傳染性法氏囊病病毒新型變異株VP2蛋白原核表達(dá)及免疫效果評(píng)價(jià)

馬景霞 王常偉 吳洪才 何吉鑫 牛曉賽 段志強(qiáng) 朱杰

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.029

摘要：【目的】構(gòu)建傳染性法氏囊病病毒新型變異株（vaIBDV）VP2蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并明確VP2蛋白的免疫原性，為vaIBDV亞單位疫苗的開發(fā)提供技術(shù)支持。【方法】從IBDV新型變異株（BZ）中擴(kuò)增VP2基因片段，亞克隆至pET-28a（+）載體上構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后通過SDS-PAGE和Western blotting進(jìn)行鑒定，并以vaIBDV陽(yáng)性血清進(jìn)行瓊擴(kuò)效價(jià)測(cè)定；經(jīng)Ni-NTA親和層析純化及適當(dāng)濃縮后，制備乳化疫苗并免疫21日齡SPF雞，通過安全性檢驗(yàn)、抗體效價(jià)測(cè)定及攻毒保護(hù)評(píng)價(jià)進(jìn)一步驗(yàn)證融合蛋白VP2的免疫原性?！窘Y(jié)果】在25 ℃下以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得的融合蛋白VP2主要呈可溶性表達(dá)，大小約40 kD，且表達(dá)上清液中的融合蛋白VP2能與vaIBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，其瓊擴(kuò)效價(jià)可達(dá)1∶32；經(jīng)Ni-NTA親和層析純化及適當(dāng)濃縮后，融合蛋白VP2的瓊擴(kuò)效價(jià)高達(dá)1∶256。以融合蛋白VP2為抗原制備的亞單位疫苗穩(wěn)定性好，安全性高，無(wú)免疫引起的不良反應(yīng)，剖檢也未發(fā)現(xiàn)接種部位有明顯損傷、局部炎癥或疫苗吸收不良等現(xiàn)象。免疫21 d后雞血清瓊擴(kuò)效價(jià)平均值達(dá)1∶76.8，而血清抗體效價(jià)均在1∶20000以上，表明以融合蛋白VP2制備的疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，抗體陽(yáng)性率達(dá)100%；使用IBDV BZ株攻毒后7 d剖檢觀察雞法氏囊病變情況，結(jié)果顯示免疫組雞只均未發(fā)病，其法氏囊也無(wú)明顯萎縮現(xiàn)象，即免疫保護(hù)率達(dá)100%?！窘Y(jié)論】通過原核表達(dá)系統(tǒng)能成功實(shí)現(xiàn)vaIBDV VP2蛋白的可溶性表達(dá)，且獲得的融合蛋白VP2免疫原性良好，能對(duì)vaIBDV提供100%的免疫保護(hù)效果，為開發(fā)vaIBDV亞單位疫苗提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：傳染性法氏囊病病毒（IBDV）；新型變異株；VP2蛋白；亞單位疫苗；免疫效果

中圖分類號(hào)：S852.659.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1876-08

Prokaryotic expression and immune effect evaluation of VP2 protein of a novel variant infectious bursal disease virus strain

MA Jing-xia1， WANG Chang-wei2， WU Hong-cai2， HE Ji-xin2， NIU Xiao-sai2，

DUAN Zhi-qiang3， ZHU Jie2

（1Binzhou Argo-tech Extension Center，Binzhou，Shandong? 256600，China； 2Shandong Binzhou Wohua Biological

Engineering Co.，Ltd.，Binzhou，Shandong? 256600，China； 3College of Animal Sciences， Guizhou University，

Guiyang，Guizhou? 550025，China）

Abstract：【Objective】This paper constructed the prokaryotic expression plasmid of VP2 protein of a novel variant of infectious bursal disease virus （vaIBDV）， and clarified the immunogenicity of VP2 protein， so as to provide technical support for the development of vaIBDV subunit vaccine. 【Method】The VP2 gene fragment was amplified from vaIBDV isolate （BZ strain） and cloned into vector pET-28a（+） to recombine prokaryotic expression plasmid， then transformed into the Escherichia coli BL21（DE3） competent cell， and induced by IPTG. The expressed products were identified by SDS-PAGE and Western blotting， and the titer was determined by vaIBDV-positive serum through agar-gel precipitation （AGP）. After purification by Ni-NTA affinity chromatography and proper concentration， the emulsified vaccine was prepared and used to immunize 21-day-old SPF chickens. The immunogenicity of the fusion protein VP2 was further verified by safety test， antibody titer determination and immune challenge experiment. 【Result】The fusion protein VP2 was mainly expressed in soluble form at 25 ℃ induced by IPTG， and the size was about 40 kD. The fusion protein VP2 in the expression supernatant could specifically react with vaIBDV positive serum， and its agar diffusion titer could reach 1∶32. After purification by Ni-NTA affinity chromatography and appropriate concentration， the agar diffusion titer of the fusion protein VP2 was as high as 1∶256. The subunit vaccine prepared with the fusion protein VP2 as the antigen had good stability， high safety， and no adverse reactions caused by immunization. No obvious damage， local inflammation， and poor vaccine absorption were found at the inoculation site. After 21 d of immunization， the average agar diffusion titer of chi-cken serum was 1∶76.8， and the serum antibody titer was above 1∶20000， indicating that the vaccine prepared with the fusion protein VP2 could stimulate the body to produce a strong humoral immune response， and the antibody positive rate was 100%. The pathological changes of bursa of Fabricius in chickens were observed 7 d after challenging with IBDV BZ strain. The results showed that none of the chickens in the immunized group had disease， and there was no obvious atrophy of bursa of Fabricius， which meant that the immune protection rate was 100%. 【Conclusion】The soluble expression of vaIBDV VP2 protein is successfully achieved by prokaryotic expression system， and the obtained fusion protein VP2 has good immunogenicity and can provide 100% immune protection against vaIBDV， which provides technical support for the development of vaIBDV subunit vaccine.

