• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

    2023-11-02 16:01:07陳文杰梁江韋清源湯復(fù)躍郭小紅陳淵
    關(guān)鍵詞:轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

    陳文杰 梁江 韋清源 湯復(fù)躍 郭小紅 陳淵

    摘要:【目的】基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)開(kāi)發(fā)輔助鑒定南方大豆皺葉癥(SSCLD)的分子標(biāo)記,為快速鑒定生產(chǎn)上遇到的大豆皺葉是否為SSCLD提供技術(shù)支撐?!痉椒ā坷棉D(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的差異表達(dá)基因(DEGs),從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列,篩選出表達(dá)差異較大的DEGs進(jìn)行分子標(biāo)記開(kāi)發(fā),利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗(yàn)評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的表達(dá)專(zhuān)一性,并利用不同類(lèi)型的皺葉表型樣本對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)專(zhuān)一性及可靠性驗(yàn)證?!窘Y(jié)果】7株皺葉植株樣本和5株正常葉植株樣本的測(cè)序堿基錯(cuò)誤率為0.0226~0.0238,Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量均大于95.00%,GC含量為45.60%~46.24%,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。皺葉大豆材料較正常葉大豆材料有1063個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá),85個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)。根據(jù)基因的表達(dá)量和同源性,共篩選8個(gè)DEGs用作開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的候選基因,均表現(xiàn)為明顯上調(diào)表達(dá)。8個(gè)候選基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本相符。此外,所篩選基因中有6個(gè)基因表達(dá)在不同程度上受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境脅迫誘導(dǎo),其中,種植于皺葉癥土壤中的皺葉型株系葉片GLYMA_18G033400基因的相對(duì)表達(dá)量均高于其在正常土壤中受干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽等逆境脅迫后的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)GLYMA_18G033400基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記qCL-18G033400,并用該分子標(biāo)記對(duì)19份不同皺葉類(lèi)型的葉片樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),以ΔCt值小于10.00作為SSCLD的判定標(biāo)準(zhǔn),分子標(biāo)記鑒定結(jié)果同田間鑒定結(jié)果一致。【結(jié)論】利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

    關(guān)鍵詞:大豆;皺葉癥;分子標(biāo)記;開(kāi)發(fā);轉(zhuǎn)錄組;輔助鑒定

    中圖分類(lèi)號(hào):S565.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號(hào):2095-1191(2023)06-1587-11

    Development of molecular markers based on transcriptome

    sequencing for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease

    CHEN Wen-jie1, LIANG Jiang1, WEI Qing-yuan1, TANG Fu-yue1,

    GUO Xiao-hong1, CHEN Yuan2*

    (1Cash Crops Research Institute,Guangxi Academy of Agricultural Sciences,Nanning, Guangxi? 530007,China;

    2Key Laboratory of Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, Guangxi? 530007,China)

    Abstract:【Objective】Molecular markers based on transcriptome sequencing(RNA-Seq) for assisting the identification of southern soybean crinkle leaf disease(SSCLD) was developed to provide technical support for quickly identifying whether the soybean leaves encountered in production were SSCLD. 【Method】Transcriptome sequencing technology was used to analyze differentially expressed genes between crinkle leaf and normal leaf soybean materials with similar genetic background in the crinkle leaf-induced soil environment. Homologous sequences with highly similar nucleotide sequences were removed, DEGs with large expression differences were selected for molecular marker development, the expression specificity of molecular markers was evaluated by using crinkle leaf soybean material and stress treatment test, and the expression specificity and reliability of molecular markers were verified by different types of crinkle leaf phenotype samples. 【Result】The sequencing base error rate of seven crinkle leaf plants and five normal leaf plants were 0.0226-0.0238, the numbers of bases in Q20 and Q30 were 99.00% and 99.90%, and the GC contents were 45.60% to 46.24%, indicating good quality of transcriptome sequencing data. Transcriptome data showed that 1063 genes were up-regulated and 85 genes were down-regulated in leaves from the crinkle leaf type material,compared to that from normal leaf type material. Based on the expression level and homology of the genes, eight genes were screened according to the expression level and the identification of the homology in soybean genome,and both of them were up-regulated genes. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis of the eight candidate genes generally agreed with the transcriptome data.The expression levels of six of these genes showed varying degrees of interference by diverse abiotic stress,including dry stress,water logging stress,cold stress,shade and salt stress,and the expression level of GLYMA_18G033400 in crinkle leaves from the crinkle leaf-induced environment was higher than that from normal soil under dry stress,waterlogging stress,cold stress,shade and salt stress. Molecular marker qCL-18G033400 was designed according to the GLYMA _ 18 G033400 gene sequence, and used to perform real-time fluorescence quantitative PCR on 19 leaf samples of different crinkle leaf types. The results showed that ΔCt value less than 10.00 was used as the determination criterion of SSCLD, and the identification results were consistent with the field identification results. 【Conclusion】Molecular marker qCL-18G033400 deve-loped using transcriptome sequencing can assist in the identification of SSCLD.

    Key words: soybean; crinkle leaf disease; molecular marker; development; transcriptome; auxiliary identification

    Foundation items:National Natural Science Foundation of China(32060490, 32260451); Special Construction Project of China Agriculture Research System (CARS-04-CES30); Guangxi National Science Foundation(2019GXNSFAA185009)

    0 引言

    【研究意義】大豆[Glycine max (L.) Merr.]是豆科大豆屬的一年生草本植物,是我國(guó)重要的糧、油、飼兼用作物,在我國(guó)國(guó)民生產(chǎn)中具有重要的作用。南方大豆產(chǎn)區(qū)是我國(guó)重要的高蛋白大豆產(chǎn)區(qū)之一,為大豆蛋白加工提供優(yōu)質(zhì)的原料。近年來(lái)廣西、廣東、福建和貴州等地大豆生產(chǎn)中出現(xiàn)類(lèi)似但非大豆病毒病引起的葉片皺縮病癥,稱(chēng)為南方大豆皺葉癥(Southern soybean crinkle leaf disease,SSCLD),發(fā)生嚴(yán)重時(shí)大豆可減產(chǎn)40%左右(陳文杰等,2022a),嚴(yán)重影響該產(chǎn)區(qū)大豆的生產(chǎn)。引發(fā)大豆皺葉的因素有病毒、除草劑、金屬離子、基因突變等,其中病毒、除草劑等引起的大豆皺葉與 SSCLD的葉片形態(tài)上存在相似性,受大豆品種等差異因素的影響,很難準(zhǔn)確辨別生產(chǎn)上遇到的皺葉類(lèi)型是否為SSCLD(陳文杰等,2022b)。然而,SSCLD葉片表型具有表達(dá)專(zhuān)一性,推測(cè)SSCLD葉片中存在特異表達(dá)基因,該基因可用于開(kāi)發(fā)輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記。因此,開(kāi)發(fā)輔助鑒定南方大豆皺葉癥分子標(biāo)記,以期快速判定皺葉類(lèi)型是否為SSCLD,對(duì)大豆皺葉癥檢測(cè)和防治及安全生產(chǎn)具有重要的研究意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】鑒定由病毒引起的皺葉癥狀時(shí),可根據(jù)病毒保守序列設(shè)計(jì)特異分子標(biāo)記,再對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增進(jìn)行判斷。目前此類(lèi)鑒定方法已很成熟,廣泛用于豆類(lèi)(涂麗琴等,2019;吉穎等,2022)、馬鈴薯(魏瑤等,2020)、辣椒(龔明霞等,2022)和黃瓜(車(chē)海彥等,2020)等作物上。隨著酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和膠體金免疫層析法(Gold immunochromatography assy,GICA)等免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,使得病毒病的檢測(cè)快速便捷(王佳等,2021;董旭旭等,2022)。因此,病毒感染所導(dǎo)致的皺葉癥(Samertwanich et al.,2001;Ramon et al.,2014;王大剛等,2018;Yang et al.,2019)可通過(guò)免疫學(xué)檢測(cè)法和分子標(biāo)記法(趙小慧等,2021)檢測(cè),但SSCLD并非由病毒感染所致,無(wú)法利用這2種方法檢測(cè)。本研究團(tuán)隊(duì)前期根據(jù)田間皺葉形態(tài)建立SSCLD鑒定方法(陳文杰等,2020)。該方法需將被鑒定大豆種質(zhì)的種子種植于穩(wěn)定誘發(fā)SSCLD的土壤中,根據(jù)大豆不同時(shí)期葉片形態(tài)表現(xiàn)進(jìn)行鑒定。對(duì)于其他地區(qū)生產(chǎn)上出現(xiàn)的皺葉癥狀,單從形態(tài)上有時(shí)較難判定是否為SSCLD類(lèi)型?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前針對(duì)大豆皺葉的研究還比較少,具體何種因素導(dǎo)致SSCLD尚不清楚。SSCLD表型上具有表達(dá)專(zhuān)一性,推測(cè)SSCLD發(fā)生時(shí)會(huì)有特異表達(dá)基因,這些基因可用于開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助鑒定SSCLD,但目前鮮見(jiàn)開(kāi)發(fā)輔助鑒定SSCLD分子標(biāo)記的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)分析遺傳背景相近的皺葉大豆和正常葉大豆材料在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的差異表達(dá)基因(Differentially expressed genes,DEGs),從中去除核苷酸序列高度相似的同源序列,篩選出表達(dá)差異較大的DEGs進(jìn)行分子標(biāo)記開(kāi)發(fā),利用皺葉大豆材料和逆境處理試驗(yàn)評(píng)價(jià)分子標(biāo)記的表達(dá)專(zhuān)一性,并利用不同類(lèi)型的皺葉表型樣本對(duì)分子標(biāo)記進(jìn)行表達(dá)專(zhuān)一性及可靠性驗(yàn)證,以期開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記用于輔助鑒定SSCLD。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗(yàn)材料

