燈盞花素對(duì)大鼠糖尿病視網(wǎng)膜水腫PKCβ 及VEGF 蛋白表達(dá)的影響

胡卓瑜，王 萱，胡 齊，劉 靜，黃櫳瑢?zhuān)睹懒郑瑒⒅久?，陳向東*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙410007；3.中醫(yī)藥防治眼耳鼻喉疾病湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙410208

糖尿病黃斑水腫（diabetic macular edema, DME）是高血糖環(huán)境下黃斑區(qū)血－視網(wǎng)膜屏障（blood-retinal barrier, BRB）受損所導(dǎo)致的。 黃斑區(qū)生成的水腫液壓迫神經(jīng)元，從而引起糖尿病患者視力喪失[1-2]。而視網(wǎng)膜水腫是由于液體聚集在視網(wǎng)膜組織間隙中，在液體的壓力下，神經(jīng)細(xì)胞變性、壞死，加重組織缺血缺氧，損傷糖尿病患者的視功能。 報(bào)道顯示，糖尿病視網(wǎng)膜病變患者并發(fā)黃斑水腫的概率為2.7%～11%，其發(fā)病主要受糖尿病病程、血壓以及糖化血紅蛋白指數(shù)的影響[3]。 現(xiàn)階段，歐洲視網(wǎng)膜專(zhuān)家協(xié)會(huì)指出DME 的治療主要以激光光凝治療、抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）藥物治療、激素治療和手術(shù)治療為主。其中，抗VEGF 藥物的注射是目前的一線(xiàn)治療方式，在提高視力、減輕黃斑水腫方面有效[4]，但其價(jià)格昂貴、周期長(zhǎng)、需反復(fù)注射，并且會(huì)帶來(lái)腎功能異常、血栓性微血管病變的風(fēng)險(xiǎn)，使得黃斑水腫患者在尋求治療過(guò)程中望而卻步[5-6]。

糖尿病視網(wǎng)膜水腫的病理過(guò)程可概括為長(zhǎng)期的糖代謝紊亂下視網(wǎng)膜缺血、缺氧，糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycosylation end product, AGE）與糖基化終末產(chǎn)物受體（receptor for advanced glycation end products, RAGE）結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)，同時(shí)高糖環(huán)境促使二酰甘油（diacylglycerol, DAG）水平的增高，激活蛋白激酶C（protein kinases C, PKC）[7]。 其中，蛋白激酶Cβ（PKCβ）的活化被證實(shí)是糖尿病微血管病變的關(guān)鍵蛋白[8]。 同時(shí)，PKC 通路能改變一氧化氮生物利用度、調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表達(dá)，影響血管張力和通透性，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷[9]。另一方面，VEGF 通過(guò)增加緊密連接蛋白的磷酸化促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞繁衍增殖，造成BRB 損傷，大大增加了血管的通透性，加快了大分子物質(zhì)滲漏進(jìn)入視網(wǎng)膜組織間，使積液聚集于視網(wǎng)膜內(nèi)核層與外叢狀層間，最終導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織細(xì)胞間水腫[10]。

