二黃栓制備工藝及其含量測定方法*

茍歡,劉嶸,熊微,施春陽,方建國,王文清

(華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院 1.藥學(xué)部;2.婦科,武漢 430030)

二黃栓由雄黃、黃連等藥味組成,臨床用于治療高危型人乳頭瘤病毒持續(xù)感染的子宮頸炎癥及子宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅰ級[1]。筆者在本研究采用適宜的制劑技術(shù)開發(fā)其栓劑,按中藥新藥分類本品為在研1.1類新藥。通過熱融法使藥物以無定形態(tài)均勻分散在基質(zhì)中,形成栓劑,在腔道經(jīng)黏膜吸收,可規(guī)避藥物首關(guān)效應(yīng),維持血藥濃度穩(wěn)定,獲得更優(yōu)藥效。通過考察不同基質(zhì)類型和制備條件對制備工藝的影響,經(jīng)G1-熵權(quán)法結(jié)合正交實驗設(shè)計建立二黃栓的制備工藝,并利用雄黃與其他原輔料理化性質(zhì)差異考察不同前處理方法對二黃栓中二硫化二砷(As2S2)含量測定的影響,建立了碘量法和原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrometry,AAS)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AA-6300C原子吸收分光光度儀(日本島津公司);HL-1型砷空心陰極燈(河北寧強光源有限公司);HeraeusMultifuge X1R離心機(賽默飛世爾科技公司);AUW220D分析天平(日本島津公司,感量:0.01 mg);RB-1融變時限測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司);JHH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造有限公司)。

1.2試藥 砷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(國家有色金屬及電子材料分析測試中心,批號:223004-6,1 000 μg·mL-1);二黃栓(自制,批號:20220212,20220314,20220510,20221109,20221221),水飛雄黃粉(湖南柳城中藥飲片有限公司,批號:210105),其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1評價指標(biāo)賦權(quán)

2.1.2熵權(quán)法 熵權(quán)法是根據(jù)各項指標(biāo)值的離散程度確定權(quán)重,避免了人為因素帶來的偏差,能更好地解釋所得結(jié)果,計算過程參考柯寄明等[4-5]所用方法,得客觀權(quán)重w2。

2.2二黃栓的制備工藝

2.2.1二黃栓的基質(zhì)處方優(yōu)化 由于基質(zhì)類型及用量對栓劑的成型工藝具有較大影響,因此考察了36型混合脂肪酸甘油酯(油脂性)、硬脂酸聚烴氧(40)酯(水油兼容性)、甘油明膠(水溶性)3種類型及其用量(每粒0.66、0.99、1.32 g)對二黃栓成型工藝的影響。通過設(shè)計L9(34)正交實驗,采用 G1-熵權(quán)法對外觀性狀、質(zhì)量差異和融變時限進(jìn)行綜合評分,按“2.1節(jié)”下計算得各評價指標(biāo)的權(quán)重值,見表1。

表1 基質(zhì)處方優(yōu)化評價指標(biāo)的權(quán)重值Tab.1 Weight values of matrix prescription optimization evaluation indexes

由表2可知,基質(zhì)類型對栓劑制備工藝的影響程度大于基質(zhì)用量,其中A1>A2>A3,B2>B1>B3,根據(jù)表3可得,僅基質(zhì)類型對成型工藝有顯著影響,結(jié)合直觀和方差分析結(jié)果,選用最佳基質(zhì)為混合脂肪酸甘油酯,用量為每粒0.99 g,與藥味總量配比為3：1。

表2 二黃栓基質(zhì)處方優(yōu)化L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.2 L9(34)orthogonal results of matrix formulation optimization for Erhuang suppository

表3 基質(zhì)處方優(yōu)化方差分析表Tab.3 Results of variance analysis of matrix formulation optimization

2.2.2二黃栓的制備條件優(yōu)化 考察基質(zhì)熔融溫度、攪拌時間、注模溫度對制備工藝的影響,通過設(shè)計L9(34)正交實驗,采用G1-熵權(quán)法對外觀性狀、質(zhì)量差異和融變時限進(jìn)行綜合評分,結(jié)果見表4—6。

表4 制備工藝評價指標(biāo)的權(quán)重值Tab.4 Weight values of preparation process evaluation indexes