    供試的大豆品種為桂春8號(hào)(正常葉,皺葉癥級(jí)為0)和粵春2017-1(皺葉,皺葉癥級(jí)為7)有性雜交衍生的雜合異質(zhì)系材料GY_C(皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下表現(xiàn)皺葉)和GY_N(皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境表現(xiàn)正常葉)(陳文杰等,2022a)以及近雜合異質(zhì)系材料F2:7,即從F2代取雜合單株進(jìn)行株行種植,收獲皺葉單株,再進(jìn)行株行種植,然后選擇分離的株行收獲皺葉單株繼續(xù)進(jìn)行株行種植,按照此方法一直種至F2:6代的植株,單株收獲F2:6代中皺葉植株,得到F2:6代皺葉單株的種子F2:7,以上材料均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供。主要試劑:總RNA提取試劑盒(RNAsimple Total RNA Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒[FastKing RT Kit (With gDNase)]均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;2×Es Taq MasterMix購(gòu)自于康為世紀(jì)生物科技有限公司;2×ChamQTM Univarsal SYBR qPCR Master Mix購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技股份有限公司。主要設(shè)備儀器:LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche,美國(guó))

    1. 2 試驗(yàn)方法

    1. 2. 1 F2:7代皺葉癥田間鑒定試驗(yàn) F2:6代皺葉單株的種子F2:7于2020年3月8日播種于廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽(yáng)基地(東經(jīng)108°14′11″,北緯22°36′30″,海拔105.64 m,紅壤土),多年試驗(yàn)證明該地塊為大豆皺葉癥表現(xiàn)穩(wěn)定的地塊。選擇皺葉和正常葉分離的株行(圖1),于始花期分別取7株皺葉植株(C_3、C_6、C_10、C_11、C_18、C_23和C_24)和5株正常葉植株(N1_1、N1_3、N1_5、N1_6和N1_7)的頂部嫩葉2 g左右,分別用錫箔紙包好后置于液氮保存,隨后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

    采用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,即提取總RNA后Oligo dT富集mRNA,然后對(duì)富集后的mRNA進(jìn)行片段化處理,隨后利用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,片段兩端連接adaptor后利用Illumina NovaSeq 6000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序完成后,圖像信號(hào)經(jīng)Base Calling得到Raw bases,數(shù)據(jù)質(zhì)控得到Clean data,使用TopHat2 (http://tophat.cbcb.umd.edu/)與大豆參考基因組Wlliams82.a4.v1(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82a4_v1)進(jìn)行對(duì)比得到mapped data(Kim et al.,2013),使用Cufflinks(http://cole-trapnelllab.github.io/cufflinks/)將mapped reads進(jìn)行組裝拼接(Trapnell et al.,2010),使用RSEM獲得每個(gè)樣本基因/轉(zhuǎn)錄本的Read Counts(Li and Deweg,2011),然后對(duì)其進(jìn)行TPM(Transcripts per million reads)轉(zhuǎn)換,進(jìn)而得到標(biāo)準(zhǔn)化的基因/轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。TPM轉(zhuǎn)換方式:先將讀數(shù)計(jì)數(shù)除以每個(gè)基因的長(zhǎng)度(以千堿基為單位),得到每千堿基Reads(Reads per kilobase,RPK)。計(jì)算各樣本中所有的RPK值,然后將其除以1000000,得到每百萬(wàn)縮放因子(Per million scaling factor),最后將RPK值除以每百萬(wàn)縮放因子即可得到TPM。

    1. 2. 2 逆境處理試驗(yàn) 為驗(yàn)證在皺葉和正常葉中表達(dá)差異的基因是否具專(zhuān)一性,2021年7—12月利用皺葉材料GY_C進(jìn)行干旱(Drought stress treatment,DST)、水漬(Water logging treatment,WLT)、冷害(Cold stress treatment,CST)、蔭蔽(Shading treatment,ST)和鹽脅迫(Salt stress treatment,SST)等逆境處理試驗(yàn)。試驗(yàn)采用盆栽方法,逆境處理使用土為營(yíng)養(yǎng)土(皺葉材料表現(xiàn)正常),設(shè)置1個(gè)營(yíng)養(yǎng)土對(duì)照(CKN)和1個(gè)皺葉土壤對(duì)照(CKC),重復(fù)3次。皺葉種子播種于花盆(口徑×底徑×高為21.5 cm×17.3 cm×14.8 cm),每盆播種4~5粒,待真葉期每盆留2株,隨后分別進(jìn)行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理。干旱脅迫處理參考王興榮等(2021)的方法,即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理,停止正常供水3 d后取頂部嫩葉。水漬處理參考孫慧敏等(2010)的方法,即第3片復(fù)葉期開(kāi)始水漬處理15 d后取頂部嫩葉。冷害處理參考蓋志佳等(2019)的方法,即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理,3 ℃培養(yǎng)箱中處理12 h后取頂部嫩葉。蔭蔽處理參考劉婷等(2016)的方法,即第6片復(fù)葉期在透光率為50%的遮陽(yáng)網(wǎng)下處理5 d后取頂部嫩葉。鹽脅迫參考嚴(yán)勇亮等(2021)的方法,即第6片復(fù)葉期開(kāi)始處理,置于1.5%的NaCl溶液中處理3 d后取頂部嫩葉。CKN和CKC均于第6片復(fù)葉期取頂部嫩葉。嫩葉用錫箔紙包好置于液氮中保存?zhèn)溆?。用RNAsimple Total RNA Kit提取嫩葉樣品總RNA,然后用FastKing RT Kit (With gDNase)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

    1. 2. 3 皺葉樣品采集及田間鑒定試驗(yàn) 2021年7—9月分別在南寧、貴港和賀州等地取不同大豆皺葉類(lèi)型的大豆植株,取嫩葉后提取其總RNA,然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA備用。同時(shí)用標(biāo)牌標(biāo)記好植株成熟后收獲該單株,2022年春季在廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院明陽(yáng)基地田間鑒定各材料的皺葉癥級(jí),鑒定方法參考陳文杰等(2020),即始花期連續(xù)調(diào)查10株的皺葉癥級(jí),根據(jù)以下公式計(jì)算皺葉病癥指數(shù)(DI):