近年來(lái)，中醫(yī)藥在治療糖尿病視網(wǎng)膜水腫中頗有成就，具有改善視網(wǎng)膜微循環(huán)、減輕毛細(xì)血管通透性、減少微血管瘤數(shù)量的作用，可下調(diào)VEGF 表達(dá)以保護(hù)BRB[11]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用活血化瘀類(lèi)中藥可改善糖尿病視網(wǎng)膜病變患者眼底微循環(huán)，抑制炎癥反應(yīng)，以保持BRB 的完整性和穩(wěn)定性，抑制新生血管的生長(zhǎng)[12]。 具有活血化瘀功能的中藥燈盞花屬于菊科飛蓬屬的生草本植物，首載于《滇南本草》：“燈盞花……左癱右瘓，風(fēng)濕疼痛……”[13]主要應(yīng)用于跌打損傷，具有活血止痛的作用。 現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，燈盞花素是從燈盞花中提取出的黃酮類(lèi)有效成分，可以增加血流量，改善微循環(huán)，擴(kuò)張血管，降低血液黏度，并在治療糖尿病心肌病、糖尿病腎病、視網(wǎng)膜病變等方面卓有成效[14]。 本研究通過(guò)建立鏈脲霉素（streptozotocin, STZ）聯(lián)合高糖高脂飲食誘導(dǎo)SD 大鼠糖尿病模型，并結(jié)合光學(xué)相干斷層成像術(shù)（optical coherence tomography, OCT）以及HE 染色檢測(cè)視網(wǎng)膜水腫程度，對(duì)燈盞花素減輕糖尿病視網(wǎng)膜水腫、潛在靶點(diǎn)蛋白及BRB 的保護(hù)作用進(jìn)行系統(tǒng)研究，為進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠36 只，鼠齡8～10 周，體質(zhì)量（180±20） g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級(jí)動(dòng)物中心提供。 動(dòng)物分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥研究院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。 進(jìn)行為期1 周的適應(yīng)性喂養(yǎng)，然后將SD 大鼠隨機(jī)分成正常組和造模組。 本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及條件符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》相關(guān)規(guī)定，由湖南省中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)福利倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2020-0061）。

1.2 主要試劑

羥苯磺酸鈣（商品名：安多明，貴州天安藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)H20010481）；STZ、Tris（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：08E221108、V900483）；燈盞花素（廣州彼迪藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Z44023596）；檸檬酸、檸檬酸鈉(上海展云化工有限公司，批號(hào)：20201105、20210119）。HE 染色液、PBS（7.2～7.6）、枸櫞酸鹽緩沖液（Wellbio，批號(hào)：05A210219、11A210301、01A210302）；RIPA 裂解液（中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：P0013B）；APS、吐溫-20（國(guó)藥集團(tuán)上海有限公司，批號(hào)：10002618、30189328）；SDS（中國(guó)大連美倫生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：MB2479）；TEMED（中國(guó)上海阿拉丁生化科技股份有限公司貨號(hào)，批號(hào)：T105497）；VEGF 抗體、PKCβ 抗體、β-actin 抗體、occludin 抗體、HRP 山羊抗鼠IgG、HRP 山羊抗兔IgG（美國(guó)蛋白技術(shù)集團(tuán)公司，批號(hào)：19003-1-AP、12919-1-AP、66009-1-Ig、27260-1-AP、SA00001-1、SA00001-2）；Claudin-5 抗體（賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：35-3500）。

1.3 主要儀器

光學(xué)相干斷層掃描儀（德國(guó)海德堡公司，型號(hào)：Spec-CAM-05529-S2000）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（中國(guó)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開(kāi)發(fā)有限公司，型號(hào)：H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)、多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號(hào)：PW-812、MB-530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號(hào)：DHP-500）；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、電泳槽（中國(guó)北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYY-6C、DYCZ-40D、DYCZ-24DN）；旋渦混合器、搖床（海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：GL-88B、TS-1）。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠模型的制備

36 只SD 雄性大鼠自由飲水飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，禁食14 h 后稱(chēng)重編號(hào)，隨機(jī)分為正常組(n=9)和造模組(n=27)。 造模組使用高脂高糖飼料（飼料為湖南中醫(yī)藥研究院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供）喂養(yǎng)2 周，大鼠每天攝入飼料30～40 g，控制其食量。待2 周后，空腹12 h 后稱(chēng)重編號(hào)， 按30 mg/kg 劑量一次性腹腔注射STZ，正常組腹腔注射等量的生理鹽水。STZ腹腔注射72 h 后取尾靜脈血測(cè)SD 大鼠空腹血糖，測(cè)得血糖穩(wěn)定在16.7 mmol/L 并表現(xiàn)為多飲、多食、多尿者則為建立糖尿病大鼠模型成功[15]。若大鼠血糖＜16.7 mmol/L，則追加注射等劑量STZ，從模型建立成功1 周后開(kāi)始計(jì)算病程。

