基于16S rRNA和gyrB基因串聯(lián)DNA特征序列的氣單胞菌鑒定方法

陳天楠 胡鯤

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.027

摘要：【目的】建立基于16S rRNA序列和gyrB基因串聯(lián)DNA特征序列的屬內(nèi)菌種鑒定方法，為氣單胞菌的種間區(qū)分提供技術(shù)支持?！痉椒ā恳?020—2021年在我國(guó)福建、江蘇等地分離獲得的水產(chǎn)源氣單胞菌和NCBI已公布且完成全基因組測(cè)序的10種氣單胞菌為研究對(duì)象，分別以16S rRNA序列、gyrB基因及2個(gè)基因序列串聯(lián)后得到的新DNA特征序列作為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的依據(jù)，比較不同系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的鑒定結(jié)果，并以運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行輔助鑒定?！窘Y(jié)果】在基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、達(dá)卡氣單胞菌、腸源氣單胞菌等聚類(lèi)在不同分支上，未能形成獨(dú)立的種屬進(jìn)化分支；在基于gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中，達(dá)卡氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌聚類(lèi)在同一分支上，而異嗜糖氣單胞菌和維氏氣單胞菌聚類(lèi)在另一分支上。將16S rRNA序列和gyrB基因串聯(lián)組成新DNA特征序列再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)建樹(shù)，能完全有效分離氣單胞菌屬的不同菌株，將不同種的氣單胞菌獨(dú)立聚為一支，較好地實(shí)現(xiàn)種間區(qū)分?！窘Y(jié)論】將16S rRNA序列和gyrB基因串聯(lián)組成新DNA特征序列再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，較基于16S rRNA序列或gyrB基因單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)具有更高的分辨力，是一種理想的保守序列相似性高的屬內(nèi)菌種鑒定方法。因此，在16S rRNA測(cè)序鑒定為氣單胞菌的情況下可再次以gyrB基因?yàn)闇y(cè)序?qū)ο?，獲得序列信息后與16S rRNA序列串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，能更加精確地將氣單胞菌鑒定到種水平。

關(guān)鍵詞：氣單胞菌；16S rRNA序列；gyrB基因；串聯(lián)DNA序列；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

中圖分類(lèi)號(hào)：S917.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2023）06-1858-10

Identification of Aeromonas based on 16S rRNA and gyrB gene tandem DNA characteristic sequence

CHEN Tian-nan1，2，3， HU Kun1，2，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University），

Shanghai? 201306，China；2National Pathogen Collection Center for Aquatic Animals（Shanghai Ocean University），

Shanghai? 201306，China；3Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources，Ministry of Agriculture and

Rural Affairs（Shanghai Ocean University），Shanghai? 201306，China）

Abstract：【Objective】This work was aimed to establish a identification method of Aeromonas based on 16S rRNA sequence and gyrB gene tandem DNA characteristic sequence， and to provide research technical support for the differentia-tion of Aeromonas at the species level. 【Method】The aquatic bacteria， which were detected as Aeromonas later， isolated from Fujian， Jiangsu and other places in China from 2020 to 2021 and ten different species of Aeromonas that have completed genome sequencing on NCBI were taken as the experimental objects. The 16S rRNA sequence， gyrB gene and the new DNA characteristic sequences obtained from the tandem of the two sequences were used as the basis for the establishment of the evolutionary tree. The results were identified by comparing different evolutionary trees， meanwhile， exercise tests， hemolysis tests， and sugar fermentation tests were also be used for auxiliary identification. 【Result】The results showed that the combined tree had better discrimination effect than the single gene tree. In the phylogenetic evolution tree constructed based on single 16S rRNA sequences， A. media， A. hydrophila， A. dhakensis， and A. enteropelogenes were dispersed on different branches， and did not form independent species and evolutionary branches. In the phylogenetic evolution tree constructed based on the single gyrB gene， A. dhakensis， A. caviae， and A. hydrophilawere clustered on the same branch， while A. allosaccharophila and A. veronii were also clustered on the same branch. By combining 16S rRNA sequence and gyrB gene in tandem to form a new DNA characteristic sequence， the phylogenetic evolutionary tree was constructed， which could completely and effectively isolate different strains of Aeromonas， and cluster different species of Aeromonas into an independent branch， so as to achieve better interspecific differentiation. 【Conclusion】The phylogenetic tree constructed by combining 16S rRNA sequence and gyrB gene in tandem to form a new DNA sequence has better identification ability than the phylogenetic tree constructed solely based on 16S rRNA sequence or gyrB gene. It is an ideal method for genus species identification with high conserved sequence similarity. Therefore， in the case of the identification of Aeromonas by 16S rRNA sequencing， gyrB gene can be used as the sequencing object again， and after obtaining sequence information， the phylogenetic evolutionary tree can be constructed in tandem with 16S rRNA sequence to more accurately identify Aeromonas to the species level.