    DI(%)=[∑(N×R)/(M×T)]×100

    式中,N表示病害某一級(jí)別的植株數(shù);R表示病害的相對(duì)病級(jí)數(shù)值;M表示病害的最高病級(jí)數(shù)值;T表示調(diào)查的總株數(shù)。然后根據(jù)皺葉癥指數(shù)劃定皺葉癥分級(jí):0級(jí)為高抗(HR),DI=0;3級(jí)為抗(R),0<DI≤30%;5級(jí)為中抗(MR),30%<DI≤60%;7級(jí)為感(S),60%<DI≤90%;9級(jí)為高感(HS),DI>90%。

    1. 3 DEGs篩選

    為了篩選DEGs,對(duì)各基因的TPM值進(jìn)行t檢驗(yàn),篩選皺葉和正常葉的DEGs。篩選條件:TPM-Cmin>TPM-Nmax或TPM-Cmax<TPM-Nmin、TPM-Cmin/TPM-Nmax≥5或TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5。其中,TPM-Cmin表示某基因中皺葉個(gè)體TPM最小值;TPM-Nmax表示某基因中正常葉個(gè)體TPM最大值;TPM-Cmax表示某基因中皺葉個(gè)體TPM最大值;TPM-Nmin表示某基因中正常葉個(gè)體TPM最小值。

    1. 4 DEGs同源性比對(duì)分析

    因大豆屬于古四倍體,大多數(shù)基因?qū)儆谕葱蛄?,?dǎo)致擴(kuò)增該基因難以保證其表達(dá)專(zhuān)一性。因此,設(shè)計(jì)分子標(biāo)記時(shí)需刪掉候選基因中核苷酸序列高度相似的基因。將篩選得到的基因cDNA預(yù)測(cè)序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行BLAST比對(duì),以獲得大豆基因組內(nèi)的核苷酸序列高度相似的序列,從候選基因中刪除這些序列。核苷酸序列高度相似的基因判定規(guī)則:Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%;不存在高度相似基因滿(mǎn)足條件:NQP<1。NQP代表Query cover≥80.00%且Percent identity≥80.00%基因的個(gè)數(shù)。

    1. 5 分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及表達(dá)驗(yàn)證

    利用Primer 5.0設(shè)計(jì)篩選得到候選基因的定量引物,引物擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度控制在100~250 bp。通過(guò)溫度梯度PCR檢測(cè)擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率和最適退火溫度(表1)。挑選擴(kuò)增條帶清晰且不存在非表達(dá)專(zhuān)一性擴(kuò)增的引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。以皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境中的GY_C和GY_N株系葉片cDNA為模板,以GmActin為內(nèi)參基因,引物見(jiàn)表1,用上述篩選出的引物驗(yàn)證分子標(biāo)記表達(dá)的差異性。利用2×Es Taq MasterMix試劑盒進(jìn)行引物篩選。溫度梯度PCR反應(yīng)體系25.0 μL: 2×Es Taq MasterMix 12.5 μL,10 nmol/L上、下游引物各1.0 μL,4 ng/μL cDNA模板1.0 μL,ddH2O補(bǔ)足至25.0 μL;擴(kuò)增程序:96 ℃預(yù)變性2 min;96 ℃ 30 s,退火溫度(見(jiàn)表1)30 s,72 ℃ 10 s,進(jìn)行36個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。利用2×ChamQTM Universal SYBR qPCR MasterMix試劑盒對(duì)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),操作流程參考其說(shuō)明書(shū)。

    1. 6 分子標(biāo)記表達(dá)專(zhuān)一性評(píng)價(jià)

    以干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理及相應(yīng)對(duì)照CKN和CKC的GY_C株系葉片cDNA為模板,Actin11為內(nèi)參基因,對(duì)篩選出的優(yōu)質(zhì)分子標(biāo)記進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),進(jìn)一步篩選出受逆境影響小的基因中的分子標(biāo)記。

    1. 7 分子標(biāo)記可靠性驗(yàn)證

    以Actin11為內(nèi)參基因,用篩選出的分子標(biāo)記對(duì)南寧、貴港和賀州等地采集的不同皺葉類(lèi)型的大豆葉片進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。依據(jù)各基因的ΔCt值進(jìn)行SSCLD鑒定,并將鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果相比較,以驗(yàn)證分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的吻合度。

    1. 8 統(tǒng)計(jì)分析

    利用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析;采用IBM SPSS Statistics 19進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果與分析

    2. 1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析結(jié)果

    由轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)(表2)可知,12個(gè)樣本的測(cè)序堿基錯(cuò)誤率為0.0226~0.0238,均在0.1000%以下,Q20和Q30分別在99.00%和99.90%以上的堿基數(shù)量占總堿基數(shù)量均大于95.00%,GC含量為45.60%~46.24%。由表3可知,每個(gè)樣本93.00%以上的reads均可比對(duì)到大豆參考基因組上,表明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好,可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

    2. 2 DEGs篩選及同源性分析結(jié)果

    在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下,皺葉材料和正常葉材料葉片共同表達(dá)基因數(shù)為32100個(gè),占表達(dá)基因總數(shù)的94.1%,其中在皺葉材料葉片中DEGs數(shù)為1351個(gè),占表達(dá)基因總數(shù)的4.0%;在正常葉材料葉片中DEGs數(shù)為660個(gè),占表達(dá)基因總數(shù)的1.9%(圖2-A)。與正常葉材料相比,皺葉材料中有1063個(gè)DEGs上調(diào)表達(dá),85個(gè)DEGs下調(diào)表達(dá)(圖2-B)。其中,上調(diào)的DEGs中TPM-Cmin>TPM-Nmax的基因有540個(gè),下調(diào)的DEGs中TPM-Cmax<TPM-Nmin的基因有39個(gè)。下調(diào)的DEGs中無(wú)TPM-Nmin/TPM-Cmax≥5.00的基因,上調(diào)的DEGs中在正常葉中不表達(dá)的共有13個(gè),但其中11個(gè)基因的TPM平均值小于1.00,可作為備選基因。最終篩選出9個(gè)表達(dá)差異較大的DEGs(表4),且均表現(xiàn)為明顯表達(dá)上調(diào)。

    提取上述9個(gè)DEGs的cDNA序列,并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示僅有GLYMA_15G156200基因在大豆基因組中存在2個(gè)高度相似基因(表4),且與GLYMA_09G049500基因的Query cover和Percent identity分別為88.00%和92.27%。因此選擇余下的8個(gè)DEGs用作開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的候選基因。

    2. 3 輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)

    根據(jù)篩選出的8個(gè)候選基因cDNA序列信息設(shè)計(jì)引物,以溫度梯度PCR篩選引物的最佳退火溫度。以皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境下的皺葉材料(GY_C)和正常葉材料(GY_N)株系葉片cDNA為模板,對(duì)8個(gè)候選基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè),結(jié)果(表5)顯示,與正常葉材料相比,皺葉材料葉片中8個(gè)候選基因的表達(dá)量均明顯增加,其中差異倍數(shù)最小的是GLYMA_13G167100基因,僅為2.55倍;差異倍數(shù)最大的是GLYMA_18G033400基因,達(dá)66.26倍。表達(dá)差異較小可能會(huì)影響SSCLD的鑒定效果。因此,選擇表達(dá)差異較大的GLYMA_18G033400、GLYMA_09G130800、GLYMA_15G160600、GLYMA_15G156200、GLYMA_04G242400和GLYMA_07G229500共6個(gè)基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行后續(xù)專(zhuān)一性評(píng)價(jià)試驗(yàn)。

