關(guān)節(jié)腔注射用雷公藤甲素微球組織分布與代謝*

王麗娟,車坷科,張穩(wěn)穩(wěn),丁永良,姜理華

(1.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院,重慶藥物制劑工程研究中心,重慶 401331;2.重慶市人民醫(yī)院藥學(xué)部,重慶 400014)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種發(fā)病率高、致殘率高、嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量的慢性全身性自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)病變引起肢體嚴(yán)重畸形,關(guān)節(jié)滑膜炎及漿膜、心肺、皮膚、眼、血管等結(jié)締組織廣泛性炎癥為主要表現(xiàn),目前認(rèn)為RA中關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的損害主要由滑膜細(xì)胞活化和增生所致[1-2]。雷公藤甲素(triptolide,TPL)是雷公藤主要活性成分之一,低濃度即可抑制滑膜細(xì)胞增生,并誘導(dǎo)成纖維滑膜細(xì)胞凋亡[3]。雖然雷公藤中藥制劑取得了較好的臨床效果,但毒副作用較多,如胃腸道刺激、生殖系統(tǒng)毒性、皮膚黏膜反應(yīng)、肝毒性、心律失常、急性中毒等。基于TPL療效好但毒副作用大的特點(diǎn),筆者所在課題組前期設(shè)計(jì)并制備了緩釋性能良好的關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射用TPL微球(TPL microspheres for intra-articular injection,TPL-MS)用于治療RA,該微球可將藥物直接輸送至受累關(guān)節(jié),避開(kāi)藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)中的生理屏障,避免或減輕全身不良反應(yīng),延長(zhǎng)藥物在關(guān)節(jié)內(nèi)的維持時(shí)間,以較小的劑量發(fā)揮最大藥效,但其體內(nèi)分布與代謝等問(wèn)題仍有待明確。TPL主要通過(guò)細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP450)代謝消除,是TPL的主要解毒途徑之一,肝臟對(duì)TPL的代謝能力與其肝毒性有關(guān)[4-6]。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectro-metry,UPLC-MS/MS)法及高分辨質(zhì)譜法,考察TPL-MS在大鼠的組織分布和體內(nèi)外代謝行為,并對(duì)可能存在的代謝產(chǎn)物種類進(jìn)行分析,以期為其應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠,雌雄不限,平均體質(zhì)量(200±20)g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(渝)2018-0003,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(渝)2018-0003。給藥前自由進(jìn)食飲水,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件飼養(yǎng)[溫度(25±1)℃,相對(duì)濕度(60±10)%,12 h光照和12 h黑暗交替,標(biāo)準(zhǔn)飼料],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校學(xué)術(shù)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2藥品與試劑 TPL對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度:98.5%,批號(hào):201804),TPL-MS(重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校制劑工程中心實(shí)驗(yàn)室自制,批號(hào):20200927),還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸[nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH,中科瑞泰(北京)生物科技有限公司,批號(hào):20200501],混合雄性大鼠肝微粒體[肝臟疾病研究(上海)有限公司,20 g·L-1,批號(hào):20200625],甲醇、乙腈、甲酸銨、甲酸為色譜純,其他試劑均為分析純。鹽酸普萘洛爾對(duì)照品(propranolol hydrochloride,IS,中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度:99%,批號(hào):201809)。

1.3儀器 AR2140電子分析天平(瑞士METTLER TOLEDO公司,感量:0.1 mg),Milli-Q Biocel A-10純水機(jī)(Millipore公司),ZNCL-GS恒溫水浴磁力攪拌器(河南愛(ài)博特科技發(fā)展有限公司),AvantiJ-26XP高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司),Coolsafe110-4pro型冷凍干燥機(jī)(丹麥Labogene-Scanvac),Agilent 1290 Infinity II超高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司,配二元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測(cè)器),Agilent 6460三重四級(jí)桿LC/MS(美國(guó)Agilent公司),DCY-16S型氮吹儀(昆山廣測(cè)儀器設(shè)備有限公司),FSH-2型組織勻漿機(jī)(江蘇省金壇市宏華儀器廠),GL-88B型旋渦混合器(山東良辰儀器設(shè)備有限公司),DW86L628海爾低溫冰箱(海爾集團(tuán))。