由表5可知,各因素對栓劑制備工藝影響程度:基質(zhì)熔融溫度>攪拌時間>注模溫度,其中A2>A1>A3,B2>B3>B1,C3>C1>C2;由表6可得,3個因素對制備工藝均無顯著影響。結(jié)合直觀和方差分析結(jié)果,最終優(yōu)選制備條件為A2B2C3。即基質(zhì)置60 ℃水浴至熔融狀態(tài),再按處方比例加入各藥粉攪拌20 min至溶液均勻,50 ℃灌注,冷卻成型,即得。

表5 二黃栓制備工藝的L9(34)正交實驗結(jié)果Tab.5 L9(34)orthogonal results of preparation process for Erhuang suppository

表6 制備工藝的方差分析Tab.6 Results of variance analysis of preparation process

2.3工藝驗證 根據(jù)最佳制備工藝,按處方比例稱取并制備二黃栓3批。最終栓劑的各指標(biāo)等均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定,表明該制備工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性好,可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。

2.4不同前處理方法測定二黃栓中As2S2的含量 碘量法測定中成藥中礦物藥時,取樣量、試劑用量及滴定液用量等因素直接影響滴定結(jié)果的準(zhǔn)確性。通過高效的前處理方法除去基質(zhì)等物質(zhì)后可減小消解試劑用量,減小干擾,并增大滴定液用量,減小誤差,是消解法與碘量法結(jié)合測定的關(guān)鍵點。根據(jù)雄黃和其他原輔料的理化性質(zhì)差異,選擇下列方法進(jìn)行考察,按“2.5.2”和“2.6.3”方法測定含量,結(jié)果見表7。

表7 不同前處理方法對二黃栓含量測定的影響Tab.7 Effect of different pretreatment methods on content determination of Erhuang suppository

由表7可知,碘量法測定時,直接消解處理耗時長效率低。因雄黃粉易吸附管壁,經(jīng)離心和過濾處理后含量偏低,以上3種方法不適于本栓制備。結(jié)果表明經(jīng)水和正丁醇除雜富集后進(jìn)行消解為碘量法最佳前處理方法,該方法進(jìn)行優(yōu)化后最終條件為水和正丁醇的比例為1：3、水浴溫度為80 ℃、消解液用量為16 mL。AAS測定時,采用直接消解法和萃取-消解法測得As2S2含量較高,前者取樣量減少時,消解時間可縮短,步驟簡單,操作方便,因此選擇直接消解。

2.5碘量法測定As2S2含量方法學(xué)考察

2.5.1對照品貯備液 取雄黃對照品(本課題組精制,經(jīng)碘量法測定As2S2含量為99.38%)約1.25 g,精密稱定,置凱式定氮瓶,按“2.5.2節(jié)”方法,定容至250 mL,得As2S2含量為5.00 mg·mL-1對照品貯備液。

2.5.2供試品溶液 取二黃栓5粒,切碎,混勻,取約1.5 g,精密稱定,置錐形瓶,加正丁醇30 mL和水10 mL,80 ℃水浴加熱至全部融化,振搖,靜置,趁熱除去正丁醇層液體,蒸干水層液,加硫酸鉀2 g、硫酸銨5 g與硫酸20 mL,后續(xù)照《中華人民共和國藥典》(2020年版)一部雄黃含量測定[6]項下進(jìn)行,即得供試品溶液。采用碘滴定液進(jìn)行滴定,每毫升碘滴定液(0.05 mol·L-1)相當(dāng)于As2S25.348 mg[6]。

2.5.3專屬性考察 取處方中除雄黃外的其他藥味制備陰性樣品,按“2.5.2節(jié)”方法測定,結(jié)果碘滴定液消耗2滴,表明樣品中其他藥材對測定無干擾。

2.5.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品貯備液12、18、24、30、36、42、50 mL,加水稀釋至100 mL,測定As2S2含量。以As2S2取樣量為橫坐標(biāo)(X,mg),以碘滴定液(0.05 mol·L-1)消耗體積為縱坐標(biāo)(Y,mL)。結(jié)果表明As2S2取樣量在59.88～249.48 mg范圍內(nèi)與碘滴定液消耗體積(mL)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程Y=0.187 0X+0.527 5,r=0.999 0。