Key words： Aeromonas；16S rRNA sequence；gyrB gene；tandem DNA sequence； phylogenetic tree

Foundation items：“Technological Innovation of Blue Granary”of National Key Research and Development Program of China（2019YFD0900102）；National Freshwater Aquatic Germplasm Resources Bank Construction Project （FGRC：18537）

0 引言

【研究意義】據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國(guó)漁業(yè)總產(chǎn)值達(dá)13517.24億元，其中海水養(yǎng)殖3836.20億元、淡水養(yǎng)殖6387.15億元；淡水養(yǎng)殖面積5040.56千ha，而受災(zāi)面積達(dá)808.79千ha，水產(chǎn)品損失1525996.46萬(wàn)元中除去臺(tái)風(fēng)及洪澇導(dǎo)致的1151197.81萬(wàn)元外，剩下的以病害損失最嚴(yán)重（208778.81萬(wàn)元）（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)漁政管理局等，2021）。魚(yú)病是制約我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖健康發(fā)展的瓶頸問(wèn)題，尤其是細(xì)菌性魚(yú)病。氣單胞菌（Aeromonas sp.）作為水產(chǎn)常見(jiàn)的條件性致病菌，能引起魚(yú)類(lèi)行動(dòng)緩慢、吃食減少、鰭部充血、體表潰瘍及腹水等癥狀（戴瑜來(lái)等，2019），目前已鑒定的氣單胞菌有36個(gè)種、12個(gè)亞種（鄧玉婷等，2019）。因此，開(kāi)展水產(chǎn)氣單胞菌鑒定分型研究，對(duì)預(yù)測(cè)防控水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病及確保我國(guó)水產(chǎn)漁業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】氣單胞菌最早于1893年被發(fā)現(xiàn)，1943年被劃分入弧菌科（Vibrionaceae），在1984年版的《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中氣單胞菌仍歸屬于弧菌科，按其表型與致病性最初僅有3個(gè)種：嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）、斑點(diǎn)氣單胞菌（A. punctatus）和殺鮭氣單胞菌（A. salmonides）。隨著微生物學(xué)研究的不斷深入，越來(lái)越多的氣單胞菌被研究發(fā)現(xiàn)，在1994年版的《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》中新增了維氏氣單胞菌（A. veronii）、中間氣單胞菌（A. media）、舒伯特氣單胞菌（A. schubertii）和嗜泉?dú)鈫伟ˋ. eucrenophila）4種新的氣單胞菌，但此時(shí)氣單胞菌仍歸屬于弧菌科?；?S rRNA和16S rRNA序列的生物分類(lèi)研究，有學(xué)者質(zhì)疑氣單胞菌與弧菌科的不同，并呼吁氣單胞菌應(yīng)獨(dú)立成科（宋元鍉和何曉青，1990）。目前，氣單胞菌在《國(guó)際系統(tǒng)與進(jìn)化微生物雜志》（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，IJSEM）的生物分類(lèi)中隸屬于氣單胞菌目（Aeromonadales）氣單胞菌科（Aeromonadaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas）。近年來(lái)，不斷報(bào)道有新的氣單胞菌被發(fā)現(xiàn)，包括A. simiae（Mokracka et al.，2001）、A. culicicola（Pidiyar et al.，2002）、A. molluscorum（Mi?ana-Galbis et al.，2004）、A. sharmana（Saha and Chakrabarti，2006）、A. bivalvium（Mi?ana-Galbis et al.，2007）、A. tecta（Demarta et al.，2008）、A. aquariorum（Martínez-Murcia et al.，2008）、A. diversa（Mi?ana-Galbis et al.，2009）、A. rivuli（Figueras et al.，2011）、A. staiwanensis、A. sanarellii（Beaz-Hidalgo et al.，2012）等，對(duì)于日益增多的氣單胞菌種類(lèi)，亟待探索出更加精確的鑒定方法?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】在細(xì)菌鑒定中，目前最常用最準(zhǔn)確的方法是分子生物學(xué)鑒定，其中16S rRNA序列因在原核生物中廣泛存在且具有高度的保守性，已發(fā)展成為微生物鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)（史斌等，2013；劉賽，2018；麻強(qiáng)生等，2020）。由于16S rRNA序列的高度保守性，細(xì)菌鑒定時(shí)能精確到屬，但難以繼續(xù)往下精確到種，因此需要額外的輔助手段來(lái)進(jìn)一步鑒定。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以2020—2021年在我國(guó)福建、江蘇等地分離獲得的水產(chǎn)源氣單胞菌和NCBI已公布且完成全基因組測(cè)序的10種氣單胞菌為研究對(duì)象，分別以16S rRNA序列、gyrB基因及2個(gè)基因序列串聯(lián)后得到的新DNA特征序列作為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的依據(jù)，比較不同系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的鑒定結(jié)果，并以運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、溶血性試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行輔助鑒定，旨在進(jìn)一步優(yōu)化16S rRNA細(xì)菌鑒定方法，為氣單胞菌的種間區(qū)分提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