2.2 糖尿病視網(wǎng)膜水腫模型的制備與分組

自糖尿病模型造模開(kāi)始時(shí)，每4 周選擇1 只正常組大鼠與1 只造模組大鼠，HE 染色觀察大鼠視網(wǎng)膜是否存在組織紊亂不均的情況，并發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜厚度高于（209.78±3.62） μm 即為造模成功[16]。8 周時(shí)確認(rèn)造模成功后，將糖尿病視網(wǎng)膜水腫大鼠隨機(jī)分為模型組9 只、安多明組9只、燈盞花素組9 只。模型組大鼠給予10 mL·kg-1生理鹽水灌胃。 根據(jù)人與大鼠體表面積換算，人的臨床劑量換算為大鼠等效劑量灌胃安多明0.09 g·kg-1，燈盞花素組給予0.002 g/kg，按10 mL·kg-1·d-1灌胃給藥，均治療4 周。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程死亡大鼠嚴(yán)格按照上述造模方式補(bǔ)齊。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 大鼠的一般情況 觀察大鼠的飲食情況、體質(zhì)量、精神狀態(tài)。 造模前1 周，造模后2、4、8 周，以及用藥后的1、2、4 周后的早上，稱(chēng)取大鼠體質(zhì)量、空腹血糖并記錄。

2.3.2 HE 染色觀察造模前后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)變化 正常組以及模型組的大鼠分別在造模后4、8 周各處死1只，進(jìn)行眼球的取材，然后進(jìn)行HE 染色，具體步驟如下：蒸餾水沖洗視網(wǎng)膜組織10 min，PBS 返藍(lán)；伊紅染3～5 min，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（95%～100%）脫水，60 ℃烤片1～2 h；切片脫蠟至水：二甲苯中放切片約10 min，2 次，然后依次在100%、100%、95%、85%和75%乙醇中，每級(jí)放置5 min。 再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染色5 min。 取出后置于二甲苯維持10 min，2 次，中性樹(shù)膠封片、顯微鏡觀察。 用藥4 周后以同法對(duì)各組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行HE 染色。 應(yīng)用同法處理造模后大鼠的腎臟組織，觀察其變化。

2.3.3 OCT 觀察視網(wǎng)膜厚度變化 造模開(kāi)始之前，麻醉機(jī)吸入2 mL/L 異氯烷麻醉，符大鼠全身麻醉成功后，并用復(fù)方托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳，然后玻璃酸鈉滴眼液滴眼，保持大鼠角膜濕潤(rùn)狀態(tài)。 待老鼠反應(yīng)遲緩后，包裹全身，暴露待檢鼠眼，用OCT 對(duì)各組大鼠進(jìn)行眼底檢查。進(jìn)行OCT 檢查時(shí)測(cè)量距離視盤(pán)上方、下方、鼻側(cè)、顳側(cè)4 個(gè)方向2 個(gè)視盤(pán)直徑（disc diameter, DD）處的視網(wǎng)膜厚度（視網(wǎng)膜內(nèi)界膜至視網(wǎng)膜色素上皮高反射層）并記錄，檢查完予以鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠預(yù)防角膜干燥。 使用檢測(cè)系統(tǒng)的自帶軟件手動(dòng)測(cè)量視網(wǎng)膜厚度。于用藥前（造模后8周）及用藥4 周后，以同法對(duì)各組進(jìn)行OCT 檢查，觀察視網(wǎng)膜厚度變化。