1.4TPL含量測(cè)定方法

1.4.1色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),流動(dòng)相A:5 mmol·L-1甲酸銨溶液(含0.1%甲酸),流動(dòng)相B:純乙腈,梯度洗脫程序:30%B(0～3.7 min),95%B(4.0 min),95%B(4.0～10.0 min),30%B(10.1 min),30%B(10.1～15 min),流速0.4 mL·min-1,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量2 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(electron spray ionization,ESI),正離子檢測(cè),掃描方式多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring,MRM),離子源溫度350 ℃,毛細(xì)管電壓4 000 V,干燥氣流速10 L·min-1,霧化氣壓力241.3 kPa(35 psi),TPL檢測(cè)離子對(duì)m/z378.1/361.0,內(nèi)標(biāo)IS檢測(cè)離子對(duì)m/z260.0/116.2。

1.4.3UPLC-MS/MS方法學(xué)考察 專屬性:將加入TPL和內(nèi)標(biāo)后的心、肝、脾、肺、腎、血漿、關(guān)節(jié)等組織處理后進(jìn)樣,觀察雜質(zhì)與TPL分離情況。肝微粒體酶樣品同法操作。

檢測(cè)限和定量限:將各組織或肝微粒體酶樣品分別逐級(jí)稀釋至一系列濃度,依次進(jìn)樣,以信噪比S/N=3：1計(jì)算檢測(cè)限,以信噪比S/N=10：1計(jì)算定量限。

線性關(guān)系考察:配制系列濃度TPL對(duì)照品溶液,精密量取對(duì)照品溶液100 μL,加入空白組織勻漿,配制成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)生物樣品,處理后進(jìn)樣。以TPL峰面積與IS峰面積比值(Y)和藥物質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸。肝微粒體酶樣品同法操作,但高濃度設(shè)置與其他生物樣品不同。

相對(duì)回收率:配制低、中、高濃度TPL標(biāo)準(zhǔn)生物樣品,處理后進(jìn)樣。根據(jù)回歸方程計(jì)算理論濃度,以理論濃度與實(shí)際濃度之比計(jì)算相對(duì)回收率。

精密度和穩(wěn)定性:配制低、中、高濃度TPL標(biāo)準(zhǔn)生物樣品,處理后進(jìn)樣,每天進(jìn)樣5次,計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)進(jìn)樣5 d,計(jì)算日間精密度;室溫放置8 h后進(jìn)樣,考察室溫下穩(wěn)定性;樣品經(jīng)3次反復(fù)凍融,處理后進(jìn)樣,考察凍融穩(wěn)定性。

基質(zhì)效應(yīng):取空白組織或血漿,處理后加入TPL與內(nèi)標(biāo),形成低、中、高濃度溶液,測(cè)定TPL與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(A),另用流動(dòng)相配制上述3種濃度溶液,測(cè)定TPL與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(B),基質(zhì)效應(yīng)(%)=A/B×100%。

1.5高分辨質(zhì)譜測(cè)定代謝產(chǎn)物種類方法 采用配備二元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、控溫箱和二級(jí)陣列檢測(cè)器的UPLC對(duì)原藥及代謝物進(jìn)行分離,采用高分辨質(zhì)譜(HESI檢測(cè)器的thermo Q-exactive質(zhì)譜儀)測(cè)定TPL微球在肝微粒體、肝臟和膽汁中代謝物的準(zhǔn)確分子量。C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.2 μm),流動(dòng)相條件為0.1%甲酸(10%)和乙腈(90%)等度洗脫。柱溫30 ℃,流速0.2 mL·min-1,進(jìn)樣體積100 μL。質(zhì)譜掃描模式為全掃描,母離子掃描范圍為m/z50至m/z750。質(zhì)譜條件具體如下:毛細(xì)管電壓3 800 V,毛細(xì)管溫度320 ℃,霧化氣氮?dú)鈮毫?75.8 kPa(40 psi),離子源溫度350 ℃,Thermo Xcalibur Qual Browser軟件控制儀器和進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。因代謝物類型不做定量檢測(cè),因此只需要排除內(nèi)源性物質(zhì)干擾,不進(jìn)行方法學(xué)考察。

1.6體外代謝實(shí)驗(yàn)方案

1.6.1肝勻漿及肝微粒體中TPL的代謝百分比 實(shí)驗(yàn)分為TPL溶液組(TPL-IN,含8%丙二醇)和TPL-MS組[TPL-MS,微球經(jīng)質(zhì)譜測(cè)定載藥量為(1.82±0.16)%],每組分別做肝勻漿和肝微粒體酶實(shí)驗(yàn)。