Taq DNA聚合酶預(yù)混液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、6×DNA Loading Buffer及細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；GoldenViewTM核酸染料購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；50×TAE溶液購(gòu)自北京酷來(lái)搏科技有限公司；鹽酸四甲基對(duì)苯胺和水楊酸購(gòu)自上海凜恩科技發(fā)展有限公司；七葉苷購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；瓊脂糖、BHI液體培養(yǎng)基、AHM培養(yǎng)基、Kovacs試劑、葡萄糖、蔗糖及阿拉伯糖購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。菌株為2020—2021年遼寧、山東、江蘇、上海、福建、新疆各地水產(chǎn)研究所上報(bào)的部分氣單胞菌屬菌株和上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)自行分離的氣單胞菌屬菌株，詳見(jiàn)表1。

常見(jiàn)培養(yǎng)基：BHI固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、AHM培養(yǎng)基、0.002 mol/L氫氧化鈉溶液、溴甲酚紫指示劑均按說(shuō)明進(jìn)行配制。糖發(fā)酵試驗(yàn)管：各類(lèi)糖粉末（g）∶蛋白胨（g）∶蒸餾水（mL）=1∶0.5∶100，分裝于15 mL離心管中，滴加2～3滴溴甲酚紫指示劑，并以稀醋酸或碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0左右（溶液呈紫色）。121 ℃高壓滅菌15 min，超凈臺(tái)內(nèi)放置備用。脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基：在普通LB固體培養(yǎng)基溫度降至50 ℃凝固前，按脫纖維羊血∶固體培養(yǎng)基=1∶10比例加入脫纖維羊血，混勻，凝固后倒置于超凈臺(tái)內(nèi)備用。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 細(xì)菌培養(yǎng) 凍存菌株復(fù)蘇活化：（1）從-80 ℃冰箱取出菌株凍存管，解凍后用移液槍吸取100 μL菌液接種至LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃復(fù)蘇培養(yǎng)24 h。（2）以滅菌接種環(huán)蘸取少許已復(fù)蘇的菌液，劃線接種至LB固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h。（3）判斷菌株無(wú)污染后，挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的菌落接種至新的LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)18 h后即可使用。

1. 2. 2 生理生化鑒定 根據(jù)GB/T 18652—2002《致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法》，檢測(cè)菌株的氧化酶、運(yùn)動(dòng)性、吲哚、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等8項(xiàng)指標(biāo)。同時(shí)，對(duì)LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成型的菌落滴加1～2滴1%鹽酸四甲基對(duì)苯胺，靜置觀察其顏色變化；以滅菌接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成型的單菌落，水平穿刺接種至AHM半固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性；在長(zhǎng)有菌落的AHM培養(yǎng)基頂部滴加4～5滴Kovacs試劑，觀察管壁內(nèi)顏色變化；用滅菌接種環(huán)挑取LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)成型的少許菌落，分別接種到5管不同糖發(fā)酵試驗(yàn)管內(nèi)，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其顏色變化。

1. 2. 3 溶血試驗(yàn) 以滅菌接種環(huán)蘸取少許新鮮菌液，在脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃分的3個(gè)區(qū)內(nèi)各自劃線接種，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察溶血現(xiàn)象。

