盒裝豆腐的貯藏特性、腐敗菌分離鑒定及腐敗特性研究

聶遠(yuǎn)洋，盧 森，龔藝松，李勝利，李 波,*

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.河南省果蔬加工及質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453003；3.鄭州新農(nóng)源綠色食品有限公司，河南鄭州 450199）

豆腐富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]，深受大眾喜愛(ài)。按照使用凝固劑的不同，豆腐可分為老豆腐（北豆腐）、嫩豆腐（南豆腐）、酸漿豆腐（豆清豆腐）和內(nèi)酯豆腐[3-6]。豆腐常見(jiàn)的包裝方式有盒裝和散裝，其中較大規(guī)模的豆制品企業(yè)一般采用塑料盒密封包裝的方式，而豆腐作坊一般采用大塊散裝的方式[7]。盒裝豆腐采用巴氏殺菌，衛(wèi)生安全，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。但由于豆腐含水量高、營(yíng)養(yǎng)豐富，容易發(fā)生腐敗變質(zhì)，導(dǎo)致豆腐產(chǎn)品貨架期較短，對(duì)豆制品企業(yè)擴(kuò)大銷售半徑、提高產(chǎn)量規(guī)模產(chǎn)生較大影響，也容易引發(fā)食品安全問(wèn)題[8]。因此，如何有效控制盒裝豆腐的微生物數(shù)量，延長(zhǎng)產(chǎn)品的保藏期，是提升豆制品企業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力亟待解決的問(wèn)題。

已有研究表明，豆腐產(chǎn)地、種類、生產(chǎn)季節(jié)、加工工藝、包裝方式和貯藏條件的不同可能會(huì)導(dǎo)致豆腐腐敗菌種類的差異。韓翠萍等[9]從散裝豆腐和盒裝豆腐中分離出4 株優(yōu)勢(shì)腐敗微生物，分別為溶血性葡萄球菌、克假絲酵母、短芽孢桿菌、托爾豪特鏈球菌。王宸之等[10]在全豆豆腐中分離出蠟狀芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌。鄭玉璽等[11]在不同產(chǎn)地不同盒裝豆腐中分離出枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。吳麗櫻[12]在盒裝內(nèi)酯豆腐中分離出枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌，在簡(jiǎn)易包裝老豆腐中分離出庫(kù)特氏菌、熒光假單胞菌、腸膜明串珠菌和產(chǎn)氣腸桿菌。Lee 等[13]在變質(zhì)豆腐中分離出蠟樣芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌。Rossi 等[14]在小規(guī)模豆腐企業(yè)生產(chǎn)的豆腐中分離出魏氏菌屬、乳酸乳球菌、腸球菌等。Ananchaipattana 等[15]在豆腐樣品中分離出大腸桿菌、假單胞菌、乳酸菌、葡萄球菌和芽孢桿菌等。Fouad 等[16]在2～3 ℃保存的真空包裝豆腐分離出了乳酸菌、腸道細(xì)菌和假單胞菌屬。然而，不同種類的腐敗菌與豆腐的腐敗性狀相關(guān)性如何，不同腐敗階段何種腐敗菌發(fā)揮主要作用等，還鮮有研究。

河南是人口大省和豆腐消費(fèi)大省，也是北豆腐或老豆腐的典型產(chǎn)區(qū)。目前有關(guān)河南地區(qū)盒裝豆腐腐敗微生物的研究鮮有報(bào)道。本文以河南省豆制品龍頭企業(yè)—鄭州新農(nóng)源綠色食品有限公司生產(chǎn)的盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐為研究對(duì)象，研究不同貯藏溫度下盒裝豆腐的保存期，并對(duì)其腐敗微生物進(jìn)行分離鑒定，通過(guò)回接實(shí)驗(yàn)探明主要微生物生長(zhǎng)導(dǎo)致豆腐腐敗的腐敗性狀，以期為盒裝豆腐生產(chǎn)和貯運(yùn)過(guò)程中的微生物控制提供理論依據(jù)，并為企業(yè)下一步開發(fā)有針對(duì)性的芽孢控制技術(shù)提供菌種來(lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