2.5.5穩(wěn)定性實驗 取二黃栓約1.5 g,精密稱定,按“2.5.2節(jié)”方法處理并于0、2、4、8、12 h測定As2S2含量,結(jié)果RSD為2.32%(n=5),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6重復(fù)性實驗 取二黃栓約1.5 g,精密稱定,共6份,按“2.5.2節(jié)”方法測定含量,結(jié)果As2S2平均含量為65.58 mg·g-1,RSD為1.26%,表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5.7加樣回收率實驗 取已知As2S2含量的二黃栓約0.75 g,精密稱定,共6份,精密加入雄黃對照品60 mg,按“2.5.2節(jié)”方法處理后測定含量,結(jié)果平均加樣回收率為101.48%,RSD為1.16%(n=6)。

2.6AAS測定As2S2含量方法學(xué)考察

2.6.1儀器條件 采用火焰原子化器,氘燈扣除背景,以乙炔為燃?xì)?、空氣為助燃?xì)膺M(jìn)行測定。元素:As,波長193.7 nm,燈電流10 mA,狹縫0.7 nm,燃?xì)饬髁?.2 L·min-1,燃燒頭高度5 mm,霧化器提升時間3 s,積分時間5 s。

2.6.2標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密吸取1 000 μg·mL-1砷標(biāo)準(zhǔn)溶液2、4、6、8、10 mL,分置100 mL量瓶,用空白溶液(2%硝酸溶液)稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.6.3供試品溶液 取二黃栓5粒,切碎,混勻,取約0.25 g,精密稱定,置錐形瓶,加硫酸鉀1 g、硫酸銨2 g與硫酸8 mL,消解,放冷,置200 mL量瓶中并用水稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.6.4專屬性考察 取空白溶液和陰性樣品溶液,按“2.6.1節(jié)”條件測定吸光度,結(jié)果吸光度為供試品溶液的1.50%,表明其對測定無干擾。

2.6.5線性關(guān)系考察 取濃度分別為20、40、60、80、100 μg·mL-1的砷標(biāo)準(zhǔn)溶液,按“2.6.1節(jié)”條件測定吸光度,以砷元素濃度(X,μg·mL-1)為橫坐標(biāo),以吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為:Y=6.353 0×10-3X+0.055 8,r=0.998 6。結(jié)果表明砷元素的濃度在20～100 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.6.6儀器精密度實驗 取砷標(biāo)準(zhǔn)溶液(60 μg·mL-1),按“2.6.1節(jié)”條件連續(xù)測定6次,結(jié)果RSD為3.17%(n=6),表明儀器精密度良好。

2.6.7穩(wěn)定性實驗 取二黃栓約0.25 g,精密稱定,按“2.6.3節(jié)”方法處理并分別于0、2、4、8、12 h測定吸光度,結(jié)果RSD為3.66%(n=5),表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.8重復(fù)性實驗 取二黃栓約0.25 g,精密稱定,共6份,按“2.6.3節(jié)”方法處理后測定吸光度,結(jié)果As2S2平均含量為66.09 mg·g-1,RSD為2.91%(n=6),表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.9加樣回收率實驗 取二黃栓約0.125 g,精密稱定,共9份,分別精密加入砷標(biāo)準(zhǔn)溶液4.8、6.0、7.2 mL(相當(dāng)于樣品中砷含量的80%、100%、120%),各3份,按“2.6.3節(jié)”方法處理后測定吸光度,結(jié)果平均加樣回收率為99.31%～105.20%,RSD<3.05%(n=9)。

2.7樣品測定結(jié)果的比較 取樣品5批,分別采用碘量法和AAS測定,AAS測定的砷含量通過As與As2S2的分子量轉(zhuǎn)換計算得As2S2含量。對兩種測定方法結(jié)果進(jìn)行t檢驗,結(jié)果表明差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表8。

表8 5批樣品測定結(jié)果Tab.8 Determination results of five batches of samples n=2,mg·g-1