1. 2. 4 細(xì)菌總DNA提取 采用熱裂解法提取細(xì)菌DNA，步驟如下：取純培養(yǎng)菌液1.0 mL置于滅菌的1.5 mL離心管中，100 ℃水浴鍋內(nèi)加熱5 min后0 ℃冰浴7 min，然后13000 r/min離心6 min，收集上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 5 氣單胞菌基因引物設(shè)計(jì) 選擇16S rRNA序列和gyrB基因?yàn)榘谢颍ū?）。gyrB基因擴(kuò)增引物為氣單胞菌多位點(diǎn)分型管家基因標(biāo)準(zhǔn)引物（https：//pubmlst.org/），16S rRNA序列擴(kuò)增引物參考韋小瑜等（2016）的方法進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1. 2. 6 16S rRNA序列和gyrB基因擴(kuò)增及測(cè)序分析 根據(jù)2×Taq DNA聚合酶預(yù)混液試劑使用說(shuō)明，優(yōu)化PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Taq DNA聚合酶預(yù)混液25.0 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性150 s；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳（120 V，30 min）檢測(cè)合格后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1. 2. 7 菌株種屬系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 將測(cè)序獲得的2段序列導(dǎo)入SeqMan進(jìn)行拼接，并根據(jù)波峰消除重疊部分的錯(cuò)誤，去除拼接后序列首尾2段雜亂峰部分，即得到新的DNA特征序列。選擇維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌（A. jandaei）、殺鮭氣單胞菌、溫和氣單胞菌（A. sobria）、腸源氣單胞菌（A. enteropelogenes）、達(dá)卡氣單胞菌（A. dhakensis）、豚鼠氣單胞菌（A. caviae）、中間氣單胞菌、異嗜糖氣單胞菌（A. allosaccharophila）等10種氣單胞菌屬菌株，下載NCBI已公布且完成全基因組測(cè)序的氣單胞菌屬菌株，并采用基因的標(biāo)準(zhǔn)序列在其中檢索這些菌株各自的16S rRNA序列和gyrB基因序列。通過(guò)MegAlign和MEGA 7.0刪除新DNA特征序列多出的核苷酸及補(bǔ)正缺失的核苷酸，將修正好的序列剪切至統(tǒng)一長(zhǎng)度。將標(biāo)準(zhǔn)菌株和待測(cè)菌株的序列共同導(dǎo)入MEGA 7.0中，選擇鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)判斷進(jìn)化分支上的已有標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)確定菌株種屬，Bootstrap設(shè)為1000次。

2 結(jié)果與分析

2. 1 氣單胞菌屬菌株培養(yǎng)及其生理生化鑒定結(jié)果

分離獲得的氣單胞菌屬菌株在LB固體培養(yǎng)基上能形成光滑圓潤(rùn)、半透明、淡黃色的較小菌落（圖1）。AHM半固體培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng)時(shí)，菌株沿著穿刺孔向培養(yǎng)基內(nèi)側(cè)擴(kuò)散蔓延即具有運(yùn)動(dòng)性，若菌株只在穿刺孔道壁上生長(zhǎng)則表明菌株沒(méi)有運(yùn)動(dòng)性。氣單胞菌屬菌株的AHM半固體培養(yǎng)基運(yùn)動(dòng)性鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。糖發(fā)酵試驗(yàn)的指示劑為溴甲酚紫，當(dāng)顏色由紫色變黃色即說(shuō)明氣單胞菌能分解糖類(lèi)產(chǎn)酸，促使培養(yǎng)基環(huán)境pH下降而變色。氣單胞菌屬菌株的糖發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

依據(jù)GB/T 18652—2002《致病性嗜水氣單胞菌檢驗(yàn)方法》進(jìn)行判定，結(jié)果（表4）顯示：有11株菌株的8項(xiàng)指標(biāo)均呈陽(yáng)性，判為嗜水氣單胞菌；3株運(yùn)動(dòng)性陰性的菌株為殺鮭氣單胞菌；另外21株菌株中，有1株氧化酶呈陽(yáng)性而蔗糖呈陰性的判為簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌，10株阿拉伯糖呈陰性的判為維氏氣單胞菌，10株阿拉伯糖呈陽(yáng)性但七葉苷和水楊苷呈陰性的判為溫和氣單胞菌。同時(shí)根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（第8版）及《常見(jiàn)細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（2001年版），蔗糖、阿拉伯糖和七葉苷在嗜水氣單胞菌、中間氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌及維氏氣單胞菌上均存在假陰性或假陽(yáng)性現(xiàn)象，即上述菌株判斷可能存在一定的假定誤差。

