基于高效液相色譜指紋圖譜及多模式化學(xué)計量學(xué)分析評價菝葜飲片的質(zhì)量

陳彥潔，蔣學(xué)青，羅鑫，蔣佳麗，王藝潔，謝譚芳，王志萍*（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點實驗室，南寧 530200）

菝葜為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹、解毒散瘀的功效[1]?，F(xiàn)在研究表明，菝葜中主要含有甾體皂苷類、黃酮類、氨基酸類、甾醇類和有機(jī)酸類等化合物[2]，具有抗癌、抗炎、抗氧化、降血脂[3]等多種藥理作用，臨床上可用于治療腫瘤、慢性盆腔炎、乳腺增生、卵巢囊腫等[4-5]疾病。

中藥組成復(fù)雜，用單一的指標(biāo)難以分析評價其綜合質(zhì)量，中藥指紋圖譜技術(shù)是評價中藥整體性、穩(wěn)定性的一種有效方法，從整體上體現(xiàn)中藥的化學(xué)特征，符合中醫(yī)理論中全面性、整體性的特點，已成為控制天然藥物整體質(zhì)量的有效手段[6]。

多模式化學(xué)計量學(xué)分析主要包括聚類分析、主成分分析、正交偏最小二乘-判別分析（OPLSDA）等，能從整體上對藥材進(jìn)行評價[7]。指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多模式化學(xué)計量學(xué)分析能反映出中藥材質(zhì)量與化學(xué)組成的真實情況[8]，基于此，本研究收集了18批不同來源的菝葜飲片，建立了菝葜飲片的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析及OPLS-DA，綜合評價菝葜飲片的質(zhì)量，以期為菝葜的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-2030 Plus型高效液相色譜儀（日本島津公司）；XSR205DU/A型電子天平（美國Mettler Toledo公司）；KQ-800DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；UPH-IV20TN型優(yōu)普超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸（批號：MUST-22111711，純度：99.82%）、落新婦苷（批號：MUST-22032404，純度：98.14%）、白藜蘆醇（批號：MUST-21112413，純度：99.82%）、黃杞苷（批號：MUST-22011202，純度：98.10%）、槲皮苷（批號：MUST-20121401，純度：98.87%）（成都麥德生科技有限公司）；色譜純乙腈、甲醇（美國Fisher公司）；色譜純磷酸[阿拉丁試劑（上海）有限公司]；其余試劑均為分析純（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。本研究收集了包括安徽、江西、貴州、廣西、廣東及湖南等地的18批菝葜飲片，飲片均由廣西中醫(yī)藥大學(xué)田慧教授鑒定為百合科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根莖，樣品信息詳見表1。

表1 菝葜飲片來源信息Tab 1 Sample information of Smilax china L.

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取菝葜飲片粉末（過2號篩）約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，超聲（320 W，40 kHz）45 min，放冷，補足質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取落新婦苷、黃杞苷、白藜蘆醇、綠原酸及槲皮苷對照品適量，精密稱定，加70%甲醇溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為 0.420、0.190、0.260、0.666、0.206 mg·mL-1的混合對照品溶液。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立與分析

2.2.1 色譜條件 Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～25 min，9%A；25～110 min，9%～29%A；110～115 min，29%～9%A；115～120 min，9%A）；流速：1 mL·min-1；柱溫：35℃；檢測波長：302 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 精密度試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣分析6次，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.39%，相對峰面積RSD＜2.3%，表明儀器的精密度符合指紋圖譜要求。

2.2.3 重復(fù)性試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，平行6份，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜1.6%，相對峰面積RSD＜2.7%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取菝葜飲片（YP1）0.5 g，按“2.1.1”項下條件制備，再按“2.2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣分析，以5號峰（落新婦苷）為參照峰S，計算得到各共有峰的相對保留時間RSD＜0.57%，相對峰面積RSD＜1.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價 取18批菝葜飲片，按“2.1.1”項方法制備，再按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，導(dǎo)入到中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），將編號為YP1的樣品設(shè)為參照圖譜，用中位數(shù)法將各批次樣品計算出的數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配生成指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了13個共有峰，結(jié)果見圖1。相似度計算公式如下[9-10]，式中xi和yi分別代表兩組樣品的共有峰峰面積。18批菝葜飲片圖譜與對照圖譜相比，除YP3以外，其余相似度均大于0.9（見表2），表明18批不同來源的菝葜飲片一致性較好，可以用于評價菝葜飲片的綜合質(zhì)量。

圖1 18批菝葜飲片HPLC疊加圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 18 batches of Smilax china L.