Key words： infectious bursal disease virus（IBDV）； novel variant strain； VP2 protein； subunit vaccine； immune effect

Foundation items： National Natural Science Foundation of China （31960698）； Binzhou Wohua Biological Fund （［WH］201901QB01-02）

0 引言

【研究意義】傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是一種全球范圍內(nèi)廣泛流行且主要危害青年雞群的免疫抑制性疾病，其病原是傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）（王占偉等，2012；梅永杰等，2016）。IBDV可分為I型和II型2個(gè)血清型，但只有血清I型對(duì)雞有致病性。在過去長(zhǎng)時(shí)間的流行過程中，血清I型IBDV發(fā)生過2次較大的變異，先后出現(xiàn)了經(jīng)典毒株（cIBDV）、變異株（vIBDV）和超強(qiáng)毒株（vvIBDV）（范林進(jìn)等，2019；王雨龍，2021）。自2017年以來，不同于早期vIBDV的新型變異株（vaIBDV）在我國(guó)呈現(xiàn)流行趨勢(shì)，感染雞群雖然眼觀無(wú)明顯的臨床癥狀，但其生產(chǎn)性能下降，剖檢可見法氏囊嚴(yán)重萎縮，給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來新的挑戰(zhàn)（嚴(yán)專強(qiáng)等，2020；程小果等，2022）。值得注意的是，感染vaIBDV的雞群均免疫過vvIBDV疫苗，說明在實(shí)際生產(chǎn)中針對(duì)vvIBDV開發(fā)的商品疫苗并不能對(duì)vaIBDV產(chǎn)生免疫作用（崔平等，2020）。vaIBDV具備一定的免疫逃逸能力，且會(huì)引起嚴(yán)重免疫抑制，影響雞群的整體免疫效果（Fan et al.，2020；Xu et al.，2020）。因此，研發(fā)針對(duì)vaIBDV的疫苗對(duì)科學(xué)防控IBD暴發(fā)流行具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，疫苗接種仍是防控IBD暴發(fā)流行最主要的措施，使用的疫苗主要有傳統(tǒng)減毒活疫苗、滅活疫苗及新型疫苗（Witter and Hunt，1994；楊宵玥等，2018）。免疫活疫苗可誘導(dǎo)雞群在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生主動(dòng)免疫，但免疫效果易受母源抗體的干擾，甚至導(dǎo)致免疫失?。↗ackwood，2017）。此外，一些商品化IBDV活疫苗毒力偏強(qiáng)，不僅有可能引起免疫抑制，還存在毒力返強(qiáng)和散毒等生物安全風(fēng)險(xiǎn)（Müller et al.，2012）。滅活疫苗相對(duì)來說安全性更高，但其免疫效果略低，需要多次加強(qiáng)免疫，因而增加了免疫成本（朱思思和李永紅，2019）。目前，絕大多數(shù)傳統(tǒng)疫苗都是基于cIBDV或vvIBDV研制，未能對(duì)vIBDV或vaIBDV提供可靠的免疫保護(hù)作用（Yang and Ye，2020），已商品化的新型疫苗主要有亞單位疫苗及病毒載體疫苗。IBDV基因組由A和B片段組成，共編碼5種蛋白，分別是VP1、VP2、VP3、VP4和VP5（李賽賽等，2017；Sahithi et al.，2019），其中，VP2蛋白是病毒核衣殼的主要組成部分，占病毒總蛋白的51%，也是主要的宿主保護(hù)性抗原（范林進(jìn)，2020；秦穎，2021）。VP2至少包含2～3個(gè)與宿主保護(hù)相關(guān)的中和表位，通過刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體而免受病毒侵害（Li et al.，2020）。至今，針對(duì)IBDV的亞單位疫苗均以VP2為主要疫苗抗原，而禽痘病毒、禽腺病毒、新城疫病毒和火雞皰疹病毒常被用作基因工程病毒載體以表達(dá)VP2蛋白，該策略獲得的VP2蛋白重組病毒活載體疫苗在免疫后不會(huì)導(dǎo)致法氏囊損傷，從而避免活疫苗免疫可能導(dǎo)致的免疫抑制（Huang et al.，2004；Zhou et al.，2010；Kurukulasuriya et al.，2017）。國(guó)外已有多種商業(yè)化表達(dá)IBDV VP2蛋白的活載體疫苗上市，在國(guó)內(nèi)市面上相關(guān)載體活疫苗主要是雞傳染性法氏病病毒火雞皰疹病毒載體活疫苗（vHVT-013-69株）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在vvIBDV的防控過程中，以VP2蛋白為抗原的亞單位疫苗取得了理想防控效果，但以vvIBDV為基礎(chǔ)開發(fā)的亞單位疫苗已無(wú)法控制vaIBDV的感染，因此亟待以新出現(xiàn)的vaIBDV為防控目標(biāo)研發(fā)新的亞單位疫苗?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以山東濱州沃華生物工程有限公司2019年分離獲得的IBDV新型變異株（BZ）為研究對(duì)象，構(gòu)建其VP2蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒并利用大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以期獲得針對(duì)vaIBDV的保護(hù)性抗原，為vaIBDV亞單位疫苗的開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