盒裝老豆腐（L）、盒裝內(nèi)酯豆腐（N） 鄭州新農(nóng)源綠色食品有限公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉 天津市大茂化學(xué)試劑廠；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、λDNA HindIII Marker、D2000 DNA Marker、ddH2O、2×Taq PCR MasterMix II 天根生化科技（北京）有限公司；革蘭氏染色試劑盒、50×TAE 電泳緩沖液、6×DNA 上樣緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖、Goldview 核酸染料 北京蘭杰柯科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 小量回收試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；16S rRNA 通用引物（27F 和1492R） 生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

XFH-50CA 電熱式壓力蒸汽滅菌器 浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2D 超凈工作臺(tái) 上海尚道儀器制造有限公司；ME104E 電子天平 托利多儀器（上海）有限公司；SPX-250B 生化培養(yǎng)箱 上海坤天實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司；Axio Vert.A1 倒置顯微鏡德國(guó)卡爾蔡司顯微鏡有限公司；Pico 17 高速離心機(jī)賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司；TProfessionaL standard 96 Gradient 梯度PCR 儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份公司；JY600 電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Tanon-5200MuLti 全自動(dòng)凝膠圖像分析系統(tǒng)上海天能科技有限公司；FE28-Micro pH 計(jì) 梅特勒-托里多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集與處理 取生產(chǎn)線上經(jīng)巴氏殺菌并冷卻后的新鮮盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐，2 h 內(nèi)由2～8 ℃冷藏車運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。新鮮樣品立即進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和菌落總數(shù)測(cè)定，并分離腐敗菌。其余樣品分別在4、25、37 ℃下放置，分別每隔3 d、12 h、6 h 進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和菌落總數(shù)測(cè)定，直至樣品腐敗變質(zhì)。完全腐敗后（感官評(píng)分低于5.5 分）的樣品用于分離腐敗菌。不同處理樣品標(biāo)注見(jiàn)表1。

表1 盒裝豆腐不同類型和貯藏條件的樣品標(biāo)注Table 1 Sample labeling of boxed tofu for different types and storage conditions

1.2.2 感官評(píng)價(jià) 選擇10 名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)的專業(yè)人員，參照鄭玉璽[17]的感官評(píng)分表并稍作修改，對(duì)樣品的氣味、色澤、口感、組織狀態(tài)進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分別見(jiàn)表2 和表3。根據(jù)Torry[18]方案當(dāng)樣品的感官評(píng)分在5.5 分以下時(shí)，即認(rèn)為樣品已經(jīng)達(dá)到不可接受狀態(tài)，即達(dá)到腐敗標(biāo)準(zhǔn)。

表2 盒裝老豆腐感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of boxed firm tofu

表3 盒裝內(nèi)酯豆腐感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory evaluation standards of boxed lactone tofu

1.2.3 菌落總數(shù)的測(cè)定 參考GB 4789.2-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)的測(cè)定》中所規(guī)定的方法對(duì)樣品的菌落總數(shù)進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.2.4 腐敗菌的分離純化 無(wú)菌操作下取25 g 豆腐樣品置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 無(wú)菌生理鹽水，充分拍打混勻，以10 倍稀釋法稀釋若干倍。選取合適的稀釋梯度，分別吸取200 μL 樣液均勻涂布在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。挑取5～10 個(gè)形態(tài)特征差異明顯的單個(gè)菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～24 h。重復(fù)上述劃線分離步驟，直至得到純菌株。將純化后的腐敗菌接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 120 r/min 振蕩培養(yǎng)18～24 h，取部分培養(yǎng)液用20%甘油在-20 ℃保藏菌種，部分培養(yǎng)液用于革蘭氏染色和細(xì)菌基因組DNA 提取。

1.2.5 腐敗菌的形態(tài)觀察 腐敗菌經(jīng)革蘭氏染色后，在顯微鏡油鏡下觀察其形態(tài)特征，根據(jù)染色結(jié)果及細(xì)胞形態(tài)簡(jiǎn)單分類。