2. 2 氣單胞菌屬菌株溶血試驗(yàn)結(jié)果

觀察脫纖維羊血瓊脂培養(yǎng)基若出現(xiàn)紅色消退，則代表培養(yǎng)基內(nèi)血細(xì)胞被破壞，出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。氣單胞菌屬菌株溶血試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，除了BYK07和BYK08菌株為γ溶血（不溶血）外，其余菌株均為β溶血（完全溶血），基本符合氣單胞菌均存在一定毒力因子的情況。

2. 3 靶基因PCR擴(kuò)增電泳觀察及其測(cè)序分析結(jié)果

由圖5可看出，氣單胞菌屬菌株的16S rRNA序列和gyrB基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別在1000～2000和500～750 bp處出現(xiàn)單一明亮的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，可進(jìn)行下一步測(cè)序分析。將測(cè)序得到的16S rRNA序列和gyrB基因核苷酸序列文件導(dǎo)入SeqMan，通過(guò)波峰圖形式進(jìn)行觀察。雙向測(cè)序波峰相互拼接，且以2段波峰獨(dú)立不交錯(cuò)為優(yōu)，中間的核苷酸序列相互吻合，呈現(xiàn)較好的波峰性狀。其部分序列測(cè)序波峰如下圖5所示。

2. 4 16S rRNA序列和gyrB基因聯(lián)合構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示：在基于16S rRNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖7-A）中，中間氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、達(dá)卡氣單胞菌、腸源氣單胞菌等聚類(lèi)在不同分支上，未能形成獨(dú)立的種屬進(jìn)化分支。在基于gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖7-B）中，達(dá)卡氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌聚類(lèi)在同一分支上，而異嗜糖氣單胞菌和維氏氣單胞菌聚類(lèi)在同一分支上。說(shuō)明基于這2個(gè)基因序列單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)時(shí)均存在一定的干擾分支，而影響菌株的鑒定判斷。將這2個(gè)基因序列串聯(lián)組成新DNA特征序列再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)建樹(shù)（圖7-C），則能完全有效分離氣單胞菌屬的不同菌株（表5）。

表 5 氣單胞菌屬菌株鑒定結(jié)果

Table 5 Strain identification results of strains of Aeromonas

[菌株 Strain 16S rRNA gyrB 16S rRNA-gyrB BYK01 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK02 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK03 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK04 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK05 腸源氣單胞菌 豚鼠氣單胞菌 豚鼠氣單胞菌 BYK06 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK07 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK08 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK09 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK10 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK11 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK12 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK13 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK14 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK15 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK16 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 BYK17 簡(jiǎn)達(dá)氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK18 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK19 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK20 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK21 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK22 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK23 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK24 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK25 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK26 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 嗜水氣單胞菌 BYK27 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 BYK28 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 殺鮭氣單胞菌 BYK29 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK30 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK31 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK32 達(dá)卡氣單胞菌 達(dá)卡氣單胞菌 達(dá)卡氣單胞菌 BYK33 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK34 維氏氣單胞菌 異嗜糖氣單胞菌 維氏氣單胞菌 BYK35 腸源氣單胞菌 腸源氣單胞菌 腸源氣單胞菌 ]

3 討論

在我國(guó)，目前僅有嗜水氣單胞菌和殺鮭氣單胞菌的國(guó)標(biāo)及維氏氣單胞菌的行標(biāo)3種檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)可供參考，其他氣單胞菌的鑒定方法暫時(shí)參考國(guó)外的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；此外，我國(guó)養(yǎng)殖水環(huán)境復(fù)雜，菌株可能存在基因的選擇性表達(dá)，導(dǎo)致部分研究結(jié)果存在明顯差異。生理生化試驗(yàn)存在較多不確定性，各氣單胞菌屬菌株對(duì)單項(xiàng)檢測(cè)項(xiàng)目也存在部分菌株呈陽(yáng)性、部分菌株呈陰性的可能。在菌株樣本量足夠的情況下，通常能統(tǒng)計(jì)出各項(xiàng)指標(biāo)間的規(guī)律性而劃分菌種類(lèi)別（胡靜儀和王金良，2004）。但試驗(yàn)菌株樣本量小甚至僅有1株的情況下，若檢測(cè)中存在多個(gè)假陽(yáng)性項(xiàng)目，其生理生化鑒定結(jié)果累加后出現(xiàn)誤判的可能性明顯增加。因此，針對(duì)單株菌株鑒定時(shí)通常選擇更加精細(xì)的16S rRNA序列鑒定法。綜合生理生化鑒定結(jié)果與測(cè)序結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，基于16S rRNA和gyrB基因串聯(lián)特征序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)與生理生化試驗(yàn)結(jié)果的吻合率僅為48.6%，其中多數(shù)誤差出現(xiàn)在生理生化試驗(yàn)鑒定為溫和氣單胞菌的菌株上。