IBDV BZ株由山東濱州沃華生物工程有限公司分離并保存（崔平等，2020）；21日齡SPF雞由山東濱州沃華生物工程有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；pET-28a（+）載體購(gòu)自Novagen公司；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞及HRP標(biāo)記兔抗雞IgG購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸提取試劑盒（EasyPure Viral DNA/RNA Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及Phanta? Max Super-Fidelity DNA聚合酶購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；2×Easy Taq PCR Super Mix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Ni-NTA親和層析介質(zhì)購(gòu)自南京金斯瑞生物科技有限公司；BeyoColor?彩色預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；IBDV VP2蛋白ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自百沃特（天津）生物技術(shù)有限公司；vaIBDV瓊擴(kuò)抗原購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸藥評(píng)審中心）；雞vaIBDV陽(yáng)性血清由山東濱州沃華生物工程有限公司自制。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已公布的IBDV A節(jié)段基因序列（NC_004178.1），設(shè)計(jì)VP2基因特異性擴(kuò)增引物（VP2-F：5'-CGAGGATCCTAAATGACAAACCTGCA AGATC-3'；VP2-R：5'-AGCACTCGAGCCTTATGGC CCGGATTATG-3'）（下劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 核酸提取及VP2基因PCR擴(kuò)增

按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit說明提取IBDV BZ株組織RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后使用Phanta? Max Super-Fidelity DNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系30.0 μL：2×Phanta Max Buffer 15.0 μL，Phanta? Max Super-Fidelity DNA聚合酶0.6 μL，cDNA模板2.0 μL，dNTP Mix（10 mmol/L） 0.6 μL，上、下游引物各1.2 μL，ddH2O 9.4 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，使用膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收。

1. 4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建與鑒定

使用BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶對(duì)VP2基因片段和pET-28a（+）載體進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后以T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取5個(gè)單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，陽(yáng)性菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序正確的菌液適量擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙酶切鑒定，陽(yáng)性重組原核表達(dá)質(zhì)粒命名為pET-28a-VP2。以重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落接種于含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，即獲得表達(dá)質(zhì)粒菌液。

1. 5 融合蛋白VP2誘導(dǎo)表達(dá)與鑒定

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的新鮮菌液按1∶100比例接種至LB液體培養(yǎng)基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃下220 r/min振蕩培養(yǎng)2～3 h，至菌液OD600 nm達(dá)0.4～0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在25 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)過夜后離心收集菌體。用1∶10體積的PBS重懸菌體，高壓破碎后4 ℃下10000 r/min離心10 min，收集上清液，沉淀用等體積的PBS重懸。取上清液、沉淀懸浮液與5×蛋白上樣緩沖液按4∶1比例混勻，金屬浴100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫后進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)和Western blotting鑒定，并以vaIBDV陽(yáng)性血清測(cè)定上清液中的蛋白瓊擴(kuò)效價(jià)。

1. 6 融合蛋白VP2純化及疫苗制備

使用Ni-NTA親和層析對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)上清液進(jìn)行純化，并用PEG-6000進(jìn)行適當(dāng)濃縮。純化濃縮產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)后，以vaIBDV陽(yáng)性血清測(cè)定其瓊擴(kuò)效價(jià)。用PBS將融合蛋白VP2原液進(jìn)行1∶8稀釋作為水相，加入適量Tween-80；將Marcol 52白油、Span-80和硬脂酸鋁按照合適比例混勻，高壓滅菌后作為油相。按水相∶油相=1∶3（v/v）進(jìn)行乳化，根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2005年版）對(duì)配制的疫苗進(jìn)行劑型、穩(wěn)定性及無(wú)菌檢驗(yàn)。

1. 7 融合蛋白VP2安全性檢驗(yàn)

取10羽21日齡SPF雞，于頸部皮下注射制備的疫苗（1.0 mL/羽），同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（5羽21日齡SPF雞），注射后連續(xù)觀察14 d，檢驗(yàn)是否存在因疫苗注射引起任何局部或全身不良反應(yīng)。

1. 8 融合蛋白VP2免疫效果評(píng)價(jià)

選擇20羽21日齡SPF雞隨機(jī)分成3組，其中，免疫組10羽（頸部皮下注射制備的疫苗，注射劑量為0.3 mL/羽），攻毒對(duì)照組5羽，空白對(duì)照組5羽。于免疫后21 d翅下靜脈采血并分離血清，以純化的融合蛋白VP2為抗原測(cè)定血清瓊擴(kuò)效價(jià)，同時(shí)以ELISA抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清抗體效價(jià)。使用IBDV BZ株對(duì)SPF雞進(jìn)行點(diǎn)眼和口服攻毒，攻毒劑量為101.5 EID50，連續(xù)觀察7 d后進(jìn)行剖檢，觀察法氏囊有無(wú)病變。