1.2.6 腐敗菌的16S rRNA 分子鑒定 采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取腐敗菌基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)提取結(jié)果，然后進(jìn)行16S rRNA PCR 擴(kuò)增。通用引物[20]：27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R 5’-GGT TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 4 μL，引物27F 2 μL，引物1492R 2 μL，2×Taq PCR MasterMix 25 μL，ddH2O 17 μL。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s），72 ℃延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切下長(zhǎng)度1500 bp 左右目標(biāo)條帶，采用瓊脂糖凝膠DNA 小量回收試劑盒純化PCR 產(chǎn)物。純化產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。獲得的序列在NCBI 上利用BLAST 搜索與已知種屬最接近的序列，進(jìn)行同源性比對(duì)分析。

1.2.7 腐敗菌回接 取樣新鮮老豆腐和內(nèi)酯豆腐，在無(wú)菌環(huán)境下分割成4 cm×4 cm×4 cm 的小塊，放入無(wú)菌袋中，95 ℃殺菌30 min，以減少樣品初始菌量，冷卻至室溫備用。

保藏菌種解凍后，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃ 120 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)確定活化腐敗菌的濃度，根據(jù)新鮮豆腐樣品的質(zhì)量添加菌液，腐敗菌的添加量為103CFU/g，用無(wú)菌涂布棒將菌液均勻涂抹于豆腐表面，隨即密封。腐敗菌回接后的豆腐樣品在25 ℃下貯藏，每隔12 h 記錄其腐敗特征，測(cè)定菌落總數(shù)和pH。

1.2.8 腐敗特征的描述 記錄腐敗菌回接樣品貯藏過(guò)程中是否出現(xiàn)發(fā)酸、發(fā)臭、發(fā)黏、褐變、產(chǎn)生刺激性氣味、脹袋等腐敗特征。

1.2.9 pH 的測(cè)定 無(wú)菌操作下取25 g 樣品，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，加入225 mL 滅菌生理鹽水，充分拍打混勻，制成10-1稀釋液，用pH 計(jì)測(cè)定pH。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n＝3）表示。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性差異分析為單因素方差分析，多重比較采用LSD 檢驗(yàn)，P<0.05具有顯著性差異。采用Origin 2021 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對(duì)盒裝豆腐保存期的影響

豆腐的保存期可分別用感官評(píng)分和菌落總數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)感官評(píng)分為5.5 時(shí)，可認(rèn)為豆腐樣品已達(dá)到感官拒絕狀態(tài)。一般認(rèn)為，食品能被接受的最大微生物限量值為7 lg CFU/g[21-22]。將盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐分別置于4、25、37 ℃進(jìn)行貯藏，分別每隔3 d、12 h、6 h 進(jìn)行感官評(píng)價(jià)和菌落總數(shù)測(cè)定，其在貯藏期間的感官評(píng)分和菌落總數(shù)變化見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 4 ℃貯藏盒裝豆腐感官評(píng)分和菌落總數(shù)變化Fig.1 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 4 ℃

圖2 25 ℃貯藏盒裝豆腐感官評(píng)分和菌落總數(shù)變化Fig.2 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 25 ℃

圖3 37 ℃貯藏盒裝豆腐感官評(píng)分和菌落總數(shù)變化Fig.3 Changes of sensory score and total number of colonies of boxed tofu stored at 37 ℃