2.3.4 Western blot 檢測(cè)VEGF、PKCβ 蛋白表達(dá) 分離眼后節(jié)視網(wǎng)膜組織，用PBS 洗浴1 次，制備10%分離膠及4.8%濃縮膠，取待測(cè)蛋白樣本80 μL 進(jìn)行凝膠電泳。用10% PAGE 負(fù)載蛋白，然后將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5%脫脂牛奶進(jìn)一步封閉PVDF 膜，膜與特異性一抗VEGF、PKCβ，4 ℃雜交過(guò)夜。 次日放置30 min 后，加入兔抗大鼠VEGF 一抗（1∶1 000）、兔抗大鼠PKCβ 一抗（1∶500）和小鼠抗大鼠β-actin 一抗（1∶5 000）孵育90 min，結(jié)束后用PBS 液沖洗3次。 用TBST 洗后將PVDF 膜放入裝有HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（1∶5 000）、山羊抗兔二抗（1∶6 000）孵育90 min，然后用TBST 洗3 次，每次15 min。 使用ECL 化學(xué)發(fā)光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，在暗盒內(nèi)與X 膠片曝光5～20 min；顯影沖洗。 并使用Image J 軟件進(jìn)行分析，蛋白表達(dá)量以目的蛋白灰度值與β-actin 灰度值的比值表示。

2.3.5 ELISA 法檢測(cè)VEGF、PKCβ 含量 全麻下分離腹主動(dòng)脈采血，用肝素抗凝管采血。將室溫血液自然凝固10～20 min，離心約20 min（3 000 r/min），取上清液進(jìn)行檢測(cè)；或進(jìn)行分裝，并將標(biāo)本放于-20 ℃或-80 ℃保存，禁止反復(fù)凍融。解凍后的樣品應(yīng)再次離心，然后依據(jù)試劑盒步驟檢測(cè)VEGF、PCKβ 的表達(dá)量。

2.3.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè)claudin-5、occludin 蛋白表達(dá)水平 采用兩步法，眼球組織標(biāo)本（取3 只大鼠標(biāo)本）石蠟包埋，制成4 μm 常規(guī)切片，脫蠟及梯度脫水后，經(jīng)3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，高壓修復(fù)抗原后，滴加兔抗鼠occludin、小鼠抗大鼠claudin-5 抗體（稀釋濃度分別為1∶100、1∶100）置于濕盒，4 ℃冰箱過(guò)夜。 次日復(fù)溫后滴加抗-兔、兔-IgG 抗體-HRP 多聚體，于37 ℃溫箱孵育30 min。 經(jīng)DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明封片。 所有切片用濱松Nano Zoomer 2.0RS 掃描成像，每個(gè)切片圖像400 倍放大后截取3 個(gè)視野，采用IPP 6.0 進(jìn)行圖像分析，分析結(jié)果為總光密度，取平均值為蛋白表達(dá)強(qiáng)度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，兩組進(jìn)行比較，滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差齊性，采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；否則采用秩和檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較時(shí)，滿(mǎn)足正態(tài)分布及方差齊性，采用方差分析；否則采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01 為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況變化

注射STZ 后，模型組、安多明組及燈盞花素組的大鼠大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，并有體質(zhì)量下降趨勢(shì)。在造模后2、4、8 周以及給藥后1、2、4 周，與空白組對(duì)比，模型組、安多明組、燈盞花素組體質(zhì)量增長(zhǎng)較慢（P＜0.01）；在給藥后1 周，與模型組對(duì)比，安多明組體質(zhì)量增長(zhǎng)較少（P＜0.05）；在給藥后2 周，與安多明組對(duì)比，燈盞花素組體質(zhì)量增長(zhǎng)較多（P＜0.01）；在給藥后4 周，與模型組、安多明組對(duì)比，燈盞花素組體質(zhì)量增長(zhǎng)較多（P＜0.01）（圖1）。 注射STZ 后，與空白組對(duì)比，其他組大鼠血糖>16.7 mmol/L（圖2）。在造模后2、4、8 周以及給藥后1、2、4 周，與正常組對(duì)比，模型組、安多明組、燈盞花素組血糖顯著升高（P＜0.01）。在給藥后2 周，與模型組對(duì)比，燈盞花組血糖降低（P＜0.05）（圖2）。