表2 18批菝葜飲片的相似度Tab 2 Similarity of 18 batches of Smilax china L.

2.2.6 共有峰指認(rèn) 通過與已知混合對照品溶液色譜圖比較保留時間，結(jié)果見圖2～3，13個共有峰共指認(rèn)出5個峰，其中峰2為綠原酸，峰5為落新婦苷，峰8為槲皮苷，峰9為黃杞苷，峰10為白藜蘆醇。

圖2 菝葜飲片對照圖譜Fig 2 HPLC specific chromatogram of Smilax china L.

圖3 混合對照品溶液的HPLC圖譜Fig 3 HPLC chromatogram of mixed reference solution

2.2.7 聚類分析 以18批菝葜飲片共有峰峰面積為變量，經(jīng)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，采用系統(tǒng)聚類中組間連接的聚類方法，以平方歐氏距離為區(qū)間，進(jìn)行聚類，共聚為三類，其中YP1～YP3聚類一類，YP7～YP10聚為一類，YP4～6、YP11～18聚為一類，結(jié)果見圖4。

圖4 18批菝葜飲片聚類分析圖Fig 4 Cluster analysis of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 主成分分析 以18批菝葜飲片共有峰峰面積為變量，經(jīng)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SPSS 25.0軟件，通過降維的手段進(jìn)行主成分分析，結(jié)果Bartlett 球形度檢驗P＜0.01，表明主成分分析模型成立，以特征值＞1提取了3個主成分，方差貢獻(xiàn)率分別是43.428%、24.878%、14.548%，累積方差貢獻(xiàn)率為82.854%，見表3，結(jié)合碎石圖（見圖5）分析，3個成分的曲線斜率較大，表明這3個主成分能代表該18批菝葜飲片指紋圖譜的大部分信息，可作為綜合指標(biāo)對菝葜飲片的質(zhì)量進(jìn)行評價。

圖5 碎石圖Fig 5 Gravel diagram

表3 主成分特征值及方差貢獻(xiàn)率Tab 3 Principal component eigen value and variance contribution rate

從表4主成分載荷系數(shù)可知，主成分1主要反映峰1、峰2（綠原酸）、峰3、峰5（落新婦苷）、峰6、峰7、峰8（槲皮苷）、峰9（黃杞苷）、峰11和峰13的信息，主成分2主要反映峰1、峰4、峰10（白藜蘆醇）和峰12的信息，主成分3主要反映峰13的信息。

表4 主成分載荷矩陣Tab 4 Principal component load matrix

利用SPSS 25.0軟件對主成分載荷進(jìn)行分析，以主成分載荷系數(shù)除以對應(yīng)特征值的算數(shù)平方根得到線性組合系數(shù)，有關(guān)線性模型如下：

成分1得分＝0.324×峰1-0.378×峰2-0.385×峰3+0.121×峰4-0.253×峰5+0.290×峰6+0.227×峰7+0.297×峰8-0.364×峰9+0.080×峰10+0.292×峰11+0.037×峰12+0.276×峰13

成分2得分＝-0.328×峰1-0.038×峰2+0.108×峰3+0.462×峰4-0.261×峰5+0.205×峰6-0.280×峰7-0.059×峰8-0.007×峰9+0.462×峰10-0.225×峰11+0.428×峰12+0.160×峰13

成分3得分＝0.036×峰1+0.212×峰2+0.174×峰3+0.002×峰4+0.381×峰5+0.432×峰6+0.208×峰7-0.319×峰8+0.225×峰9-0.071×峰10+0.358×峰11+0.210×峰12+0.467×峰13

其中峰1～峰13表示經(jīng)Z標(biāo)準(zhǔn)化后的13個共有峰峰面積，將標(biāo)準(zhǔn)化后的值代入線性模型，得到18批菝葜飲片的主成分得分，結(jié)果見表5，將3個主成分得分導(dǎo)入Origin 2018軟件，建立三維散點圖（見圖6），結(jié)果18批菝葜飲片的空間分布分為三組，表明不同來源菝葜的成分組成上存在一些差異，其中YP1～YP3分布較為接近，YP7～YP10分布較為接近，TP4～YP6、YP11～YP18分布較為接近，與聚類分析結(jié)果基本保持一致。

圖6 18批菝葜飲片主成分得分圖Fig 6 Principal component score of 18 batches of Smilax china L.