結(jié)果顯示，貯藏溫度為4 ℃時(shí)，盒裝豆腐在30 d時(shí)仍未達(dá)到感官拒絕狀態(tài)，菌落總數(shù)低于4 lg CFU/g。貯藏溫度為25 ℃時(shí)，盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐分別在36 和48 h 左右達(dá)到感官拒絕狀態(tài)，菌落總數(shù)均超過(guò)7 lg CFU/g。貯藏溫度為37 ℃時(shí)，盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐分別在12 和30 h 左右達(dá)到感官拒絕狀態(tài)，菌落總數(shù)也超過(guò)7 lg CFU/g。由此可見(jiàn)，貯藏溫度對(duì)盒裝豆腐的保存期有較大影響，溫度越低保存期越長(zhǎng)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，盒裝內(nèi)酯豆腐的保存期略長(zhǎng)于老豆腐，這與二者的加工方式不同有關(guān)。內(nèi)酯豆腐生產(chǎn)時(shí)，豆?jié){加入凝固劑葡萄糖酸內(nèi)酯后即進(jìn)行裝盒密封，然后經(jīng)升溫成型，煮后的豆?jié){與外界環(huán)境接觸時(shí)間較短[23]。老豆腐生產(chǎn)時(shí)，豆?jié){加入凝固劑后要經(jīng)過(guò)蹲腦、壓制、分切等處理后才裝盒密封，與外界環(huán)境接觸時(shí)間較長(zhǎng)，污染殘存的微生物數(shù)量較多，故保存期較短。此外，當(dāng)樣品達(dá)到感官拒絕狀態(tài)前，其菌落總數(shù)已經(jīng)達(dá)到7 lg CFU/g，表明在界定盒裝豆腐的腐敗標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，感官評(píng)價(jià)要遲滯于微生物指標(biāo)。

通過(guò)前期的調(diào)研可知，該企業(yè)盒裝豆腐產(chǎn)品標(biāo)注的保存期是1～7 ℃下10 d，企業(yè)采用冷庫(kù)貯藏和冷藏車運(yùn)輸，能夠較好保持低溫環(huán)境，但產(chǎn)品運(yùn)輸?shù)匠泻蟮馁A藏和銷售溫度難以保證，有些消費(fèi)者也未能將所購(gòu)產(chǎn)品及時(shí)置于冰箱中冷藏，導(dǎo)致產(chǎn)品實(shí)際的保存期受到較大影響。因此，增強(qiáng)銷售商的冷藏意識(shí)和管理水平，以及消費(fèi)者的食品保藏知識(shí)，對(duì)提升豆腐等易腐食品的安全性、延長(zhǎng)保存期、降低銷售損耗具有重要意義。

2.2 盒裝豆腐中腐敗菌的分離純化結(jié)果

從新鮮的和不同溫度貯藏后腐敗變質(zhì)的盒裝豆腐樣品中共分離出52 株不同菌落形態(tài)的腐敗菌。革蘭氏染色結(jié)果顯示大多數(shù)腐敗菌為革蘭氏陽(yáng)性菌（40 株），少數(shù)腐敗菌為革蘭氏陰性菌（12 株）；腐敗菌在細(xì)胞形態(tài)上多呈桿狀，其中46 株為桿菌，6 株為球菌。部分腐敗菌的菌落特征和細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖4 和圖5。韓翠萍等[9]從腐敗散裝與盒裝豆腐中均分離出4 株腐敗菌，其中3 株為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，1 株為革蘭氏陽(yáng)性酵母；鄭玉璽[17]從不同產(chǎn)地不同種類豆腐中分離純化得8 株純菌株，均為革蘭氏陽(yáng)性菌，其中6 株均為桿菌，2 株為球菌。本研究分離的豆腐腐敗菌在革蘭氏染色和細(xì)胞形態(tài)上與前人的研究結(jié)果一致，即大部分腐敗菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，呈桿狀。

圖4 盒裝老豆腐部分腐敗菌菌落特征及細(xì)胞形態(tài)（1000×）Fig.4 Colony characteristics and cell morphology of some spoilage bacteria from boxed firm tofu (1000×)

圖5 盒裝內(nèi)酯豆腐部分腐敗菌菌落特征及細(xì)胞形態(tài)（1000×）Fig.5 Colony characteristics and cell morphology of some spoilage bacteria from boxed lactone tofu (1000×)