采用16S rRNA序列鑒定時(shí)，也會(huì)因?yàn)榛蚱伟畔⑸俚惹闆r而出現(xiàn)誤差。Tindall等（2010）研究認(rèn)為，序列同源性在97%以上為同一個(gè)種，序列同源性在95%以上則為同一個(gè)屬。在GenBank中也發(fā)現(xiàn)，在默認(rèn)顯示100條相近結(jié)果下，16S rRNA序列同源性均在99.92%以上；擴(kuò)大搜索至1000條相近結(jié)果時(shí)，16S rRNA序列同源性仍維持在99.50%以上，且檢索結(jié)果中各種氣單胞菌屬菌株均有出現(xiàn)。因此，需要通過(guò)增加測(cè)序基因，增大鑒定信息量，最大限度減少這種情況的出現(xiàn)。Michael Soler等（2004）、Janda和Abbott（2010）研究表明，gyrB基因是氣單胞菌管家基因中相對(duì)保守但又存在一定變異的基因。在GenBank中，gyrB基因在100條相近結(jié)果下只能達(dá)90%～95%的同源性，表明gyrB基因能實(shí)現(xiàn)同屬不同種的精準(zhǔn)識(shí)別。gyrB基因在鑒定分類(lèi)上較16S rRNA序列更加精確，在氣單胞菌及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖致病菌中均已得到驗(yàn)證（黃慧等，2019；蔡紅艷等，2021；馮震等，2021；傅奇等，2021）?？梢?jiàn)，gyrB基因在氣單胞菌鑒定分類(lèi)上更具優(yōu)勢(shì)。但系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化不僅僅依據(jù)核苷酸序列相似性，同時(shí)受序列排序變化等多個(gè)因素的影響。在基于gyrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中也存在菌株交叉情況，為此本研究采用16S rRNA序列和gyrB基因串聯(lián)特征序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，該方法在芽孢桿菌（朱成科等，2017；傅奇等，2020a，2020b，2021）和弧菌（馮震等，2021）上已有研究報(bào)道。本研究結(jié)果表明，將16S rRNA序列與gyrB基因串聯(lián)組成新DNA特征序列再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，較基于16S rRNA序列或gyrB基因單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)具有更高的分辨力，是一種理想的保守序列相似性高的屬內(nèi)菌種鑒定方法。因此，在16S rRNA測(cè)序鑒定為氣單胞菌的情況下可再次以gyrB基因?yàn)闇y(cè)序?qū)ο?，獲得序列信息后與16S rRNA序列串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，能更加精確地將氣單胞菌鑒定到種水平。

4 結(jié)論

將16S rRNA序列和gyrB基因串聯(lián)組成新DNA特征序列再構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，較基于16S rRNA序列或gyrB基因單獨(dú)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)具有更高的分辨力，是一種理想的保守序列相似性高的屬內(nèi)菌種鑒定方法。因此，在16S rRNA測(cè)序鑒定為氣單胞菌的情況下可再次以gyrB基因?yàn)闇y(cè)序?qū)ο?，獲得序列信息后與16S rRNA序列串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，能更加精確地將氣單胞菌鑒定到種水平。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2022-06-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)科技創(chuàng)新”重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)（2019YFD0900102）；國(guó)家淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源庫(kù)建設(shè)項(xiàng)目（FGRC：18537）

通訊作者：胡鯤（1976-），https：//orcid.org/0000-0003-4541-2917，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究工作，E-mail：khu@shou.edu.cn

第一作者：陳天楠（1997-），https：//orcid.org/0000-0001-5626-8725，研究方向?yàn)樗鷦?dòng)物醫(yī)學(xué)，E-mail：1350735975@qq.com