    2. 4 分子標(biāo)記專(zhuān)一性評(píng)價(jià)結(jié)果

    干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫等逆境是生產(chǎn)中常見(jiàn)的非生物逆境脅迫。對(duì)皺葉材料進(jìn)行干旱、水漬、冷害、蔭蔽和鹽脅迫處理,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)表達(dá)量差異較大的6個(gè)基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行專(zhuān)一性評(píng)價(jià),結(jié)果(表6)顯示,qCL-09G130800在蔭蔽、干旱、冷害和鹽脅迫處理下的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC和CKN均顯著增加(P<0.05,下同),qCL-15G160600在蔭蔽和鹽脅迫處理下的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKN顯著增加,qCL-04G242400在鹽脅迫處理的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC顯著增加,qCL-15G156200在蔭蔽、和鹽脅迫處理的葉片中相對(duì)表達(dá)量較CKC顯著增加,表明這些基因的表達(dá)受逆境脅迫影響的程度高于SSCLD,盡管qCL-18G033400在蔭蔽、冷害和鹽脅迫處理植株葉片中相對(duì)表達(dá)量顯著高于CKN,但均顯著低于CKC。因此,選擇qCL-18G033400為輔助鑒定SSCLD的候選分子標(biāo)記。

    2. 5 分子標(biāo)記可靠性驗(yàn)證結(jié)果

    2021年4—6月,從南寧、貴港和賀州等地采集不同皺葉類(lèi)型的大豆葉片樣品共19份(圖3)。其中,從南寧明陽(yáng)基地采集到14份樣品(編號(hào)為樣1~14),從貴港市良種繁殖示范場(chǎng)采集到2份樣品(編號(hào)為樣15和樣16),從賀州市黃姚鎮(zhèn)采集1份(樣17),從賀州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地采集到2份(編號(hào)為樣18和樣19)。利用GLYMA_18G033400基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400對(duì)19份皺葉樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。根據(jù)內(nèi)參基因Actin11的表達(dá)量計(jì)算出各樣本GLYMA_18G033400基因的相對(duì)表達(dá)量ΔCt值,同時(shí)進(jìn)行田間皺葉癥抗性鑒定,結(jié)果如表6所示。當(dāng)材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值大于10.00時(shí),田間鑒定為高抗性材料(皺葉癥級(jí)為0級(jí));當(dāng)材料的GLYMA_18G033400基因ΔCt值小于10.00時(shí),田間鑒定為中抗、感等材料,表明該標(biāo)準(zhǔn)可滿(mǎn)足分子標(biāo)記輔助鑒定SSCLD的要求。

    3 討論

    SSCLD在我國(guó)南方多個(gè)?。▍^(qū))可導(dǎo)致大豆嚴(yán)重減產(chǎn)(陳文杰等,2022a)。本研究課題組團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SSCLD不同以往的大豆皺葉類(lèi)型,極有可能由土壤中未知微生物所致,建立快速準(zhǔn)確的SSCLD鑒定方法可為SSCLD的防治提供技術(shù)支持。陳文杰等(2022a)根據(jù)大豆葉片皺縮程度建立了SSCLD田間鑒定方法,但該方法需要穩(wěn)定發(fā)病的田間環(huán)境,且無(wú)法直接鑒定生產(chǎn)上遇到的皺葉是否屬于SSCLD,若采用南方皺葉癥田間鑒定方法對(duì)種子進(jìn)行鑒定,可能出現(xiàn)假陽(yáng)性現(xiàn)象,比如對(duì)于攜帶皺葉基因(顯性)材料,葉片可能發(fā)生非SSCLD類(lèi)型的皺縮,收集該材料種子進(jìn)行田間鑒定結(jié)果就會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)廣泛用于植株分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)(胡小文等2022;秦英之等,2022;徐曉丹等,2023),尤其是用于沒(méi)有參考基因組的植物上(伍越等,2021)。為了克服表型鑒定SSCLD的缺點(diǎn),本研究以遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料為研究對(duì)象,通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析篩選其葉片在皺葉癥誘導(dǎo)環(huán)境中的DEGs,并進(jìn)一步開(kāi)發(fā)出輔助鑒定SSCLD的分子標(biāo)記。

    本研究篩選出用作開(kāi)發(fā)輔助鑒定皺葉分子標(biāo)記的候選基因GLYMA_18G033400。該基因在Soybase網(wǎng)站(https://www.soybase.org/)查詢(xún)結(jié)果顯示,其序列全長(zhǎng)為790 bp,含2個(gè)外顯子,編碼區(qū)序列僅為249 bp。再將該基因序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示,該基因與LOC114394687基因的序列一致。LOC114394687基因編碼一種lncRNA,但功能未知,在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,結(jié)果顯示,僅有一條來(lái)自蕓豆(Phaseolus vulgaris)的mRNA與其同源。lncRNA雖不編碼蛋白,但在表觀遺傳調(diào)控(Gupta et al.,2010)、細(xì)胞周期調(diào)控(Kitagawa et al.,2013)和細(xì)胞分化調(diào)控(Yao et al.,2022)等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。一些lncRNA是人類(lèi)腫瘤重要的調(diào)控因子,在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有表達(dá)專(zhuān)一性,故常被作為一種生物標(biāo)志物用于腫瘤的診斷(王思宇和王宇,2022)。大量研究表明,lncRNA廣泛參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)生物或非生物逆境等生理過(guò)程(李寧等,2019),如lncRNASABC1基因通過(guò)響應(yīng)化學(xué)信號(hào)等介導(dǎo)的早期快速抗性反應(yīng)激活植物對(duì)病原的免疫(Liu et al.,2022)。本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常葉相比,GLYMA_18G033400基因在皺葉中的相對(duì)表達(dá)量顯著性增加,且其表達(dá)受遮蔭和干旱等生產(chǎn)上常見(jiàn)的非生物逆境脅迫影響較小,推測(cè)該基因在SSCLD發(fā)生過(guò)程中具有一定的表達(dá)專(zhuān)一性。GLYMA_18G033400基因是否在其他逆境誘導(dǎo)的葉片中表達(dá)量高于皺葉癥,目前尚未知需要更多的逆境試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,但其并不影響GLYMA_18G033400基因作為SSCLD鑒定的指示基因。在涉及大量皺葉性狀的材料需鑒定時(shí),可利用該基因開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記進(jìn)行初篩。低表達(dá)的皺葉類(lèi)型可斷定為非南方皺葉癥類(lèi)型,而對(duì)于高表達(dá)的皺葉類(lèi)型可借助田間鑒定方法進(jìn)行綜合判定。目前該分子標(biāo)記鑒定采集的19份皺葉材料同田間鑒定結(jié)果一致性較好,但還需要更多的皺葉材料驗(yàn)證該分子標(biāo)記鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外,導(dǎo)致大豆皺葉的誘因還有很多,如病毒、除草劑、金屬離子等,分子標(biāo)記在這些誘因?qū)е碌陌櫲~中GLYMA_18G033400基因是否過(guò)表達(dá)目前尚未知,還需要進(jìn)一步收集這些誘因?qū)е碌陌櫲~樣品對(duì)qCL-18G033400進(jìn)行驗(yàn)證。

    分子標(biāo)記輔助鑒定SSCLD的方法較田間鑒定方法縮短了鑒定時(shí)間,能在較短時(shí)間內(nèi)判斷生產(chǎn)上遇到的皺葉癥狀是否為SSCLD,為今后生產(chǎn)上SSCLD的快速診治提供技術(shù)參考。但目前生產(chǎn)上存在皺葉癥狀的嚴(yán)重程度不等的情況,目前還缺乏不同皺葉癥級(jí)與標(biāo)記qCL-18G033400表達(dá)量方面的數(shù)據(jù)。因此,若要想精準(zhǔn)判定葉片皺縮是否為SSCLD需盡快找出SSCLD致病因子,通過(guò)檢測(cè)土壤或植株中致病因子含量情況進(jìn)行精準(zhǔn)判定。

    4 結(jié)論

    根據(jù)遺傳背景相近的皺葉材料和正常葉材料的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),從DEGs中篩選出SSCLD表達(dá)專(zhuān)一性表達(dá)的基因GLYMA_18G033400,利用其開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記qCL-18G033400可輔助鑒定SSCLD。

    參考文獻(xiàn):

    車(chē)海彥,曹學(xué)仁,賀延恒,羅大全. 2020. 海南島黃瓜病毒病種類(lèi)鑒定及其發(fā)生分布研究[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào),41(11):2280-2284. [Che H Y,Cao X R,He Y H,Luo D Q. 2020. Distribution and identification of viruses from cucumber in Hainan Island[J]. Chinese Journal of Tropical Crops,41(11):2280-2284.] doi:10.3969/j.issn.1000-2561. 2020.11.019.