取健康SD大鼠,處死后手術(shù)取出肝組織(4 ℃下操作),置冰袋上,用眼科剪剪碎,pH值7.4磷酸緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)洗去組織內(nèi)血液,濾紙吸干,無(wú)菌下稱重,按1：4比例加入上述PBS,組織勻漿機(jī)制成肝勻漿,測(cè)定勻漿液蛋白質(zhì)濃度(g·L-1)。體外代謝孵育體系總體積250 μL,包括PBS、TPL-IN或TPL-MS(TPL終濃度均為50 μmol·L-1)、肝微粒體(或上述肝勻漿)、NADPH,肝微粒體組和肝勻漿組各設(shè)平行樣品3個(gè),蛋白濃度均為1.0 g·L-1。將肝微粒體(或肝勻漿)與TPL-IN(或TPL-MS)的混合溶液、NADPH分別在37 ℃預(yù)孵育5 min,將后者加入微球混合溶液中啟動(dòng)反應(yīng),并繼續(xù)在37 ℃恒溫振蕩器繼續(xù)孵育,于 5、15、30、45、60和120 min從孵育體系中取樣40 μL,加入含內(nèi)標(biāo)(終濃度25 ng·L-1)的冰乙腈400 μL終止反應(yīng)。樣品渦旋振蕩 1 min,15 000 r·min-1離心10 min(r=32.5 cm),取上清液檢測(cè)剩余TPL濃度。同時(shí)實(shí)驗(yàn)平行設(shè)置不加NADPH的空白對(duì)照組、零時(shí)反應(yīng)組和加入咪達(dá)唑侖的陽(yáng)性對(duì)照組。根據(jù)濃度計(jì)算不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)剩余TPL的峰面積與初始峰面積比值,以百分含量表示肝勻漿和肝微粒體孵育液中未代謝TPL占初始TPL量的百分比(%)。

1.6.2肝勻漿及肝微粒體中TPL代謝產(chǎn)物種類 取肝勻漿(或肝微粒體),稀釋到蛋白質(zhì)濃度1.0 g·L-1,加TPL-IN或TPL-MS(TPL終濃度50 μmol·L-1),再加NADPH溶液,最終使孵育體系總體積250 μL,37 ℃水浴振蕩培養(yǎng)。所有孵育體系分別于30 min加入含內(nèi)標(biāo)(終濃度25 ng·L-1)的冰乙腈400 μL終止反應(yīng)。樣品渦旋振蕩 1 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心10 min,取上清液適當(dāng)濃縮后檢測(cè)可能存在的代謝產(chǎn)物。

1.7體內(nèi)代謝實(shí)驗(yàn)方案 將12只SD大鼠稱重后分為2組,每組6只,第一組關(guān)節(jié)腔注射TPL-MS(劑量10 mg·kg-1,按微球?qū)嶋H載藥量折算制劑質(zhì)量),第二組關(guān)節(jié)腔注射TPL-IN(劑量10 mg·kg-1)。每組取3只收集0-8、8-16、16-24 h糞便和尿液,糞便晾干后研磨混勻,尿液可根據(jù)總量多少適當(dāng)濃縮,不做其他預(yù)處理;另外3只于1 h處死,取肝組織,用pH值7.4PBS洗凈血液,擦干水分,-80 ℃冰箱內(nèi)凍存,同時(shí)剝離并剪破膽囊,取膽汁-80 ℃冰箱內(nèi)凍存。取糞便加4%牛血清白蛋白溶液(1：4,m/V),制成糞便勻漿,乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮?dú)獯蹈?500 μL甲醇超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測(cè)代謝物。取膽汁加乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮?dú)獯蹈?500 μL甲醇超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測(cè)代謝物。尿液處理方法同膽汁。取肝組織,用眼科剪剪成勻漿,取勻漿2.0 g,用乙酸乙酯提取(提取2次,合并提取液),提取液用40 ℃氮?dú)獯蹈?500 μL超聲提取10 min,15 000 r·min-1(r=32.5 cm)離心5 min,取上清液檢測(cè)代謝物。對(duì)不同時(shí)間段(0-8、8-16和16-24 h)糞便和尿液中原藥和代謝物檢出情況進(jìn)行分析。