3 討論

3.1指標(biāo)賦權(quán)與評價方法 在多指標(biāo)綜合評價中賦權(quán)方法和各指標(biāo)權(quán)重最為重要。目前栓劑多采用主觀賦權(quán)評價制備工藝,根據(jù)評價指標(biāo)重要程度主觀給予權(quán)重,可能造成權(quán)重分配不合理或與實際差異過大,最終結(jié)果缺乏準(zhǔn)確性。通過G1法主觀賦權(quán)快速計算,無需一致性檢驗,再結(jié)合熵權(quán)法進(jìn)行客觀賦權(quán),可靠性和準(zhǔn)確性更強[4]。本研究采用G1-熵權(quán)法組合賦權(quán)方法對栓劑制備工藝進(jìn)行評價,不局限于主觀評價,可同時兼顧決策者的主觀性和待評價各指標(biāo)的客觀聯(lián)系,使二黃栓制備工藝的綜合評價結(jié)果更加科學(xué)準(zhǔn)確。

3.2不同基質(zhì)材料對二黃栓制備工藝的影響 栓劑基質(zhì)有油脂性基質(zhì)包括天然的脂肪酸和合成脂肪酸酯等,水溶性基質(zhì)包括聚氧乙烯、甘油明膠、泊洛沙姆和聚乙二醇類等[7]。本研究選擇幾種類型中具有代表性的常用基質(zhì)進(jìn)行考察。在篩選基質(zhì)時發(fā)現(xiàn)水溶性基質(zhì)甘油明膠不適于本栓的制備,處方中的白礬遇水會產(chǎn)生氫氧化鋁吸附膠體粒子,導(dǎo)致整體凝固,無法灌裝。因此在考察基質(zhì)時含白礬等栓劑應(yīng)注意藥物與水溶性基質(zhì)是否會發(fā)生反應(yīng)。水油兼容性基質(zhì)硬脂酸聚烴氧(40)酯熔化時產(chǎn)生小氣泡,在栓劑中形成氣孔,造成質(zhì)量差異較大。最終優(yōu)選混合脂肪酸甘油酯為基質(zhì),用量為每粒0.99 g,與藥味總量配比為3：1。

3.3不同制備條件對二黃栓制備工藝的影響 基質(zhì)熔融溫度、攪拌時間等諸多因素影響栓劑的制備工藝?；|(zhì)熔融溫度影響溶液流動性和混合均勻度等,熔融溫度過低,溶液流動性低,藥粉不易分散,造成有效成分不均勻;熔融溫度過高,與注模溫度溫差過大,冷卻時間太長,影響制備效率。攪拌時間過短,藥粉混合不均勻,外觀色澤不均一。注模溫度對灌裝成型有直接影響,溫度過高,灌注后冷卻時間較長,雄黃容易沉降,導(dǎo)致溶液分層,造成含量不均勻;溫度過低,灌注時容易造成栓劑中空或者殘缺,不合格產(chǎn)品增多[8]。通過考察不同制備條件對二黃栓制備工藝的影響,得最佳制備工藝,對二黃栓的工業(yè)化生產(chǎn)具有較好的實際應(yīng)用價值,并為同類栓劑的制備提供參考。

3.4不同前處理方法對砷含量測定的影響 目前砷含量測定方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)[9-10]、AAS[11-13]、碘量法[14]等。ICP-MS檢出限低,精密度好,能同時測定多元素,但當(dāng)樣品中砷含量較高時,容易污染儀器,昂貴的價格也影響了其通用性[9]。AAS專屬性強,靈敏度高,選用火焰原子化器測定,操作步驟簡單,滿足實驗需求[13]。滴定分析法靈敏度比AAS低,但因具有準(zhǔn)確、快捷、節(jié)約等優(yōu)點使其成為檢測分析領(lǐng)域的經(jīng)典方法,常用于礦物藥的含量測定[15]?！吨腥A人民共和國藥典》(2020年版)一部采用經(jīng)典的分析方法碘量法對雄黃中As2S2進(jìn)行含量測定[6]。本研究采用碘量法和AAS測定樣品,結(jié)果表明無顯著性差異,說明兩種方法均適用于本栓中As2S2的含量測定。根據(jù)不同檢測方法結(jié)合特定的前處理方法,使其含量測定更具準(zhǔn)確性和科學(xué)性,為中成藥中礦物藥的含量測定提供借鑒。