    陳文杰,陳淵,韋清源,郭小紅,湯復(fù)躍,楊萌,葉萬(wàn)典,梁江. 2020. 一種大豆皺葉癥發(fā)生特性及材料癥級(jí)鑒定[J]. 大豆科學(xué),39(3):431-441. [Chen W J,Chen Y,Wei Q Y,Guo X H,Tang F Y,Yang M,Ye W D,Liang J. 2020. Study on inducement of soybean crinkle leaf in south of China[J]. Soybean Science,39(3):431-441.] doi:10. 11861/j.issn.1000-9841.2020.03.0431.

    陳文杰,陳淵,韋清源,郭小紅,湯復(fù)躍,趙團(tuán)結(jié),梁江. 2022a. 南方大豆皺葉發(fā)生時(shí)葉片形態(tài)變化及其對(duì)產(chǎn)量性狀的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),53(2):460-468. [Chen W J,Chen Y,Wei Q Y,Guo X H,Tang F Y,Zhao T J,Liang J. 2022a. Changes of leaf morphology during the occurrence of wrinkled leaves in southern soybean and its effects on yield traits[J]. Journal of Southern Agriculture,53(2):460-468.] doi:10.3969/j.issn.2095-1191.2022. 02.019.

    陳文杰,梁江,寧德嬌,韋清源,湯復(fù)躍,郭小紅,梁俊,陳淵. 2022b. 南方大豆皺葉癥誘因分析研究[J]. 大豆科學(xué),41(3):300-307. [Chen W J,Liang J,Ning D J,Wei Q Y,Tang F Y,Guo X H,Liang J,Chen Y. 2022b. Study on inducement of soybean crinkle leaf in Southern of China[J]. Soybean Science,41(3):300-307.] doi:10.11861/j.issn.1000. 9841.2022.030300.

    董旭旭,孫威,曹攀,劉曉丹. 2022. 膠體金免疫層析試紙條技術(shù)在病毒檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用研究現(xiàn)狀[J]. 生物工程學(xué)報(bào),38(9):3243-3254. [Dong X X,Sun W,Cao P,Liu X D. 2022. Colloidal gold immunochromatographic test strip for virus detection:A review[J]. Chinese Journal of Biotechnology,38(9):3243-3254.] doi:10.13345/j.cjb.220052.

    蓋志佳,張敬濤,劉婧琦,蔡麗君,杜佳興,孟慶英,谷維,陳磊. 2019. 低溫脅迫對(duì)大豆幼苗形態(tài)生理指標(biāo)及籽粒產(chǎn)量的影響[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報(bào),9(12):1-4. [Gai Z J,Zhang J T,Liu J Q,Cai L J,Du J X,Meng Q Y,Gu W,Chen L. 2019. Cold stress affects morphological and physiological indexes of soybean seedling and seed yield[J]. Journal of Agriculture,9(12):1-4.] doi:10.11923/j.issn.2095-4050.cjas18100009.

    龔明霞,趙虎,王萌,吳星,趙曾菁,何志,黃金梅,孟生德,王日升. 2022. 廣西辣椒病毒的sRNA深度測(cè)序和RT-PCR鑒定[J]. 園藝學(xué)報(bào),49(5):1060-1072.[Gong M X,Zhao H,Wang M,Wu X,Zhao Z J,He Z,Huang J M,Meng S D,Wang R S. 2022.Identification of viruses infecting peppers in Guangxi by small RNA deep sequencing and RT-PCR[J]. Acta Horticulturae Sinica,49(5):1060-1072.] doi:10.16420/j.issn.0513-353x.2021-0673.

    桂敏,高雪,賈志強(qiáng),杜磊,張芮豪,胡華冉,鐘秋月,李永忠,劉雅婷,龍洪進(jìn). 2022. 云南辣椒正番茄斑萎病毒屬病毒的分子鑒定[J]. 植物保護(hù),48(4):286-292. [Gui M,Gao X,Jia Z Q,Du L,Zhang R H,Hu H R,Zhong Q Y,Li Y Z,Liu Y T,Long H J. 2022. Molecular identification of Orthotospovirus on hot pepper in Yunnan[J]. Plant Protection,48(4):286-292.] doi:10.16688/j.zwbh.2021 290.

    胡小文,孔冉,劉洋,徐志軍,蘇俊波. 2022. 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)甘蔗SNP分子標(biāo)記[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),53(9):2527-2536. [Hu X W,Kong R,Liu Y,Xu Z J,Su J B. 2022. SNP molecular marker development based on sugarcane transcriptome sequencing[J]. Journal of Southern Agriculture,53(9):2527-2536.] doi:10.3969/j.issn.2095-1191. 2022.09.015.

    吉穎,吳淑華,崔曉艷,涂麗琴,高丹娜,程兆榜,周益軍,陳新,季英華,郭青云. 2022. 江蘇省大豆上一種新粉虱傳病毒的分子鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),50(10):30-36. [Ji Y,Wu S H,Cui X Y,Tu L Q,Gao D N,Cheng Z B,Zhou Y J,Chen X,Ji Y H,Guo Q Y. 2022. Molecular identification and phylogenetic analysis of a new whitefly-transmitted virus infecting soybean from Jiangsu Province[J]. Jiangsu Agricultural Sciences,50(10):30-36.] doi:10.15889/j.issn.1002-1302.2022.10.005.

    李寧,王柏柯,王娟,黃少勇,戴麒,帕提古麗,高杰,余慶輝. 2019. 植物長(zhǎng)鏈非編碼RNA的生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào),55(10):1427-1435. [Li N,Wang B K,Wang J,Huang S Y,Dai Q,Pa T G L,Gao J,Yu Q H. 2019. Advances in functional research of long no-coding RNAs in plants[J]. Plant Physiology Journal,55(10):1427-1435.] doi:10.13592/j.cnki.ppj.2019.0235.

    劉婷,劉衛(wèi)國(guó),任夢(mèng)露,杜勇利,鄧榆川,鄒俊林,方萍,楊文鈺. 2016. 遮蔭程度對(duì)不同耐蔭性大豆品種光合及抗倒程度的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),49(8):1466-1475. [Liu T,Liu W G,Ren M L,Du Y L,Deng Y C,Zou J L,F(xiàn)ang P,Yang W Y. 2016. Effects of shade degrees on photosynthesis and lodging resistance degree of different shade tolerance soybean[J]. Scientia Agricultura Sinica,49(8):1466-1475.] doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2016.08.004.

    秦英之,車(chē)佳航,尹躍,饒書(shū)培,安巍,戴國(guó)禮,陳金煥. 2022. 基于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組信息的枸杞SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),23(6):1816-1827. [Qin Y Z,Che J H,Yin Y,Rao S P,An W,Dai G L,Chen J H. 2022. SSR Marker development of Lycium germplasm based on full-length transcriptome information[J]. Journal of Plant Genetic Resources,23(6):1816-1827.] doi:10.13430/j.cnki.jpgr.20220330004.

    孫慧敏,趙團(tuán)結(jié),蓋鈞鎰. 2010. 大豆苗期耐淹性的遺傳與QTL分析[J]. 作物學(xué)報(bào),36(4):590-595. [Sun H M,Zhao T J,Gai J Y. 2010. Inheritance and QTL analysis of submergence tolerance at seedling stage in soybean [Glycine max (L.) Merr.][J]. Acta Agronomica Sinica,36(4):590-595.] doi:10.3321/j.issn:0496-3490.2008.05.004.

    涂麗琴,吳淑華,干射香,崔曉艷,趙文浩,程兆榜,陳新,周益軍,季英華,朱月林. 2019. 江蘇省蠶豆上菜豆黃花葉病毒的分子鑒定[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),35(4):804-810. [Tu L Q,Wu S H,Gan S X,Cui X Y,Zhao W H,Cheng Z B,Chen X,Zhou Y J,Ji Y H,Zhu Y L. 2019. Molecular identification of bean yellow mosaic virus infecting Vicia faba from Jiangsu Province[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,35(4):804-810.] doi:10.3969/j.issn. 1000-4440.2019.04.008.