1.8組織分布測(cè)定 取SD大鼠54只,稱重后隨機(jī)分成2組: TPL-MS關(guān)節(jié)腔給藥組(A組,TPL-MS 10 mg·kg-1,按載藥量折算成微球質(zhì)量);TPL-IN關(guān)節(jié)腔給藥組(B組,TPL-IN10 mg·kg-1)。A組于給藥后30 min、2 h、8 h、1 d、2 d、3 d、5 d、8 d、12 d取心、肝、脾、肺、腎、給藥側(cè)關(guān)節(jié)等組織(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只)和全血(交叉取血,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只);B組于給藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、1 d、2 d取心、肝、脾、肺、腎、給藥側(cè)關(guān)節(jié)等組織(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死3只)和全血(交叉取血,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3只)。取全血,12 000 r·min-1(r=50.8 cm)離心10 min,分離血漿。給藥側(cè)關(guān)節(jié)取出后,用PBS沖洗,擦干,取全部軟骨滑膜組織,稱重。其他組織用pH值7.4PBS洗凈血液,擦干,稱重。以上血漿和各組織均于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。測(cè)試前室溫下解凍,取組織0.1 g(或血漿200 μL),加內(nèi)標(biāo)溶液(100 μg·mL-1)50 μL,乙酸乙酯共3 mL分2次渦旋提取TPL,合并提取液后離心[12 000 r·min-1(r=50.8 cm),10 min],取上清液氮?dú)獯蹈?40 ℃),甲醇200 μL復(fù)溶,用孔徑0.22 μm濾頭過(guò)濾后進(jìn)樣。以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算各組織中TPL濃度(ng·g-1或ng·mL-1)。必要時(shí)將樣品適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣,保證濃度在線性范圍內(nèi)。

2 結(jié)果

2.1UPLC-MS/MS方法學(xué)考察結(jié)果 大鼠各組織、血漿、肝微粒體質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1,內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定,TPL峰(保留時(shí)間約3.1 min)和內(nèi)標(biāo)IS峰(保留時(shí)間約2.4 min),分離度R>1.5。檢測(cè)限0.3 ng·mL-1,定量限3 ng·mL-1。各組織標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍結(jié)果見(jiàn)表1。相對(duì)回收率≥87%。日內(nèi)精密度RSD≤4.69%,日間精密度RSD≤6.14%。室溫放置8 h穩(wěn)定性RSD≤4.72%,3次反復(fù)凍融后穩(wěn)定性RSD≤4.12%?；|(zhì)效應(yīng)≥92.8%。

表1 大鼠組織、器官中TPL標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab.1 Standard curves of TPL in rat tissues and organ

A.心;B.肝;C.脾;D.肺;E.腎;F.血漿;G.關(guān)節(jié);H.肝微粒體。圖1 大鼠各組織及肝微粒體加入TPL與IS后的UPLC-MS/MS色譜圖 A.heart;B.liver;C.spleen;D.lung;E.kidney;F.plasma;G.joint tissues;H.liver microsome.Fig.1 UPLC-MS/MS chromatograms of TPL and IS in rat tissues and liver microsome

2.2體外代謝百分比 肝勻漿及肝微粒體TPL代謝百分比結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,2種制劑在肝勻漿和肝微粒體中隨著時(shí)間延長(zhǎng)不斷被代謝,30 min時(shí)TPL-IN在肝勻漿和肝微粒體中分別下降50.32%和49.47%,TPL-MS在肝勻漿和肝微粒體中分別下降47.62%和46.39%,2種制劑體外代謝規(guī)律基本一致,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 2種制劑在大鼠肝勻漿與肝微粒體中代謝百分比Tab.2 The percentage of TPL metabolism in rat liver homogenate and liver microsome

2.3體內(nèi)外代謝物種類分析 體內(nèi)外代謝研究中共觀察到TPL原藥及其4種代謝物,質(zhì)荷比分別為m/z361.1646(原藥,[M+H]),m/z377.159 5(代謝物,[M1+H]),m/z377.159 5(代謝物,[M2+H]),m/z391.138 7(代謝物,[M3+H])和m/z391.138 7(代謝物,[M4+H]),保留時(shí)間分別是11.4～11.7,7.9～8.4,10.0～10.4,3.4～4.3和7.1～8.2 min,代謝物保留時(shí)間均早于原藥,可能由于代謝物主要是羥基化產(chǎn)物,極性較原藥大。M-M4的提取離子流圖譜和二級(jí)質(zhì)譜圖見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),TPL可以轉(zhuǎn)化為m/z359.148 9(TPL,[M-H]);M1和M2除了有[M1/M2+H]峰外,均可以轉(zhuǎn)化為m/z375.143 8(代謝物脫氫,[M1/M2-H]);M3和M4除了有[M3/M4+H]峰外,均可以轉(zhuǎn)化為m/z389.124 4(代謝物脫氫,[M3/M4-H])。這可能由全離子掃描模式造成,因此需要結(jié)合保留時(shí)間進(jìn)行評(píng)價(jià),以驗(yàn)證是否為代謝物。

