延胡索乙素為內(nèi)參物，計(jì)算原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索甲素相對(duì)校正因子，取相對(duì)校正因子的平均值為定量用的fi/s，結(jié)果見表3，可知，原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索甲素相對(duì)于延胡索乙素的fi/s分別為1.71、1.91、2.63、0.75，RSD 值<3%。

表3 醋延胡索中4 個(gè)成分的相對(duì)校正因子Table 3 Relative correction factors of four components in vinegar Corydalis yanhusuo

2.1.3 待測(cè)組分色譜峰定位 按“1.2.5.3”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索甲素相對(duì)于延胡索乙素的相對(duì)保留時(shí)間ri/s和ri/s的RSD，結(jié)果見表4，可知不同儀器與色譜柱、不同體積流量、不同柱溫的RSD 值均<3%，對(duì)相對(duì)保留值影響較小，表明相對(duì)保留時(shí)間法可用于待測(cè)組分色譜峰的定位。

2.1.4 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和回收率 按“1.2.5.4”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，5 種生物堿的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及加樣回收率考察結(jié)果見表5，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性RSD 均小于2%，平均回收率在98.38%～101.28%之間，RSD 值均小于2%，表明該方法精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性及回收率良好。

表5 5 種生物堿的精密度、穩(wěn)定性重復(fù)性和回收率Table 5 Precision, stability, repeatability and recovery of five alkaloids

2.1.5 耐用性和系統(tǒng)適用性 按“1.2.5.5”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)、按“1.2.5.2”項(xiàng)下方法計(jì)算原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索甲素相對(duì)于延胡索乙素的校正因子fi/s和fi/s的RSD 值，結(jié)果見表6，可知不同儀器與色譜柱、不同流速及柱溫對(duì)醋延胡索中各生物堿類成分的fi/s的RSD 值均<3%，表明色譜柱、儀器的更換、流速及柱溫的微小變化對(duì)fi/s無顯著影響。

表6 不同因素對(duì)相對(duì)校正因子的影響Table 6 Effects of different factors on relative correction factors

2.2 生物堿含量測(cè)定

按“1.2.6”項(xiàng)下進(jìn)行試驗(yàn)，記錄時(shí)色譜圖（S1、圖2A），分別采用ESM 與建立的QAMS 測(cè)定醋延胡索樣品中原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、延胡索甲素5 種生物堿的含量，10 批樣品的HPLC 見圖2B，含量測(cè)定平均值結(jié)果見表7，采用SPSS 軟件t檢驗(yàn)對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析比較，結(jié)果原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和延胡索甲素的ESM 值和QAMS 值兩組方法的P>0.05，故原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿和延胡索甲素的ESM 值和QAMS 值間無顯著差異（P>0.05），表明建立的QAMS 法準(zhǔn)確可行。

圖2 醋延胡索樣品HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of vinegar Corydalis yanhusuo

表7 醋延胡索中5 種生物堿含量測(cè)定結(jié)果（mg/g）Table 7 Determination results of five alkaloids in vinegar Corydalis yanhusuo (mg/g)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立一測(cè)多評(píng)法（QAMS）用于測(cè)定醋延胡索中5 種生物堿類成分的含量，考察了精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性以及回收率，經(jīng)考察精密度、重復(fù)性及穩(wěn)定性的RSD 值小于2%，平均回收率98.38%～101.28%之間，均符合要求。同時(shí)考察了不同儀器和不同色譜柱、不同體積流量、不同柱溫下各成分間的相對(duì)校正因子及相對(duì)保留時(shí)間的變化，RSD 值均小于3%，表明該方法具有良好的適應(yīng)性且在不同的因素下均能行準(zhǔn)確定位。本實(shí)驗(yàn)還對(duì)ESM 法測(cè)得不同產(chǎn)地醋延胡索中的原阿片堿、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、延胡索乙素、延胡索甲素進(jìn)行含量測(cè)定，ESM 含量測(cè)定值和QAMS 計(jì)算值利用SPSS 軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果表明2 種方法含量測(cè)定的結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)后無顯著差異（P>0.05），說明建立的QAMS 法結(jié)果準(zhǔn)確、方法可行。采用QAMS 法測(cè)定醋延胡索中各生物堿成分含量能極大地減少對(duì)照品使用數(shù)量，節(jié)約成本，增加檢測(cè)便利性，因此該方法可應(yīng)用于醋延胡索的含量測(cè)定，期待為醋延胡索的制劑加工、質(zhì)量評(píng)價(jià)與臨床應(yīng)用提供依據(jù)。