2.3 盒裝豆腐腐敗菌的菌種鑒定結(jié)果

對(duì)盒裝豆腐中分離純化出的腐敗菌進(jìn)行16S rRNA 分子鑒定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 顯示，每種豆腐樣品的腐敗菌為6～7 株。腐敗菌主要為芽孢桿菌（共43 株），包括蠟樣芽孢桿菌（11 株）、芽孢桿菌屬（9 株）、枯草芽孢桿菌（7 株）、地衣芽孢桿菌（3 株）、魯梅爾芽胞桿菌（3 株）、土壤芽孢桿菌（2 株）、特基拉芽孢桿菌（2 株），賴氨酸芽孢桿菌、蘇云金芽胞桿菌、咸海鮮芽孢桿菌、暹羅芽孢桿菌、短芽孢桿菌屬、短小芽孢桿菌各1 株。其他腐敗菌包括金黃桿菌屬、屎腸球菌、耐久腸球菌各2 株，成團(tuán)泛菌、葡萄球菌、乳微桿菌各1 株。由此可見(jiàn)，芽孢桿菌是盒裝豆腐腐敗菌中的優(yōu)勢(shì)菌，這與鄭玉璽等[11]、吳麗櫻等[24]、王敏等[25]的研究結(jié)果一致。

表5 顯示，豆腐類型和貯藏溫度對(duì)腐敗菌的種類也有一定影響。貯藏溫度對(duì)盒裝內(nèi)酯豆腐腐敗菌多樣性的影響較大，對(duì)盒裝老豆腐影響較小，而且4 和25 ℃貯藏的盒裝內(nèi)酯豆腐腐敗菌種類比其他樣品都要豐富。當(dāng)貯藏溫度為4 ℃時(shí)，盒裝內(nèi)酯豆腐中的腐敗菌為芽孢桿菌屬（1 株）、腸球菌屬（2 株）和金黃桿菌屬（2 株）。其余樣品中腐敗菌多為芽孢桿菌屬。由于低溫會(huì)顯著抑制大多數(shù)微生物的代謝活動(dòng)，且4 ℃貯藏樣品分離腐敗菌時(shí)，樣品并未達(dá)到腐敗狀態(tài)，因此導(dǎo)致4 ℃貯藏盒裝老豆腐和盒裝內(nèi)酯豆腐腐敗菌種類的差異。同時(shí)盒裝老豆腐和盒裝內(nèi)酯豆腐兩者的加工方式、原輔料、機(jī)械化程度的不同都會(huì)導(dǎo)致其在不同貯藏溫度時(shí)腐敗菌種類的差異。吳麗櫻[12]研究發(fā)現(xiàn)不同貯藏溫度對(duì)簡(jiǎn)易包裝老豆腐的腐敗菌菌相有較大影響，鄭玉璽[17]報(bào)道不同貯藏溫度下盒裝豆腐腐敗菌多樣性也會(huì)發(fā)生較大變化，這與本研究結(jié)果相似。

表5 盒裝豆腐中腐敗菌的分布情況Table 5 Distribution of spoilage bacteria in boxed tofu

2.4 盒裝豆腐腐敗菌的腐敗性狀和生長(zhǎng)特性

根據(jù)腐敗菌分離鑒定結(jié)果，分別從盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐中選取出現(xiàn)頻率較高的腐敗菌各5 株（見(jiàn)表6），將每株菌分別回接到滅菌后的盒裝豆腐樣品中，在25 ℃下貯藏，觀察其腐敗性狀、菌落總數(shù)和pH 的變化情況。

表6 回接實(shí)驗(yàn)中選取的腐敗菌菌株Table 6 Spoilage strains selected in the back inoculation experiment