圖1 大鼠體質(zhì)量變化圖（±s，n=9）

圖2 大鼠血糖濃度變化圖（±s，n=9）

3.2 視網(wǎng)膜形態(tài)組織學(xué)改變

4 周后正常組大鼠視網(wǎng)膜層間結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊致密（圖3A）；而造模4 周后造模組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較為疏松（圖3B）；造模8 周后造模組細(xì)胞排列紊亂，可見(jiàn)明顯疏松，數(shù)目減少，內(nèi)界膜、神經(jīng)纖維層、內(nèi)外核狀層腫脹，細(xì)胞呈空泡樣改變（圖3D）；而正常組未見(jiàn)明顯的異常（圖3C）。

圖3 造模后正常組與造模組的HE 染色圖（×400）

用藥4 周后，與正常組對(duì)比，模型組可見(jiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈空泡樣改變，內(nèi)叢狀層、外叢狀層排列紊亂，內(nèi)核層、外核層細(xì)胞密度減少，排列疏松（圖4B）。 安多明組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞仍呈空泡樣改變，內(nèi)核層、外核層的水腫未見(jiàn)明顯改變（圖4C）。 燈盞花素組視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)較安多明組緊密，層間水腫不明顯，層次結(jié)構(gòu)清晰（圖4D）。

圖4 用藥4 周后各組的HE 染色圖（×400）

3.3 各組視網(wǎng)膜厚度變化

給藥前，與正常組對(duì)比，模型組視網(wǎng)膜厚度增加（P＜0.01），表明出現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫（圖5A）。給藥后，安多明組、燈盞花素組與模型組對(duì)比，視網(wǎng)膜厚度均下降（P＜0.01）（圖5B2—4）。 給藥4 周后，燈盞花素組大鼠視網(wǎng)膜厚度接近于正常水平（表1）。 由于后期部分大鼠出現(xiàn)白內(nèi)障或屈光間質(zhì)不清，故OCT 檢查成像模糊或窺不清。

表1 各組大鼠給藥前后視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

表1 各組大鼠給藥前后視網(wǎng)膜厚度比較（±s，μm）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

組別正常組模型組安多明組燈盞花素組F 值P 值n9999給藥前198±3.53 218.33±2.58▲▲219.77±4.94▲▲218.67±2.71▲▲61.701 P＜0.01給藥后200.89±3.00 220.44±4.47▲▲213.11±4.63▲▲△△209.78±3.08▲▲△△35.11 P＜0.01

圖5 用藥前后視網(wǎng)膜厚度OCT 對(duì)比

3.4 Western blot 檢測(cè)視網(wǎng)膜PKCβ、VEGF 的表達(dá)情況

與正常組對(duì)比，模型組、安多明組視網(wǎng)膜組織中PKCβ、VEGF 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組、燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），其中安多明組PKCβ 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），安多明組VEGF 水平和燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與安多明組相比，燈盞花素組PKCβ 水平下降（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖6。

圖6 各組視網(wǎng)膜組織PKCβ、VEGF 的表達(dá)情況（±s）

3.5 ELISA 檢測(cè)血清PKCβ、VEGF 的表達(dá)情況

與正常組對(duì)比，模型組、安多明組、燈盞花素組血清中PKCβ、VEGF 水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組、燈盞花素組的PKCβ、VEGF 水平顯著降低（P＜0.01）；與安多明組相比，燈盞花素組PKCβ、VEGF 水平下降（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖7。

圖7 各組血清PKCβ、VEGF 的表達(dá)情況（±s）

3.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)視網(wǎng)膜claudin-5、occludin 的表達(dá)情況