2 結(jié)果與分析

2. 1 VP2基因擴(kuò)增結(jié)果

以IBDV BZ株的cDNA為模板對(duì)VP2基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可觀察到1380 bp大小的目的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

2. 2 重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2構(gòu)建及鑒定結(jié)果

使用BamH I和Xho I限制性內(nèi)切酶對(duì)重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2進(jìn)行酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，重組原核表達(dá)質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物分別獲得1365 bp的VP2基因條帶和5300 bp左右的載體條帶，且測(cè)序結(jié)果顯示無(wú)堿基突變，表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2構(gòu)建成功。

2. 3 融合蛋白VP2表達(dá)與鑒定結(jié)果

通過SDS-PAGE對(duì)融合蛋白VP2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3-A）發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白VP2主要存在于上清液中，即呈可溶性表達(dá)，蛋白大小約40 kD，與預(yù)期結(jié)果相符。Western blotting鑒定結(jié)果（圖3-B）顯示，上清液中的融合蛋白VP2能與vaIBDV陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，其瓊擴(kuò)效價(jià)可達(dá)1∶32?？梢?，構(gòu)建的重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-VP2通過BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞能成功表達(dá)出VP2蛋白，且表達(dá)獲得的融合蛋白VP2具有良好反應(yīng)原性。

2. 4 融合蛋白VP2純化與疫苗制備情況

2. 4. 1 融合蛋白VP2純化效果 通過Ni-NTA親和層析純化上清液中的融合蛋白VP2并進(jìn)行適當(dāng)濃縮，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)及瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)鑒定其純化效果。結(jié)果如圖4所示，融合蛋白VP2純化洗脫液在預(yù)期的位置獲得單一條帶，純化效果較好，純化濃縮后的融合蛋白VP2瓊擴(kuò)效價(jià)高達(dá)1∶256。

2. 4. 2 疫苗制備情況 根據(jù)《中華人民共和國(guó)獸藥典》（2005年版）對(duì)配制的疫苗進(jìn)行劑型、穩(wěn)定性及無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，制備獲得的疫苗呈典型油包水型，少量疫苗滴入（除第1滴外）冷水中后無(wú)擴(kuò)散現(xiàn)象；10 mL的疫苗經(jīng)3000 r/min離心15 min，管底未見水相析出；無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果顯示疫苗無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，均符合相關(guān)規(guī)定。

2. 5 VP2蛋白亞單位疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果

疫苗安全性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，接種疫苗后所有雞只的精神狀態(tài)、采食及飲水均未見異常，接種部位無(wú)紅腫反應(yīng)，且剖檢也未發(fā)現(xiàn)接種部位有明顯損傷、局部炎癥或疫苗吸收不良等現(xiàn)象（圖5）。

2. 6 VP2蛋白亞單位疫苗的免疫保護(hù)效果評(píng)價(jià)

免疫后21 d采集雞血清，分別使用vaIBDV瓊擴(kuò)抗原和ELISA抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清瓊擴(kuò)效價(jià)及抗體效價(jià)，結(jié)果顯示，雞血清瓊擴(kuò)效價(jià)平均值達(dá)1∶76.8，而血清抗體效價(jià)均在1∶20000以上，表明誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白VP2具有良好免疫原性，免疫后可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，抗體陽(yáng)性率達(dá)100%。使用IBDV BZ株攻毒后7 d，剖檢雞只并觀察其法氏囊病變情況，結(jié)果顯示，攻毒對(duì)照組雞只發(fā)病率為100%，其法氏囊出現(xiàn)萎縮的典型病變（圖6）；免疫組雞只均未發(fā)病，其法氏囊也無(wú)明顯萎縮現(xiàn)象，即免疫保護(hù)率達(dá)100%。

[圖 6 IBDV BZ株攻毒7 d后雞法氏囊剖檢結(jié)果

Fig.6 Results of autopsy on bursa of Fabriciusof chicken IBDV BZ strain after 7 d of challenge]<G：＼2023.6＼馬景霞6.jpg>[免疫組

Immune group][攻毒對(duì)照組

Challenge control group][空白對(duì)照組

Blank control group]

3 討論

自20世紀(jì)90年代以來，vvIBDV的流行給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失，雖然隨著疫苗的普遍使用及生物安全意識(shí)和飼養(yǎng)管理水平的提高，vvIBDV逐漸得到控制，但vaIBDV仍在雞群中廣泛流行（Li et al.，2015；Fan et al.，2020；Xu et al.，2020）。vaIBDV不會(huì)造成明顯的臨床癥狀或死亡率升高，但能導(dǎo)致法氏囊在短時(shí)間內(nèi)萎縮，引起嚴(yán)重的免疫抑制而影響疫苗免疫效果（崔平等，2020；王雨龍，2021）。此外，多項(xiàng)研究數(shù)據(jù)表明，現(xiàn)有的商品化疫苗已不能對(duì)vaIBDV提供100%的保護(hù)效果（崔平等，2020；Fan et al.，2020）?？梢?，vaIBDV的出現(xiàn)給當(dāng)前家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來極大挑戰(zhàn)，因此亟待研發(fā)針對(duì)vaIBDV的疫苗。