2.4.1 腐敗菌的腐敗性狀 表7 和表8 顯示，接種腐敗菌的盒裝老豆腐樣品和空白的老豆腐樣品25 ℃貯藏時(shí)，在24 h 出現(xiàn)腐敗性狀（枯草芽孢桿菌除外），接種腐敗菌的盒裝內(nèi)酯豆腐樣品25 ℃貯藏時(shí)，在12 h 即出現(xiàn)腐敗性狀，而空白內(nèi)酯豆腐樣品在24 h出現(xiàn)腐敗性狀。表明回接腐敗菌的內(nèi)酯豆腐較老豆腐更容易腐敗，這可能是由于回接至內(nèi)酯豆腐中的腐敗菌（如成團(tuán)泛菌、屎腸球菌、短小芽孢桿菌）其代謝分解豆腐中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速率快于回接至老豆腐中的腐敗菌（如耐久腸球菌、土壤芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌）。腐敗初期（12～24 h）的性狀大體表現(xiàn)為腐敗味、發(fā)粘等，中期（36～48 h）則表現(xiàn)為酸腐味、發(fā)粘、刺激性氣味等，后期（60 h）出現(xiàn)臭味、脹袋等性狀。老豆腐和內(nèi)酯豆腐的腐敗性狀有明顯差異，可能與二者的制作工藝、所用凝固劑不同有關(guān)[7]，也與二者的含水量、pH 有關(guān)[4-6]。不同腐敗菌的腐敗性狀也有一定差異，如蠟樣芽孢桿菌會(huì)導(dǎo)致老豆腐發(fā)生褐變，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌引起老豆腐脹袋；成團(tuán)泛菌會(huì)在內(nèi)酯豆腐表面形成一層菌膜，短小芽孢桿菌則在內(nèi)酯豆腐中產(chǎn)生黏液；不同腐敗菌均會(huì)引起內(nèi)酯豆腐產(chǎn)生刺激性氣味和脹袋。韓翠萍等[9]發(fā)現(xiàn)克假絲酵母、溶血性葡萄球菌及托爾豪特鏈球菌是導(dǎo)致豆腐發(fā)粘、漲袋及質(zhì)構(gòu)變軟的主要微生物，而短芽孢桿菌對(duì)豆腐腐敗變質(zhì)無(wú)明顯影響。綜上，豆腐的不同產(chǎn)地、來(lái)源和種類及貯藏時(shí)間都會(huì)直接影響其腐敗進(jìn)程和性狀，豆腐的最終腐敗性狀也是各種腐敗菌綜合作用所致。

表7 盒裝老豆腐回接腐敗菌后的腐敗性狀Table 7 Spoilage characters of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

表8 盒裝內(nèi)酯豆腐回接腐敗菌后的腐敗性狀Table 8 Spoilage characters of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

2.4.2 腐敗菌的生長(zhǎng)特性 圖6 顯示，回接腐敗菌后盒裝老豆腐樣品的菌落總數(shù)在前24 h 快速增長(zhǎng)，之后趨于平緩?；亟涌莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌樣品的菌落總數(shù)增速快于空白樣品，而回接耐久腸球菌、蠟樣芽孢桿菌和土壤芽孢桿菌的增速慢于空白樣品，表明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌可能在盒裝老豆腐的腐敗初期（12～24 h）發(fā)揮主要作用。圖7 顯示，回接腐敗菌后的內(nèi)酯豆腐樣品也是在前24 h 菌落總數(shù)增幅較快，之后有所趨緩?；亟映蓤F(tuán)泛菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌樣品的菌落總數(shù)增速快于空白樣品，回接屎腸球菌和短小芽孢桿菌的增速慢于空白樣品，結(jié)合腐敗性狀（表8）來(lái)看，接種成團(tuán)泛菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌后12 h 即出現(xiàn)腐敗味，而空白在24 h 才出現(xiàn)，表明成團(tuán)泛菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌可能在盒裝內(nèi)酯豆腐的腐敗初期（12～24 h）發(fā)揮主要作用。

圖6 盒裝老豆腐回接腐敗菌后的菌落總數(shù)變化情況Fig.6 Changes of the total number of colonies of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

圖7 盒裝內(nèi)酯豆腐回接腐敗菌后的菌落總數(shù)變化情況Fig.7 Changes of the total number of colonies of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