給藥4 周后，模型組的組內(nèi)界膜、色素上皮層、內(nèi)外叢狀層細(xì)胞胞漿中claudin-5 的染色較淺，且視網(wǎng)膜組織排列紊亂，結(jié)構(gòu)稀疏，安多明組染色與模型組相比相對(duì)較深。 燈盞花素組的視網(wǎng)膜組織claudin-5、occludin 表達(dá)呈陽(yáng)性，排列相對(duì)整齊，結(jié)構(gòu)致密。與正常組對(duì)比，模型組、安多明組及燈盞花素組視網(wǎng)膜組織中claudin-5、occludin 水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，安多明組的claudin-5、occludin水平升高（P＜0.05）。 與模型組對(duì)比，燈盞花素組的occludin 水平顯著升高（P＜0.01），claudin-5 水平升高（P＜0.05）。 詳見(jiàn)圖8 和表2。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜claudin-5、occludin 的表達(dá)情況（±s）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜claudin-5、occludin 的表達(dá)情況（±s）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與安多明組比較，#P＜0.05。

組別正常組模型組安多明組燈盞花素組F 值P 值n3333 claudin-5 0.027 5±0.003 4 0.009 1±0.000 7▲▲#0.014 1±0.001 0▲▲△0.014 1±0.001 7▲▲△69.62＜0.01 occludin 0.149 5±0.008 0 0.052 0±0.002 0▲▲0.088 8±0.021 4▲▲△0.102 0±0.014 2▲▲△△32.45＜0.01

圖8 各組大鼠視網(wǎng)膜claudin-5 與occludin 的表達(dá)情況

4 討論

在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)展過(guò)程中由于血管通透性的改變，液體聚集在有限空間內(nèi)，使得視網(wǎng)膜外叢狀層形成囊樣改變，導(dǎo)致黃斑水腫的發(fā)生。 DME 的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，其本質(zhì)是視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，內(nèi)皮細(xì)胞通透性增大，使得血-視網(wǎng)膜屏障功能破壞，涉及氧化應(yīng)激、炎性因子及VEGF 的積累，從而加重黃斑區(qū)水腫[17-18]。 PKC 是VEGF 促進(jìn)血管形成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，可增加血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，改變視網(wǎng)膜血管血流狀態(tài)。 當(dāng)機(jī)體處于糖代謝紊亂情況，視網(wǎng)膜血管組織的DAG 水平升高，從而激活PKC 及下游多條通路，改變血管通透性、促進(jìn)血管生成及細(xì)胞因子反應(yīng)[19]；AGE 與RAGE 受體相互作用可激活PKC[20]；活性氧激活PARP 并與己糖胺和PKC 通路共同作用，促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，誘發(fā)慢性炎癥損害[21]。研究表明，PKC 參與細(xì)胞生長(zhǎng)與分化相關(guān)的基因表達(dá)的調(diào)控，在DME 的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，PKCβ 抑制劑的應(yīng)用能有效降低患者致盲率，緩解視網(wǎng)膜水腫[22-23]，因此，PKCβ 抑制劑廣泛應(yīng)用于治療糖尿病誘發(fā)的黃斑及視網(wǎng)膜水腫。

VEGF 是最強(qiáng)的促血管生長(zhǎng)因子，其表達(dá)水平與微血管形成數(shù)呈正相關(guān)，廣泛存在于玻璃體、視網(wǎng)膜中，正常情況下，促進(jìn)血管生成因子與抑制血管生成因子相互協(xié)調(diào)，使機(jī)體達(dá)到平衡狀態(tài)[24]。若個(gè)體長(zhǎng)期處于糖代謝紊亂狀態(tài)，正常的機(jī)體功能受損后激活PKC，活化的PKC 介導(dǎo)VEGF 生成，促使血管生成因子占據(jù)主導(dǎo)地位，抑制緊密連接的表達(dá)[25-26]。 生長(zhǎng)因子會(huì)介導(dǎo)血管通透性增大，緊密連接結(jié)構(gòu)變得紊亂無(wú)序，因此，VEGF 是破壞BRB 的重要介質(zhì)，具誘發(fā)視網(wǎng)膜水腫、血管滲漏的元兇[27]。