    王大剛,李凱,智海劍. 2018. 大豆抗大豆花葉病毒病基因研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),51(16):3040-3059. [Wang D G,Li K,Zhi H J. 2018. Progresses of resistance on soybean mosaic virus in soybean[J]. Scientia Agricultura Sinica,51(16):3040-3059.] doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2018.16.002.

    王佳,崔高峰,祝寧,任俊達(dá),尚巧霞. 2021. 北京地區(qū)設(shè)施草莓8種病毒的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)[J]. 微生物學(xué)通報(bào),48(3):1048-1056. [Wang J,Cui G F,Zhu N,Ren J D,Shang Q X. 2021. Detection of eight viruses infecting greenhouse,strawberry in Beijing by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Microbiology China,48(3):1048-1056.]doi:10.13344/j.microbiol.china.200334.

    王思宇,王宇. 2022. LncRNA UCA1在腫瘤診斷中的研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué),34(7):806-814. [Wang S Y,Wang Y. 2022. Research progress of lncRNA UCA1 in tumor diagnosis[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences,34(7):806-814.] doi:10.13376/j.cbls/2022088.

    王興榮,劉章雄,張彥軍,李玥,李永生,茍作旺,祁旭升,邱麗娟. 2021. 大豆種質(zhì)資源不同生育時(shí)期抗旱性鑒定評(píng)價(jià)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào),22(6):1582-1594. [Wang X R,Liu Z X,Zhang Y J,Li Y,Li Y S,Gou Z W,Qi X S,Qiu L J. 2021. Evaluation on drought resistance of soybean germplasm resources at multiple growth periods[J]. Journal of Plant Genetic Resources,22(6):1582-1594.] doi:10.13430/j.cnki.jpgr.20210430002.

    魏瑤,劉燕,圖門(mén)白拉,趙明敏. 2020. 內(nèi)蒙古自治區(qū)馬鈴薯病毒病的檢測(cè)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),48(8):111-115. [Wei Y,Liu Y,Tu M B L,Zhao M M. 2020. Detection of potato virus disease in Inner Mogolia Autonomous Region[J]. Jiangsu Agricultural Sciences,48(8):111-115.] doi:10. 15889/j.issn.1002-1302.2020.08.020.

    伍越,王甜甜,李澤秀,紀(jì)慶柱,毛培利,諸葛緒欽,曹幫華. 2021. 木瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其遺傳多樣性分析[J]. 植物生理學(xué)報(bào),57(4):847-861. [Wu Y,Wang T T,Li Z X,Ji Q Z,Mao P L,Zhuge X Q,Cao B H. 2021. Identification of Chaenomeles EST-SSR markers and phylogenetic analysis[J]. Plant Physiology Journal,57(4):847-861.] doi:10.13592/j.cnki.ppj.2020.0512.

    徐曉丹,冷淼,張明媛,柯希望,殷麗華,左豫虎. 2023. 基于轉(zhuǎn)錄組的小豆SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究,41(1):13-18. [Xu X D,Leng M,Zhang M Y,Ke X W,Yin L H,Zuo Y H. 2023. Development and application of SSR molecular markers based on transcriptome sequencing of adzuki bean[J]. Agricultural Research in the Arid Areas,41(1):13-18.] doi:10.7606/j.issn. 1000-7601.2023.01.02

    嚴(yán)勇亮,張金波,路子峰,趙曉玲,劉海軍,趙康,叢花. 2021. 大豆種質(zhì)資源耐鹽性鑒定與評(píng)價(jià)[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),58(1):65-71. [Yan Y L,Zhang J B,Lu Z F,Zhao X L,Liu H J,Zhao K,Cong H. 2021. Salt tolerance evaluation of soybean germplasm[J]. Xinjiang Agricultural Sciences,58(1):65-71.] doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2021.01.008.

    趙小慧,吳茜,陳正強(qiáng),劉沖,邢錦城,陶小榮. 2021. 山東濟(jì)寧大豆病毒病的病原鑒定研究[J]. 大豆科學(xué),40(6):829-834. [Zhao X H,Wu X,Chen Z Q,Liu C,Xing J C,Tao X R. 2021. Identification of the viral pathogens infecting soybean in Jining,Shandong Province[J]. Soybean Science,40(6):829-834.] doi:10.11861/j.issn.1000-9841. 2021.06.0829.

    Gupta R A,Shah N,Wang K C,Kim J,Horlings H M,Wong D,Tsai M C,Hung T,Argani P,Rinn J,Wang Y L,Brzoska P,Kong B,Li R,West R B,Vijver M J,Sukumar S,Chang H Y. 2010. Long non-coding RNA HOTAIR reprograms chromatinstate to promote cancer metastasis[J]. Nature,464(7291):1071-1076. doi:10.1038/nature08975.

    Kim D,Pertea G,Trapnell C,Pimentel H,Kelley R,Salzberg S L. 2013. TopHat2:Accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions,deletions and gene fusions[J]. Genome Biology,14(4):R36. doi:10.1186/gb-2013-14-4-r36.

    Kitagawa M,Kitagawa K,Kotake Y,Niida H,Ohhata T. 2013. Cell cycle regulation by long non-coding RNAs[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,70:4785-4794. doi:10.1007/s00018-013-1423-0.

    Li B,Dewey C N. 2011. RSEM:Accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome[J]. BMC Bioinformatics,12:323. doi:10.1186/1471-2105-12-323.

    Liu N K,Xu Y Z,Qi L,Cao Y X,Yang D C,Liu S S,Wang X K,Mi Y J,Liu Y,Ding C X,Liu Y,Li Y,Yuan Y W,Gao G,Chen J F,Qian W Q,Zhang X M. 2022. A lncRNA fine-tunes salicylic acid biosynthesis to balance plant immunity and growth[J]. Cell Host and Microbe,30(8):1124-1138. doi:10.1016/j.chom.2022.07.001.

    Ramon E C,Nicolás B,Claudia N,Irma G L,Patricia R P. 2014. Bean yellow mosaic virus in soybean from Argentina[J]. Journal of Phytopathology,164:322-325. doi:10.1111/jph. 12185.

    Samertwanich K,Kertipakorn K,Chiemsombat P,Ikegami M. 2001. Complete nucleotide sequence and genome organization of soybean crinkle leaf virus[J]. Journal of Phytopathology,149(6):333-336. doi:10.1046/j.1439-0434. 2001.00629.x.

    Trapnell C,Williams B A,Pertea G,Mortazavi A,Kwan G,Baren M J,Salzberg S L,Wold B J,Pachter L. 2010. Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation[J]. Nature Biotechnology,28(5):511-515. doi:10.1038/nbt.1621.

    Yang X D,Niu L,Zhang W,He H L,Yang J,Xing G J,Guo D G,Zhao Q Q,Zhong X F,Li H Y,Li Q Y,Dong Y S. 2019. Increased multiple virus resistance in transgenic soybean overexpressing the double-strand RNA specific ribonuclease gene PAC1[J]. Transgenic Research,28(1):129-140. doi:10.1007/s11248-018-0108-8.

    Yao C,Li C,Liu Z J,Xiao L,Bai H W,Shi B Y. 2022. LNCRNA XIST inhibits miR-377-3p to hinder Th17 cell differentiation through upregulating ETS1[J]. Computational Intelligence and Neuroscience,2022:6545834. doi:10.1155/2022/6545834.