VP2蛋白是IBDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的保護(hù)性抗原。VP2蛋白的第206～350位氨基酸區(qū)域變異較頻繁，被稱為IBDV高變區(qū)，與病毒毒力及中和抗體表位等密切相關(guān)（秦穎，2021）。本研究中，IBDV BZ株包含有vIBDV的特征性氨基酸位點(diǎn)（222T、249K、286I和318D），也具有vaIBDV的獨(dú)特氨基酸位點(diǎn)（221K、252I和299S），當(dāng)前的IBD疫苗已不能對(duì)IBDV BZ株提供有效的免疫保護(hù)（崔平等，2020）。范林進(jìn)（2020）也研究證實(shí)，VP2蛋白是IBDV毒力和抗原變異的重要決定因素，各關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異均會(huì)對(duì)病毒毒力、中和抗體活性及免疫逃逸能力造成一定影響。由于VP2高變區(qū)與抗體中和活性及病毒毒力密切相關(guān)，導(dǎo)致vaIBDV與vvIBDV的抗原差異明顯，也進(jìn)一步佐證VP2蛋白是最優(yōu)的IBDV基因工程亞單位疫苗抗原靶點(diǎn)（洪家兵等，2020；王彥偉等，2020；肖倩等，2022；張文英等，2022）。因此，根據(jù)VP2蛋白開發(fā)針對(duì)vaIBDV的亞單位疫苗具有可行性。

亞單位疫苗是將病原體中具有免疫原性的蛋白在體外通過合適的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，再利用純化蛋白作為免疫原進(jìn)行免疫，以誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體而達(dá)到保護(hù)的目的（譚偉等，2014；汪夢(mèng)竹等，2022）。本研究通過大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出vaIBDV的VP2蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析純化獲得高純度的融合蛋白VP2。融合蛋白VP2主要呈可溶性表達(dá)，為后續(xù)的處理及規(guī)?；a(chǎn)提供了便利條件。但Ni-NTA親和層析純化技術(shù)操作復(fù)雜且成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)，如后續(xù)應(yīng)用到生產(chǎn)中宜采用飽和硫酸銨鹽析進(jìn)行蛋白純化。本研究結(jié)果表明，通過原核表達(dá)獲得的融合蛋白VP2在未經(jīng)純化處理前（誘導(dǎo)表達(dá)上清液）的瓊擴(kuò)效價(jià)為1∶32，經(jīng)純化及濃縮后瓊擴(kuò)效價(jià)高達(dá)1∶256。高效率的可溶性表達(dá)能顯著提高蛋白產(chǎn)量，同時(shí)有效降低生產(chǎn)成本，因此在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用過程中還需進(jìn)一步優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件及蛋白后期處理工藝。

在免疫效果評(píng)價(jià)中，以融合蛋白VP2配制的疫苗可刺激機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的體液免疫反應(yīng)，抗體水平較高，也反映了該蛋白具備良好的免疫原性；在攻毒保護(hù)試驗(yàn)中，VP2蛋白亞單位疫苗能為免疫雞只提供100%的免疫保護(hù)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的雞新城疫—禽流感（H9亞型）—雞傳染性法氏囊病三聯(lián)滅活疫苗在免疫后21 d對(duì)包括BZ株在內(nèi)的5株vaIBDV的免疫保護(hù)率僅為50%～80%，對(duì)BC6/85株（vvIBDV）則可以提供100%的免疫保護(hù)。隨著vaIBDV的暴發(fā)流行，國(guó)內(nèi)各地分離獲得的IBDV毒株也逐漸增多，針對(duì)vaIBDV疫苗開發(fā)的研究也日益增多。榮俊等（2020）利用IBDV FJ-1812株構(gòu)建了能表達(dá)VP2蛋白的表達(dá)載體及工程菌，誘導(dǎo)表達(dá)獲得的VP2蛋白能對(duì)IBDVFJ-1812株提供完全保護(hù)，而vvIBDV基因工程亞單位疫苗對(duì)IBDV FJ-1812株的攻毒只提供部分保護(hù)。此外，由于原核表達(dá)體外表達(dá)技術(shù)對(duì)于蛋白結(jié)構(gòu)的修飾程度較弱，很難保證蛋白的天然構(gòu)象，而可能對(duì)蛋白的免疫原性造成不利影響（汪夢(mèng)竹等，2022）。已有研究證實(shí)，在VP2蛋白表達(dá)盒N端添加構(gòu)象原件模擬IBDV VP3蛋白C末端與VP2蛋白互作，有利于VP2蛋白正確構(gòu)象的形成，從而提高其免疫原性（Saugar et al.，2005；張文英等，2022）。因此，今后應(yīng)在本研究基礎(chǔ)之上進(jìn)一步優(yōu)化VP2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)條件，以期將免疫原性更強(qiáng)、保護(hù)效果最佳的VP2蛋白應(yīng)用到vaIBDV疫苗研發(fā)中，為有效防控IBD暴發(fā)流行及保障家禽養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展提供技術(shù)保障。