BRB 正常功能的發(fā)揮主要依賴(lài)于緊密連接蛋白的完整性，claudin-5、occludin 及ZO-1 是3 種研究最為廣泛的緊密連接蛋白。 其中occludin 及claudin為跨膜蛋白，同時(shí)具有胞內(nèi)環(huán)和胞外環(huán)，胞外環(huán)通過(guò)“拉鏈”狀形式連接細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞旁封閉，與胞內(nèi)ZO 蛋白共同形成緊密連接，參與維持和調(diào)節(jié)極性細(xì)胞的屏障功能[28]。 而STZ 誘導(dǎo)下會(huì)使得糖尿病大鼠視網(wǎng)膜claudin-5、occludin、ZO-1 蛋白減少，微血管通透性增大，破壞BRB 的屏障功能[15，29]。實(shí)驗(yàn)研究表明，玻璃體腔注射VEGF 抑制劑能有效抑制claudin-5、occludin 的表達(dá)下調(diào)，保護(hù)SD 大鼠的BRB功能[30]?？梢?jiàn)，糖尿病視網(wǎng)膜水腫的發(fā)生可能與高糖環(huán)境下激活PKC 信號(hào)通路相關(guān)，活化的PKC 介導(dǎo)VEGF 上調(diào)，VEGF 磷酸化緊密連接蛋白進(jìn)一步破壞BRB，通過(guò)阻斷PKC 的激活可以減少水腫的發(fā)生。

臨床研究與實(shí)驗(yàn)研究顯示，燈盞花素具有較強(qiáng)的抗新生血管的作用，能有效增加血流量，擴(kuò)張血管，降低血液黏度，抑制血小板聚集和血栓形成[31]，同時(shí)也扮演著PKC 抑制劑的重要角色[32]，為糖尿病微血管病變的治療開(kāi)辟新思路。 燈盞花素能調(diào)控人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞VEGF 及其受體VEGFR2 下游相關(guān)蛋白，阻止絲裂原活化蛋白激酶通路的激活[33]，通過(guò)抑制p-ERK、p-FAK 和p-Src 蛋白的表達(dá)[34]，發(fā)揮抑制新生血管的作用，阻止糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)一步發(fā)展，減少黃斑水腫、出血、滲出的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究通過(guò)STZ 聯(lián)合高糖高脂飼料誘導(dǎo)DM大鼠模型，并于造模后4、8 周聯(lián)合OCT、HE 染色觀察視網(wǎng)膜水腫的情況，用藥后觀察燈盞花素對(duì)STZ誘導(dǎo)糖尿病視網(wǎng)膜水腫大鼠視網(wǎng)膜組織的影響。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，用藥后視網(wǎng)膜組織以及血清中VEGF、PKCβ 的表達(dá)量不同程度下降，視網(wǎng)膜組織中occludin、claudin-5 水平上調(diào)，視網(wǎng)膜水腫得到不同程度緩解，以燈盞花素組最為明顯，說(shuō)明燈盞花素可能通過(guò)下調(diào)VEGF、PKCβ 的表達(dá)水平，同時(shí)上調(diào)claudin-5、occludin 的表達(dá)以保護(hù)BBB。

綜上所述，燈盞花素可以通過(guò)影響VEGF、PKCβ的表達(dá)量以抑制新生血管的形成，保護(hù)BBB，改善視網(wǎng)膜水腫。 燈盞花素可增加微循環(huán)，改善血管通透性，調(diào)整PKCβ、VEGF 與緊密連接相關(guān)蛋白的平衡，是燈盞花素治療糖尿病視網(wǎng)膜水腫的作用機(jī)制之一，這對(duì)于今后深入研究糖尿病視網(wǎng)膜水腫打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)象僅限于動(dòng)物，而且關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜水腫的生成因素只考慮了PKC-VEGF通路的某些蛋白，實(shí)際上其發(fā)病機(jī)制繁雜，涉及多種通路及細(xì)胞因子，是多種因素相互作用的結(jié)果。燈盞花素對(duì)STZ 誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜水腫及VEGF、PKCβ蛋白的調(diào)控具體機(jī)制亟待進(jìn)一步深入研究。