    (責(zé)任編輯 陳 燕)

    收稿日期:2023-03-05

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32060490,32260451);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(CARS-04-CES30);廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2019GXNSFAA185009)

    通訊作者:陳淵(1971-),https://orcid.org/0000-0003-0876-0154,研究員,主要從事大豆栽培和遺傳育種研究工作,E-mail:chenyuan 313@163.com

    第一作者:陳文杰(1982-),https://orcid.org/0000-0002-3317-4205,副研究員,主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機(jī)制研究工作,E-mail:cenwenji1030@163.com

    陳文杰(1982-),副研究員,主要從事大豆遺傳育種及耐逆境機(jī)制研究工作。主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“新型大豆皺葉基因CL12的圖位克隆及其對(duì)產(chǎn)量性狀影響”和“大豆皺葉癥關(guān)鍵致病因子分析及其誘發(fā)的皺葉分子機(jī)制”2項(xiàng)、廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“大豆皺葉癥抗基因鑒定及功能標(biāo)記開(kāi)發(fā)”1項(xiàng),作為主要成員參與省部級(jí)項(xiàng)目8項(xiàng);獲廣西科技進(jìn)步獎(jiǎng)二、三等獎(jiǎng)各1項(xiàng);以第一完成人育成已通過(guò)廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的大豆新品種1個(gè),作為主要參與者育成已通過(guò)廣西農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的大豆新品種8個(gè);獲第一發(fā)明人授權(quán)發(fā)明專(zhuān)利7件,實(shí)用新型專(zhuān)利7件;在《中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)》《南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)》《大豆科學(xué)》等期刊發(fā)表科技論文35篇,其中以第一作者發(fā)表中文核心期刊論文14篇。