表5 18批菝葜飲片的主成分得分Tab 5 Principal component scores of 18 batches of Smilax china L.

2.2.8 OPLS-DA 將18批菝葜飲片的共有峰經(jīng)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理后導(dǎo)入SIMCA14.1軟件，建立OPLS-DA數(shù)字模型。結(jié)果顯示，該模型解釋參數(shù)（R2X、R2Y）分別為0.592、0.892，表明模型對變量X（組間差異）、Y（組內(nèi)差異）的解釋率分別為59.2%、89.2%，Q2為0.791，表明該模型的預(yù)測能力可達(dá)79.1%[11]。采用 SIMCA 14.1繪制得分矩陣圖，見圖7?？芍?，18批菝葜飲片可分為3類，YP1～YP3為一類，YP7～YP10為一類，YP4～YP6、YP11～YP18為一類。

圖7 18批菝葜飲片OPLS-DA矩陣圖Fig 7 OPLS-DA matrix of 18 batches of Smilax china L.

采用 SIMCA 14.1 軟件，以Permutations檢驗（n＝200）對建立的OPLS-DA模型進(jìn)行驗證，詳見圖8，可知，模型參數(shù)（R2、Q2）分別為（0，0.083）、（0，-0.586），Q2的回歸線與縱軸相交于0.5以下，表明建立的OPLS-DA模型擬合度好[12]，可用于菝葜飲片質(zhì)量差異成分的分析驗證。

圖8 OPLS-DA的置換檢驗結(jié)果Fig 8 OPLS-DA substitution test

變量投影重要性分析值（VIP）是篩選差異性化合物的重要指標(biāo)，VIP 值越高，表示其對應(yīng)化學(xué)成分對該模型的貢獻(xiàn)度越大。采用SIMCA 14.1軟件，以VIP值＞1為閾值[13]，篩選影響菝葜飲片質(zhì)量的標(biāo)志成分，結(jié)果見圖9，共篩選出6 個成分，峰號依次為13號峰、6號峰、3號峰、2號峰（綠原酸）、9號峰（黃杞苷）、8號峰（槲皮苷），表明這6個共有峰所對應(yīng)的化學(xué)成分可能是菝葜飲片質(zhì)量差異的標(biāo)志成分。

圖9 18批菝葜飲片共有峰VIP值Fig 9 VIP value of common peak in 18 batches of Smilax china L.

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化及供試品制備考察

課題組前期考察了不同流動相體系、色譜柱、柱溫、流速，根據(jù)色譜圖信息豐富程度，峰數(shù)量以及峰形為條件，最終確定了本文的色譜條件，并在參考文獻(xiàn)[14-15]的基礎(chǔ)上結(jié)合對供試品溶液的制備方法進(jìn)行考察（不同濃度的溶劑、提取方式、提取時間進(jìn)行考察），最終發(fā)現(xiàn)在70%的甲醇下超聲45 min時的供試品溶液中各成分含量最高。

3.2 共有峰指認(rèn)及存在的不足

18批不同來源的菝葜飲片共標(biāo)定了13個共有峰，指認(rèn)出5個成分，分別為綠原酸、落新婦苷、槲皮苷、黃杞苷、白藜蘆醇。不足之處在于仍然有7個成分未被指認(rèn)，后期將通過液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，解析未被指認(rèn)的共有峰的化學(xué)成分以及改用UPLC建立指紋圖譜，縮短分析時間。

3.3 多模式化學(xué)計量學(xué)分析

聚類分析、主成分分析、OPLS-DA可以準(zhǔn)確地分析不同來源菝葜之間的差異，從結(jié)果來看，三類分析結(jié)果一致，其中YP1～YP3為一類，YP7～YP10為一類，YP4～YP6、YP12～YP18為一類，表明不同來源的菝葜飲片的化學(xué)組成沒有明顯的地域性，質(zhì)量較為穩(wěn)定。

綜上本研究建立了不同來源菝葜飲片的HPLC指紋圖譜，通過多模式化學(xué)計量學(xué)分析對飲片進(jìn)行綜合評價，該結(jié)果可為菝葜飲片的質(zhì)量評價及控制提供參考。