2.4.3 pH 的變化情況 圖8 和圖9 顯示，回接腐敗菌后的豆腐樣品隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)pH 逐漸降低，其中盒裝老豆腐樣品的pH 從初始的6.5 左右降至60 h最低的5.0 左右，盒裝內(nèi)酯豆腐樣品的pH 從初始的5.7 左右降至60 h 最低的4.7 左右，從而導(dǎo)致豆腐在貯藏后期呈現(xiàn)酸腐味或酸臭味。老豆腐樣品在貯藏前24 h 的pH 降速較快，與感官評(píng)價(jià)中的酸腐味出現(xiàn)時(shí)間一致（表7），隨后降幅趨于平緩，其中枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的pH 變化趨勢(shì)與空白樣品幾乎一致，前24 h 的pH 降幅較快，之后則趨于穩(wěn)定，但始終低于空白樣品，結(jié)果與其菌落總數(shù)的增速快于空白有關(guān)（圖6）。由于凝固劑的原因，內(nèi)酯豆腐的初始pH 低于老豆腐，其中屎腸球菌pH 的變化趨勢(shì)與空白樣品接近，而成團(tuán)泛菌的pH 最低，這與其菌落總數(shù)的增長(zhǎng)最快有關(guān)（圖7）。

圖8 盒裝老豆腐回接腐敗菌后pH 的變化情況Fig.8 Changes of pH of boxed firm tofu after back inoculated with spoilage bacteria

圖9 盒裝內(nèi)酯豆腐回接腐敗菌后pH 的變化情況Fig.9 Changes of pH of boxed lactone tofu after back inoculated with spoilage bacteria

3 結(jié)論

貯藏溫度對(duì)盒裝豆腐保存期和主要腐敗菌的影響較大。4 ℃貯藏時(shí)盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐的保存期均超過(guò)30 d，25 ℃貯藏時(shí)盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐的保存期約為36 和48 h，37 ℃貯藏時(shí)盒裝老豆腐和內(nèi)酯豆腐的保存期僅為12 和30 h 左右。因此，增強(qiáng)豆腐銷售商的冷藏意識(shí)和管理水平，以及消費(fèi)者的食品保藏知識(shí)，有助于提升豆腐等易腐食品的安全性，延長(zhǎng)保存期，減少銷售損耗。從新鮮和不同溫度貯藏腐敗變質(zhì)的盒裝豆腐中分離鑒定出52 株腐敗菌，主要為芽孢桿菌（共43 株）。貯藏溫度對(duì)盒裝內(nèi)酯豆腐腐敗菌的多樣性影響較大，對(duì)盒裝老豆腐影響較小，且4 和25 ℃盒裝內(nèi)酯豆腐的腐敗菌種類較為豐富。分別選取出現(xiàn)頻率較高的5 株腐敗菌回接到滅菌后的盒裝豆腐樣品中，盒裝內(nèi)酯豆腐在常溫貯藏12 h 出現(xiàn)腐敗性狀，老豆腐樣品在24 h 出現(xiàn)腐敗性狀（枯草芽孢桿菌除外）。腐敗初期（12～24 h）的性狀大體表現(xiàn)為腐敗味、發(fā)粘等，中期（36～48 h）則表現(xiàn)為酸腐味、發(fā)粘、刺激性氣味等，后期（60 h）出現(xiàn)臭味、脹袋等性狀。老豆腐和內(nèi)酯豆腐的腐敗性狀有明顯差異，不同腐敗菌的腐敗性狀也有一定差異，豆腐的最終腐敗性狀是各種腐敗菌綜合作用所致?？傮w來(lái)看，盒裝豆腐中殘留的耐熱芽孢桿菌是后期貯藏過(guò)程中導(dǎo)致豆腐腐敗的主要菌種，而芽孢由于其極強(qiáng)的抗逆性，在豆腐生產(chǎn)各環(huán)節(jié)普遍存在，且巴氏殺菌難以徹底殺滅。因此，后續(xù)將研究相關(guān)芽孢控制技術(shù)，如使用微酸性電解水處理生產(chǎn)各環(huán)節(jié)，采取合適的條件促使芽孢萌發(fā)后再對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行二次殺菌等，以指導(dǎo)企業(yè)生產(chǎn)并延長(zhǎng)盒裝豆腐的保存期。