4 結(jié)論

通過原核表達(dá)系統(tǒng)能成功實(shí)現(xiàn)vaIBDV VP2蛋白的可溶性表達(dá)，且獲得的融合蛋白VP2免疫原性良好，能對(duì)vaIBDV提供100%的免疫保護(hù)效果，為開發(fā)vaIBDV亞單位疫苗提供了技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)：

程小果，程寧，王慧. 2022. 雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的流行現(xiàn)狀及綜合防控［J］. 上海畜牧獸醫(yī)通訊，（3）：56-58. ［Cheng X G，Cheng N，Wang H. 2022. Current status of the epidemic of a new variant of infectious bursal disease virus in chickens and comprehensive prevention and control［J］. Shanghai Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，（3）：56-58.］ doi：10.14170/j.cnki.cn31-1278/s.2022.03.003.

崔平，牛曉賽，董新榮，李軍朝，楊靈芝，朱杰. 2020. 蛋雞源傳染性法氏囊病病毒變異株的分離、鑒定及攻毒保護(hù)試驗(yàn)［J］. 中國(guó)家禽，42（9）：35-39. ［Cui P，Niu X S，Dong X R，Li J Z，Yang L Z，Zhu J. 2020. Isolation，identification and immune challenge experiment of infectious bursal disease virus variant strains isolated from laying hens［J］. China Poultry，42（9）：35-39.］ doi：10.16372/j.issn.1004-6364.2020.09.006.

范林進(jìn)，王雨龍，吳甜甜，李凱，姜楠，高玉龍，高立，劉長(zhǎng)軍，崔紅玉，潘青，張艷萍，劉玉鳳，孫先本，劉俊啟，王笑梅，祁小樂. 2019. 我國(guó)傳染性法氏囊病病毒新型變異株分析研究［J］. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，41（11）：1164-1169. ［Fan L J，Wang Y L，Wu T T，Li K，Jiang N，Gao Y L，Gao L，Liu C J，Cui H Y，Pan Q，Zhang Y P，Liu Y F，Sun X B，Liu J Q，Wang X M，Qi X L. 2019. The prevalence of novel variant strains of infectious bursal disease virus in China［J］. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，41（11）：1164-1169.］doi：10.3969/j.issn. 1008-0589.201907028.

范林進(jìn). 2020. 雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株的鑒定及疫苗株構(gòu)建［D］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. ［Fan L J. 2020. Identification and vaccine strain construction of the novel variant infectious bursal disease virus［D］. Beijing：Chinese Academy of Agricultural Sciences.］ doi：10.27630/d.cnki.gznky.2020.000327.

洪家兵，王萍，王曉玥，于非可，劉文曉，李永清. 2020. 雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白在昆蟲細(xì)胞—桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)及免疫原性分析［J］. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，56（12）：14-17. ［Hong J B，Wang P，Wang X Y，Yu F K，Liu X W，Li Y Q. 2020. Secreted expression and immunogenicity analysis of VP2 protein of infectious bursal disease virus in baculovirus expression system［J］.Chinese Journal of Veterinary Medicine，56（12）：14-17.］

李賽賽，郭玉堃，舒靜超，曾磊，郭婉瑩，郭豫杰. 2017. 雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白可溶性原核表達(dá)及免疫原性分析［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，37（12）：2281-2287. ［Li S S，Guo Y K，Shu J C，Zeng L，Guo W Y，Guo Y J. 2017. Proka-ryotic expression and immunogenicity analysis of the VP2 protein of infectious bursal disease virus［J］. Chinese Journal of Veterinary Science，37（12）：2281-2287.］ doi：10. 16303/j.cnki.1005-4545.2017.12.07.

梅永杰，王永山，歐陽(yáng)偉，潘群興，孟凱，王曉麗，夏興霞，諸玉梅，董晨紅，畢振威，王晶宇，吳紅玲，姚火春. 2016. 華東地區(qū)傳染性法氏囊病病毒流行株的分離及其生物學(xué)特性分析［J］. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，46（5）：550-557. ［Mei Y J，Wang Y S，Ouyang W，Pan Q X，Meng K，Wang X L，Xia X X，Zhu Y M，Dong C H，Bi Z W，Wang J Y，Wu H L，Yao H C. 2016. Isolation and characterization of biological properties of infectious bursal disease viruses from eastern China in recent years［J］. Chinese Veterinary Science，46（5）：550-557.］ doi：10.16656/j.issn.1673-4696. 2016.05.003.

秦穎. 2021. 傳染性法氏囊病病毒變異株分離鑒定及不同系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白免疫原性分析［D］. 揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué). ［Qin Y. 2021. Identification of infectious bursal disease virus variant strain and immunogenicity analysis of VP2 protein expressed in different expression systems［D］. Yangzhou：Yangzhou University.］ doi：10.27441/d.cnki.gyzdu.2021.002242.