    猜你喜歡
    轉(zhuǎn)錄組分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)
    基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的山茱萸次生代謝生物合成相關(guān)基因的挖掘
    金釵石斛轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)信息分析
    軟棗獼猴桃性別相關(guān)的SRAP分子標(biāo)記
    人參屬藥用植物轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展
    大白菜種質(zhì)資源抗根腫病基因CRa和CRb的分子標(biāo)記鑒定與分析
    玉米大斑病的研究進(jìn)展
    河南方言文化資源的保護(hù)及其開(kāi)發(fā)利用的研究
    遵義紅色旅游開(kāi)發(fā)對(duì)策研究
    基于J2EE和Ionic的ITer學(xué)習(xí)APP設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)
    單片機(jī)在電子技術(shù)中的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)
    成年免费大片在线观看| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 91字幕亚洲| 美女黄网站色视频| 日韩高清综合在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利高清视频| 麻豆国产97在线/欧美| 男插女下体视频免费在线播放| 最新在线观看一区二区三区| 韩国av一区二区三区四区| 嫩草影视91久久| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品影院久久| 又爽又黄a免费视频| 亚洲人成网站在线播| 一级作爱视频免费观看| 给我免费播放毛片高清在线观看| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲经典国产精华液单 | 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲国产高清在线一区二区三| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品一区二区性色av| av天堂在线播放| 欧美bdsm另类| 久久久成人免费电影| 免费高清视频大片| a级毛片a级免费在线| 国产高清有码在线观看视频| 久久久久九九精品影院| 美女cb高潮喷水在线观看| 内地一区二区视频在线| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 美女 人体艺术 gogo| 丁香六月欧美| 免费看a级黄色片| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品99久久久久久久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| av福利片在线观看| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一本精品99久久精品77| 九九在线视频观看精品| 欧美精品国产亚洲| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品久久久久久精品电影| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久国产成人免费| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲人与动物交配视频| 特大巨黑吊av在线直播| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 美女被艹到高潮喷水动态| 久久久久免费精品人妻一区二区| 白带黄色成豆腐渣| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 最好的美女福利视频网| 欧美在线一区亚洲| 十八禁国产超污无遮挡网站| 波多野结衣高清无吗| 中文字幕熟女人妻在线| 极品教师在线视频| 国语自产精品视频在线第100页| 草草在线视频免费看| 一区二区三区四区激情视频 | 亚洲av免费在线观看| 国产精华一区二区三区| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 大型黄色视频在线免费观看| 天美传媒精品一区二区| 午夜福利成人在线免费观看| 国产精品久久久久久久电影| 国产精品日韩av在线免费观看| 热99re8久久精品国产| 国产精品人妻久久久久久| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久精品欧美日韩精品| 99热这里只有是精品在线观看 | 日韩高清综合在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 久久精品人妻少妇| 狠狠狠狠99中文字幕| 日韩欧美在线二视频| 国产老妇女一区| 亚洲av免费在线观看| 久久久国产成人免费| 中文字幕高清在线视频| 91av网一区二区| 成人午夜高清在线视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 身体一侧抽搐| 极品教师在线免费播放| 欧美高清性xxxxhd video| 又黄又爽又免费观看的视频| 宅男免费午夜| aaaaa片日本免费| 国产成+人综合+亚洲专区| av国产免费在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 高清在线国产一区| ponron亚洲| 俄罗斯特黄特色一大片| 人妻久久中文字幕网| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 一二三四社区在线视频社区8| 国产真实乱freesex| 午夜日韩欧美国产| 草草在线视频免费看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日日夜夜操网爽| 日本五十路高清| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产久久久一区二区三区| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 婷婷丁香在线五月| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 美女xxoo啪啪120秒动态图 | 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲精品456在线播放app | 国产精品久久久久久精品电影| 久久午夜亚洲精品久久| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 精品人妻1区二区| 最近中文字幕高清免费大全6 | 成人精品一区二区免费| av国产免费在线观看| 97热精品久久久久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 男人舔奶头视频| 嫩草影院新地址| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 男人的好看免费观看在线视频| 免费在线观看日本一区| avwww免费| 久久九九热精品免费| 看片在线看免费视频| 亚洲精品日韩av片在线观看| 久久久色成人| 亚洲最大成人中文| 波多野结衣高清作品| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99久久九九国产精品国产免费| 99热只有精品国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 免费在线观看影片大全网站| 岛国在线免费视频观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲无线观看免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 久99久视频精品免费| 欧美激情国产日韩精品一区| 十八禁网站免费在线| 在线看三级毛片| 激情在线观看视频在线高清| 丰满乱子伦码专区| 免费黄网站久久成人精品 | 亚洲一区高清亚洲精品| 国产老妇女一区| 国产成人福利小说| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美又色又爽又黄视频| www.www免费av| 波多野结衣巨乳人妻| 少妇被粗大猛烈的视频| bbb黄色大片| 日韩精品中文字幕看吧| 色综合站精品国产| 国产在视频线在精品| 日韩精品青青久久久久久| 免费高清视频大片| 一区二区三区免费毛片| 婷婷亚洲欧美| 麻豆久久精品国产亚洲av| 少妇被粗大猛烈的视频| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久9热在线精品视频| 色尼玛亚洲综合影院| 免费av观看视频| 身体一侧抽搐| 亚洲自偷自拍三级| 午夜福利在线观看吧| 校园春色视频在线观看| 人人妻人人看人人澡| 一区二区三区高清视频在线| 乱人视频在线观看| 亚洲第一电影网av| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产精品久久久久久久电影| 成人午夜高清在线视频| 99久久99久久久精品蜜桃| www.色视频.com| 亚洲人成电影免费在线| 熟女电影av网| 51午夜福利影视在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产在视频线在精品| 波多野结衣高清无吗| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产精品99久久久久久久久| АⅤ资源中文在线天堂| 高清在线国产一区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 三级毛片av免费| 亚洲专区国产一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| av在线观看视频网站免费| 日韩欧美精品免费久久 | 97热精品久久久久久| 国产精品人妻久久久久久| 香蕉av资源在线| 免费在线观看成人毛片| 一区二区三区高清视频在线| www.www免费av| 91狼人影院| 亚洲精品色激情综合| 一级av片app| 1000部很黄的大片| 欧美激情在线99| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 一区福利在线观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 制服丝袜大香蕉在线| 国内精品久久久久精免费| 成人三级黄色视频| 一级黄片播放器| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲av一区综合| 亚洲在线观看片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| xxxwww97欧美| 中文字幕av成人在线电影| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文资源天堂在线| 欧美一区二区国产精品久久精品| 99久久成人亚洲精品观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 日本一二三区视频观看| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲av第一区精品v没综合| 日日夜夜操网爽| 亚洲综合色惰| 亚洲人成网站在线播| 大型黄色视频在线免费观看| 一本久久中文字幕| 波野结衣二区三区在线| 免费看美女性在线毛片视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久精品影院6| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 又紧又爽又黄一区二区| 嫩草影院入口| 少妇高潮的动态图| 国产伦人伦偷精品视频| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品,欧美在线| 如何舔出高潮| 精品人妻视频免费看| 亚洲成人久久爱视频| 精品不卡国产一区二区三区| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 中文字幕高清在线视频| 免费高清视频大片| 亚洲在线自拍视频| 亚洲精品色激情综合| 内地一区二区视频在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 精品无人区乱码1区二区| 国产一区二区三区视频了| 日本 欧美在线| 内射极品少妇av片p| 色综合亚洲欧美另类图片| 最近在线观看免费完整版| 亚洲人与动物交配视频| 最新在线观看一区二区三区| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久亚洲精品不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 成年版毛片免费区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费人成在线观看视频色| 久久国产乱子免费精品| 真人一进一出gif抽搐免费| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线免费观看的www视频| bbb黄色大片| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 黄色配什么色好看| 国产精品,欧美在线| 国内精品久久久久久久电影| av专区在线播放| av欧美777| 成年免费大片在线观看| 少妇高潮的动态图| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲无线观看免费| 天堂动漫精品| 欧美成人免费av一区二区三区| 精品一区二区三区人妻视频| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲不卡免费看| 国内精品美女久久久久久| 波多野结衣高清作品| 麻豆成人午夜福利视频| 日日夜夜操网爽| 精品人妻视频免费看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产色婷婷99| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美激情在线99| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 真人一进一出gif抽搐免费| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品欧美国产一区二区三| 91在线观看av| 欧美在线一区亚洲| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 色5月婷婷丁香| 久久这里只有精品中国| 久久午夜亚洲精品久久| 国产精品不卡视频一区二区 | 最近最新免费中文字幕在线| 怎么达到女性高潮| 无遮挡黄片免费观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品野战在线观看| 色在线成人网| 国产亚洲av嫩草精品影院| 18+在线观看网站| 黄色女人牲交| 久久久久性生活片| 国产乱人伦免费视频| 成人特级av手机在线观看| 国产av一区在线观看免费| 久久人人精品亚洲av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品久久久久久久久av| 真人做人爱边吃奶动态| 最近视频中文字幕2019在线8| 成人一区二区视频在线观看| 成人特级av手机在线观看| 国产在线男女| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人人妻人人看人人澡| 久久久久久大精品| 91九色精品人成在线观看| 极品教师在线免费播放| 99国产精品一区二区三区| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品一区二区在线观看| 日韩av在线大香蕉| 免费av不卡在线播放| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日本一二三区视频观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲欧美日韩高清专用| 久久热精品热| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产av在哪里看| 两人在一起打扑克的视频| av在线观看视频网站免费| 免费在线观看亚洲国产| 日韩欧美精品v在线| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲欧美日韩无卡精品| 99热这里只有精品一区| 美女黄网站色视频| 日日夜夜操网爽| 欧美性猛交黑人性爽| 中文字幕av在线有码专区| 听说在线观看完整版免费高清| 欧美高清成人免费视频www| 嫩草影院精品99| 午夜日韩欧美国产| 51午夜福利影视在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 男女视频在线观看网站免费| 全区人妻精品视频| 精品人妻熟女av久视频| 日本五十路高清| 成人鲁丝片一二三区免费| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲人成网站在线播| 热99在线观看视频| 亚洲av成人精品一区久久| 波多野结衣高清作品| 99久久精品一区二区三区| 国产三级黄色录像| 日韩欧美在线乱码| 久久6这里有精品| 亚洲经典国产精华液单 | 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 免费在线观看成人毛片| 精品久久久久久久久亚洲 | 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 高清毛片免费观看视频网站| 免费在线观看影片大全网站| 国产成人av教育| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产v大片淫在线免费观看| 一级a爱片免费观看的视频| 午夜福利成人在线免费观看| 国产私拍福利视频在线观看| 国产av麻豆久久久久久久| 黄色视频,在线免费观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲第一区二区三区不卡| 可以在线观看的亚洲视频| av天堂在线播放| 欧美成人免费av一区二区三区| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产精华一区二区三区| 国产乱人视频| 特大巨黑吊av在线直播| 我的女老师完整版在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| a级毛片a级免费在线| 99国产精品一区二区三区| 夜夜爽天天搞| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产成人av教育| 欧美色视频一区免费| av在线蜜桃| x7x7x7水蜜桃| 午夜福利欧美成人| 国产成人a区在线观看| 成年女人永久免费观看视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久亚洲真实| 我的老师免费观看完整版| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品一区av在线观看| 人妻久久中文字幕网| 久久精品国产清高在天天线| 美女被艹到高潮喷水动态| 深爱激情五月婷婷| 一级黄色大片毛片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产野战对白在线观看| 精品久久久久久成人av| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲成av人片在线播放无| 欧美zozozo另类| 日韩中文字幕欧美一区二区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 欧美在线黄色| 国产成人a区在线观看| 最近视频中文字幕2019在线8| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 可以在线观看的亚洲视频| 日韩欧美精品v在线| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 色哟哟·www| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 性色avwww在线观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 精品福利观看| 99在线视频只有这里精品首页| 日本与韩国留学比较| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久人人爽人人爽人人片va | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 久久性视频一级片| 最好的美女福利视频网| 黄色丝袜av网址大全| 精品久久久久久久久av| 又黄又爽又免费观看的视频| 精品欧美国产一区二区三| 午夜福利18| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产三级黄色录像| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 精品人妻视频免费看| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲美女搞黄在线观看 | 在线免费观看的www视频| 99久久精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产单亲对白刺激| 搡老岳熟女国产| 亚洲欧美精品综合久久99| 五月伊人婷婷丁香| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 国产中年淑女户外野战色| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 99热只有精品国产| 亚洲国产精品久久男人天堂| 悠悠久久av| 黄色视频,在线免费观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲av成人av| av专区在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 亚洲人成网站高清观看| 国产成年人精品一区二区| 免费在线观看日本一区| 九色成人免费人妻av| 国产av麻豆久久久久久久| 国产精品日韩av在线免费观看| 中文字幕av在线有码专区| 极品教师在线免费播放| 成人永久免费在线观看视频| 欧美性感艳星| 国产精品亚洲美女久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 两个人视频免费观看高清| 99久久九九国产精品国产免费| 性插视频无遮挡在线免费观看| 麻豆成人av在线观看| 久久久色成人| 少妇丰满av| 美女被艹到高潮喷水动态| 一区二区三区四区激情视频 | 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品免费一区二区三区在线| 色综合婷婷激情| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品人妻1区二区| 中文在线观看免费www的网站| 久久久精品欧美日韩精品| 午夜两性在线视频| 欧美3d第一页| 免费高清视频大片| 亚洲av五月六月丁香网| 国产成人aa在线观看| 99久久精品热视频| 欧美日本视频| 成年人黄色毛片网站| 欧美在线黄色| 99热精品在线国产| 欧美成人a在线观看| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 观看美女的网站| 国产极品精品免费视频能看的| 特大巨黑吊av在线直播| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黄色日韩在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 波多野结衣高清作品| 又黄又爽又免费观看的视频| 三级毛片av免费| 他把我摸到了高潮在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 国产淫片久久久久久久久 | 性欧美人与动物交配| 99热只有精品国产| 又黄又爽又免费观看的视频| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 久久精品国产清高在天天线| 内射极品少妇av片p| 一级作爱视频免费观看| 国产免费av片在线观看野外av| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲五月婷婷丁香| 婷婷色综合大香蕉| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 久久亚洲真实| 日本五十路高清| 成人美女网站在线观看视频| 一区二区三区四区激情视频 | av女优亚洲男人天堂| 午夜影院日韩av| 九色成人免费人妻av| 亚洲在线观看片| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 少妇高潮的动态图| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美日韩黄片免| 久久久久性生活片| 91av网一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 色综合站精品国产| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲最大成人手机在线| 97碰自拍视频| 国产成人欧美在线观看| 草草在线视频免费看| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 亚洲成人久久性|