A.TPL;B.M1;C.M2;D.M3;E.M4。圖2 TPL及其代謝物M1-M4提取離子流與二級(jí)質(zhì)譜圖 A.TPL;B.M1;C.M2;D.M3;E.M4.Fig.2 Extraction ion flow diagrams and secondary mass spectrograms of TPL and its metabolites M1-M4

TPL-IN與TPL-MS在肝勻漿、肝微粒體、體內(nèi)肝臟、膽汁、糞便和尿液中的具體代謝物種類分布結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,大鼠體內(nèi)肝臟發(fā)現(xiàn)原藥及代謝物3種,M4未發(fā)現(xiàn);膽汁中僅發(fā)現(xiàn)原藥與M2,可能由于濃度較低;尿液中發(fā)現(xiàn)原藥及代謝物M1、M2和M3,糞便中發(fā)現(xiàn)原藥及單羥基代謝物M1與M2。TPL-IN與TPL-MS代謝產(chǎn)物結(jié)果顯示,2種劑型代謝途徑和代謝物種類相似,劑型變化未改變TPL代謝途徑和代謝物種類。

表3 TPL-IN與TPL-MS在體內(nèi)外的代謝物Tab.3 Metabolites of TPL-IN and TPL-MS in vivo and in vitro

2.4體內(nèi)代謝速度分析 大鼠糞便及尿液代謝物檢出情況見(jiàn)表4。結(jié)果顯示,TPL經(jīng)肝臟代謝后主要經(jīng)尿液排出,TPL-IN組主要代謝時(shí)間集中在給藥后8 h,8-16和16-24 h代謝物基本檢測(cè)不出來(lái),TPL-MS組可在0-8、8-16和16-24 h尿液中持續(xù)檢出代謝物,表明TPL-MS改變了體內(nèi)釋放速度。

表4 大鼠糞便及尿液中TPL原藥及代謝產(chǎn)物在不同時(shí)間段檢出情況Tab.4 Detection of TPL and its metabolites in feces and urine of rats at different time periods

2.5體內(nèi)組織分布情況 各組數(shù)據(jù)結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示,關(guān)節(jié)腔注射給藥后,關(guān)節(jié)組織藥物濃度均較血漿及其他組織高,說(shuō)明關(guān)節(jié)腔給藥有一定局部靶向作用。但與TPL-IN組相比,TPL-MS組TPL在關(guān)節(jié)組織滯留時(shí)間更持久,第3天達(dá)到最高濃度[(243.79±14.12)ng·g-1],在關(guān)節(jié)組織內(nèi)維持時(shí)間近2周,長(zhǎng)時(shí)間緩釋作用更強(qiáng)。而TPL-IN組注射后即刻達(dá)到最高濃度[15 min關(guān)節(jié)組織濃度(278.29±12.65)ng·g-1],此后逐漸下降,48 h后TPL濃度很低。除關(guān)節(jié)外的其他組織(心、肝、脾、肺、腎、血漿),TPL-MS組也是在第3天才達(dá)到最高濃度。從各組織內(nèi)最高點(diǎn)藥物濃度數(shù)據(jù)看,TPL-MS組較TPL-IN組有所降低,TPL-MS組心、肝、脾、肺、腎、血漿最高藥物濃度為(20.08±1.17)、(23.39±1.97)、(23.65±1.76)、(18.78±1.32)、(16.81±1.67) ng·g-1和(18.86±1.47)ng·mL-1;TPL-IN組分別為(29.65±1.59)、(34.12±2.57)、(28.37±2.75)、(26.49±3.21)、(30.39±2.81) ng·g-1和(21.03±1.86)ng·mL-1。TPL被制備成微球后,能較長(zhǎng)時(shí)間停留在關(guān)節(jié)組織,進(jìn)一步減少關(guān)節(jié)腔給藥次數(shù),降低除關(guān)節(jié)之外其他組織血藥濃度峰值,緩釋效果較溶液劑型有明顯提高,有利于藥物發(fā)揮治療效果,且降低全身毒副作用。

表5 關(guān)節(jié)腔注射TPL-MS或TPL-IN后TPL在組織中的分布Tab.5 Distribution of TPL in tissues following intra-articular administration of TPL-MS or TPL-IN