榮俊，匡紅艷，李國(guó)攀，楚電峰，蔡聯(lián)燊，徐保娟. 2020. 用于預(yù)防雞傳染性法氏囊病毒新變異株的基因工程亞單位疫苗及其制備方法：CN110664999A［P］. 2020-01-10. ［Rong J，Kuang H Y，Li G P，Chu D F，Cai L S，Xu B J. 2020. Genetically engineered subunit vaccine for the prevention of a new mutant strain of infectious bursal virus in chickens and its preparation method：CN110664999A［P］. 2020-01-10.］

譚偉，謝麗基，謝芝勛. 2014. 禽流感病毒疫苗研究進(jìn)展［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（8）：1492-1497. ［Tan W，Xie L J，Xie Z X. 2014. Research updates of vaccines against avian influenza virus［J］. Journal of Southern Agriculture，45（8）：1492-1497.］ doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2014.8.1492.

汪夢(mèng)竹，蒲飛洋，趙澤陽(yáng)，馮茜莉，李易聰，王慧慧，馬忠仁，李倬. 2022. 新型疫苗的研究進(jìn)展［J］. 畜牧與獸醫(yī)，54（9）：141-147. ［Wang M Z，Pu F Y，Zhao Z Y，F(xiàn)eng X L，Li Y C，Wang H H，Ma Z R，Li Z. 2022. Advances in deve-lopment of novel types of vaccines［J］. Animal Husban-dry & Veterinary Medicine，54（9）：141-147.］

王彥偉，張素玲，吳芃，耿笑林，黃玉欣，李鵬昊，王孟月，李向東，逄文強(qiáng)，田克恭. 2020. 雞傳染性法氏囊病病毒rVP2蛋白高效組裝亞病毒顆粒的鑒定［J］. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，47（6）：1677-1684. ［Wang Y W，Zhang S L，Wu P，Geng X L，Huang Y X，Li P H，Wang M Y，Li X D，Pang W Q，Tian K G. 2020.Identification of subviral particles efficiently self-assemdled by infectious bursal disease virus rVP2 protein［J］. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，47（6）：1677-1684.］ doi：10.16431/j.cnki.1671-7236.2020.06.005.

王雨龍. 2021. 雞傳染性法氏囊病病毒的基因分型及新型變異株亞單位疫苗的研究［M］. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院. ［Wang Y L. 2021. An improved scheme for infectious bursal disease virus genotype classification and development of a subunit candidate vaccine against novel variant infectious bursal disease virus［M］. Beijing：Chinese Aca-demy of Agricultural Sciences.］ doi：10.27630/d.cnki.gznky. 2021.000217.

王占偉，邵國(guó)青，劉茂軍，馮志新，王麗，高云飛，周開華，尹秀鳳. 2012. 雞傳染性法氏囊病病毒抗血清的研制［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，43（12）：2079-2082. ［Wang Z W，Shao G Q，Liu M J，F(xiàn)eng Z X，Wang L，Gao Y F，Zhou K H，Yin X F. 2012. Antiserum development for chicken infectiousbursal disease virus［J］. Journal of Southern Agriculture，43（12）：2079-2082.］ doi：10.3969/j：issn.2095-1191.2012. 12.2079.

肖倩，黃秀英，丁莉，左榕琳，李成山，邢剛. 2022. 雞傳染性法氏囊病病毒VP2蛋白的可溶性表達(dá)及其免疫原性研究［J］. 中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，30（4）：156-162. ［Xiao Q，Huang X Y，Ding L，Zuo R L，Li C S，Xing G. 2022. So-luble expression and immunogenicity analysis of VP2 protein of infectious bursal disease virus［J］. Chinese Journal of Animal Infectious Diseases，30（4）：156-162.］ doi：10.19958/j.cnki.cn31-2031/s.2022.04.019.

嚴(yán)專強(qiáng)，尹麗娟，劉琳琳，楊德鴻，梁曉穎，魏曉娜，黃建飛，周慶豐. 2020. 雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的分離鑒定［J］. 家禽科學(xué)，（7）：50-52. ［Yan Z Q，Yin L J，Liu L L，Yang H D，Liang X Y，Wei X N，Huang J F，Zhou Q F. 2020. Isolation and identification of a novel mutant strain of infectious bursal virus in chickens［J］. Poultry Science，（7）：50-52.］ doi：10.3969/j.issn.1673-1085.2020. 07.019.

楊宵玥，陳玲，宋亞芬，蔣桃珍. 2018. 雞傳染性法氏囊病新型疫苗的研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)獸藥雜志，52（5）：79-85. ［Yang X Y，Chen L，Song Y F，Jiang T Z. 2018. Advances in new vaccine researches of the infectious bursal disease［J］. Chinese Journal of Veterinary Drug，52（5）：79-85.］ doi：10.11751/ISSN.1002-1280.2018.05.12.

張文英，姜楠，王雨龍，馬廣斌，牛鑫鑫，黃萌萌，王國(guó)棟，宋桂才，李凱琳，劉愛晶，王素艷，高立，崔紅玉，劉長(zhǎng)軍，李凱，潘青，張艷萍，王笑梅，高玉龍，祁小樂. 2022. 雞傳染性法氏囊病病毒新型變異株衣殼蛋白重組真核表達(dá)質(zhì)粒的免疫原性分析［J］. 中國(guó)家禽，44（6）：31-35. ［Zhang W Y，Jiang N，Wang Y L，Ma G B，Niu X X，Huang M M，Wang G D，Song G C，Li K L，Liu A J，Wang S Y，Gao L，Cui H Y，Liu C J，Li K，Pan Q，Zhang Y P，Wang X M，Gao Y L，Qi X L. 2022. Immunogenicity analysis on recombinant eukaryotic expression plasmid expressing capsid protein of novel variant strain of infectious bursal disease virus［J］. China Poultry，44（6）：31-35.］ doi：10. 16372/j.issn.1004-6364.2022.06.006.

朱思思，李永紅. 2019. 雞傳染性法氏囊病病毒及疫苗的研究進(jìn)展［J］. 廣東畜牧獸醫(yī)科技，44（3）：9-13. ［Zhu S S，Li Y H. 2019. Research progress of infectious bursal disease virus and vaccine in chicken［J］. Guangdong Journal of Animal and Veterinary Science，44（3）：9-13.］ doi：10.3969/j.issn.1005-8567.2019.03.003.

Fan L J，Wu T T，Wang Y L，Hussain A，Jiang N，Gao L，Li K，Gao Y L，Liu C J，Cui H Y，Pan Q，Zhang Y P，Wang X M，Qi X L. 2020. Novel variants of infectious bursal disease virus can severely damage the bursa of fabricius of immunized chickens［J］. Veterinary Microbiology，240：108507. doi：10.1016/j.vetmic.2019.108507.

Huang Z，Elankumaran S，Yunus A S，Samal S K. 2004. A recombinant Newcastle disease virus （NDV） expressing VP2 protein of infectious bursal disease virus （IBDV） protects against NDV and IBDV［J］. Journal of Virology，78（18）：10054-10063. doi：10.1128/JVI.78.18.10054-10063. 2004.

Jackwood D J. 2017. Advances in vaccine research against eco-nomically important viral diseases of food animals：Infectious bursal disease virus［J］. Veterinary Microbiology，206：121-125. doi：10.1016/j.vetmic.2016.11.022.

Kurukulasuriya S，Ahmed K A，Ojkic D，Gunawardana T，Goonewardene K，Gupta A，Chow-Lockerbie B，Popo-wich S，Willson P，Tikoo S K，Gomis S. 2017. Modified live infectious bursal disease virus （IBDV） vaccine delays infection of neonatal broiler chickens with variant IBDV compared to turkey herpesvirus （HVT）-IBDV vectored vaccine［J］. Vaccine，35（6）：882-888. doi：10.1016/j.vaccine. 2017.01.005.

Li G P，Kuang H Y，Guo H X，Cai L S，Chu D F，Wang X，Hu J X，Rong J. 2020. Development of a recombinant VP2 vaccine for the prevention of novel variant strains of infectious bursal disease virus［J］. Avian Pathology，49（6）：557-571. doi：10.1080/03079457.2020.1791314.

Li K，Courtillon C，Guionie O，Allée C，Amelot M，Qi X L，Gao Y L，Wang X M，Eterradossi N. 2015. Genetic，antigenic and pathogenic characterization of four infectious bursal disease virus isolates from China suggests continued evolution of very virulent viruses［J］. Infection，Genetics and Evolution，30：120-127. doi：10.1016/j.meegid.2014. 12.016.

Müller H，Mundt E，Eterradossi N，Islam M R. 2012. Current status of vaccinesagainst infectious bursal disease［J］. Avian Pathology，41（2）：133-139. doi：10.1080/03079457. 2012. 661403.

Sahithi K D，Nancy P A，Vardhan G P V，Kumanan K，Vijayarani K，Hema M. 2019. Detection of infectious bursal di-sease virus （IBDV） antibodies using chimeric plant virus like particles［J］. Veterinary Microbiology，229：20-27. doi：10.1016/j.vetmic.2018.12.008.

Saugar I，Luque D，O?a A，Rodríguez J F，Carrascosa J L，Trus B L，Castón J R. 2005. Structural polymorphism of the major capsid protein of a double-stranded RNA virus：An amphipathic alpha helix as a molecular switch［J］. Structure，13（7）：1007-1017. doi：10.1016/j.str.2005.04. 012.

Witter R L，Hunt H D. 1994. Poultry vaccines of the future［J］. Poultry Science，73（7）：1087-1093. doi：10.3382/ps. 0731087.

Xu A H，Pei Y，Zhang K R，Xue J，Ruan S F，Zhang G Z. 2020. Phylogenetic analyses and pathogenicity of a variant infectious bursal disease virus strain isolated in China［J］. Virus Research，276：197833. doi：10.1016/j.virusres. 2019.197833.

Yang H，Ye C J. 2020. Reverse genetics approaches for live-attenuated vaccine development of infectious bursal di-sease virus［J］. Current Opinion in Virology，44：139-144. doi：10.1016/j.coviro.2020.08.001.

Zhou X M，Wang D C，Xiong J M，Zhang P J，Li Y Q，She R P. 2010. Protection of chickens，with or without maternal antibodies，against IBDV infection by a recombinant IBDV-VP2 protein［J］. Vaccine，28（23）：3990-3996. doi：10. 1016/j.vaccine.2010.03.021.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2023-03-31

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31960698）；濱州沃華生物基金項(xiàng)目（［WH］201901QB01-02）

第一作者：馬景霞（1966-），https：//orcid.org/0009-0007-0834-7382，推廣研究員，主要從事動(dòng)物疫病防控研究工作，E-mail：hjx20211105 @163.com