3 討論

筆者所在課題組制備的TPL-MS形態(tài)圓整[7-8],大小均一,平均粒徑約5 μm,平均載藥量約2%,體外釋放研究顯示TPL-MS第1天處于突釋階段,累積釋放率超過(guò)30%,此后進(jìn)入緩釋階段,到第10天總累積釋放率超過(guò)60%。筆者在本實(shí)驗(yàn)采用的TPL-MS平均粒徑4.75 μm,載藥量(1.82±0.16)%。

文獻(xiàn)報(bào)道TPL在大鼠和人體內(nèi)的主要代謝物是單羥基和雙羥基代謝物[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)4種代謝物,其中M1和M2是單羥基TPL代謝物,可能是一對(duì)同分異構(gòu)體,M3和M4是TPL的單羥基和單羰基代謝物,也可能是一對(duì)同分異構(gòu)體。體外肝勻漿和肝微粒體酶中發(fā)現(xiàn)了原藥及其4種代謝物M1-M4,較體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的代謝物種類(M1-M3)多,可能由于代謝產(chǎn)物在體外孵育體系中不斷蓄積,濃度較高。而體內(nèi)代謝是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程,代謝產(chǎn)物隨尿液和糞便不斷排出體外,含量較低。與文獻(xiàn)報(bào)道的代謝物類型相比,筆者在本實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有檢測(cè)到新的代謝物;TPL-MS與TPL-IN相比,代謝物種類一致。說(shuō)明使用TPL-MS不會(huì)引入新代謝物,安全性較好。

組織分布結(jié)果顯示,關(guān)節(jié)腔注射微球劑型和溶液劑型后呈現(xiàn)完全不同的分布行為。在關(guān)節(jié)組織中,TPL-IN組在15 min即達(dá)最高濃度,2 d后TPL從關(guān)節(jié)腔內(nèi)完全消除,說(shuō)明溶液劑型在關(guān)節(jié)腔內(nèi)滯留時(shí)間有限;TPL-MS組達(dá)峰濃度出現(xiàn)在給藥后第3天,直至第12天仍有釋放,說(shuō)明微球劑型在關(guān)節(jié)腔內(nèi)形成了藥物儲(chǔ)庫(kù),逐漸釋放藥物。從心、肝、脾、肺、腎和血漿的數(shù)據(jù)看,TPL-MS組在各監(jiān)測(cè)點(diǎn)的濃度較TPL-IN組均有不同程度降低,說(shuō)明長(zhǎng)期用藥時(shí)微球能降低藥物在非靶器官的積累,減少毒副作用。

研究表明,TPL劑量越大毒性越大[11],改變劑型和給藥方式是重要的減毒手段之一,如TPL自乳化給藥系統(tǒng)[12]可減輕肝臟毒性;TPL腎靶向納米粒[13]可減輕肝毒性、生殖毒性和免疫毒性。筆者在本實(shí)驗(yàn)中將TPL制成TPL-MS,并采用UPLC聯(lián)合高分辨質(zhì)譜[14]對(duì)不同時(shí)間段糞便和尿液中原藥和代謝物的出現(xiàn)時(shí)間、離子豐度進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示,TPL-IN組代謝物濃度在0～8 h達(dá)到峰濃度,而TPL-MS組代謝物濃度在16～24 h達(dá)到峰濃度,表明TPL被包裹成微球進(jìn)行關(guān)節(jié)腔注射后,在肝臟被代謝轉(zhuǎn)化的時(shí)間被延遲,間接證實(shí)TPL-MS可延緩藥物體內(nèi)釋放過(guò)程,擴(kuò)大TPL治療窗,改善用藥安全問(wèn)題,這與組織分布測(cè)得的結(jié)果一致。

綜上所述,TPL-IN與TPL-MS 2種制劑在肝勻漿和肝微粒體孵育實(shí)驗(yàn)中,含量均隨著時(shí)間延長(zhǎng)而顯著降低,兩者體外代謝規(guī)律基本一致。在體內(nèi)外代謝研究中共尋找到TPL原藥及其4種代謝物,2種制劑代謝途徑和代謝物種類相似,但代謝速度有差異。TPL-MS在關(guān)節(jié)腔內(nèi)滯留時(shí)間較溶液制劑長(zhǎng),微球?qū)λ幬锏陌苊黠@延緩藥物在體內(nèi)分布和代謝行為,證實(shí)了TPL-MS在臨床實(shí)踐中延長(zhǎng)藥物釋放的可行性。