針刺調(diào)控腦缺血再灌注損傷大鼠海馬區(qū)環(huán)狀RNA_009775 表達的研究

向 靜，江姍姍，唐 紅，汪紅娟，李展富，王 瑤，謝燦明，田浩梅，陳楚淘*

湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，湖南 長沙 410208

缺血性腦卒中是因腦動脈阻塞引發(fā)腦組織受損或死亡，造成相應(yīng)功能障礙的一類臨床常見疾病。 高發(fā)病率、高致死率、高致殘率是此病的主要特征[1]，對家庭及社會造成了沉重的醫(yī)療負擔(dān)。 恢復(fù)局部血供是治療缺血性腦卒中最有效的手段，然而過程中存在再灌注引發(fā)局部損傷及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙加重的風(fēng)險[2]。 血流的再通導(dǎo)致腦組織功能不可逆損傷的現(xiàn)象，被稱為腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury, CIRI）[3]，減輕CIRI是缺血性腦卒中整體治療方案的重要組成部分。 針刺對CIRI 的療效已逐步被世界范圍內(nèi)的臨床及基礎(chǔ)研究證實[4-6]，其機制與抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)、減輕過度氧化損傷、調(diào)節(jié)細胞自噬等方面密切相關(guān)[7]，但其微觀層面的機制仍有待進一步挖掘。

隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，非編碼RNA 對基因及蛋白質(zhì)表達水平的關(guān)鍵調(diào)控作用引起人們的重視[8]。環(huán)狀RNA(circularRNA，circRNA)具有區(qū)別于其他非編碼RNA 的閉環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可抵抗RNA外切核酸酶，相較于線性RNA 更穩(wěn)定、更難以被降解。 此外，circRNA 可充當(dāng)miRNA 結(jié)合位點的競爭性內(nèi)源RNA（competitive endogenous RNA, ceRNA），間接影響miRNA 與下游mRNA 的結(jié)合，在調(diào)節(jié)基因表達中發(fā)揮重要作用[9]。 最近研究表明，相較于其他器官，circRNA 在大腦中高度富集[10]，可通過介導(dǎo)血管生成、神經(jīng)炎癥、小膠質(zhì)細胞活化和氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)途徑，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與進展[11-12]，提示circRNA 有望成為治療CIRI 的新靶點。 本研究擬采用基因芯片檢測技術(shù)，從circRNA 角度闡釋針刺抗CIRI 可能的作用機制，為治療CIRI 提供新的參考依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物與分組

SPF 級雄性SD 大鼠39 只，體質(zhì)量（230±20） g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（湘）2019-0004。 所有大鼠飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物室，室溫24～26 ℃，濕度40%～60%，通風(fēng)，實驗期間自由攝水、進食，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。 依照隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組13 只。實驗已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物福利和倫理委員會審查，批準(zhǔn)編號：LL2022030912。

1.2 主要試劑與儀器

8×15 K 規(guī)格circRNAs 芯片（美國Arraystar 公司，批號：R312-01）；circRNA 芯片標(biāo)記試劑盒（美國Arraystar 公司，批號：Human CircRNA Array V2）；（0.32±0.2） mm 線栓（北京西濃科技有限公司，批號：2432-100）；0.25 mm×13 mm 針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，批號：210501）；2%TTC 染液、4%多聚甲醛（北京索萊寶科技有限公司，批號：G3005、P1110）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白定量檢測試劑盒（武漢賽維爾生物科技有限公司，批號：G2026）。掃描儀（美國Agilent 公司，型號：G250-5C）；恒溫水浴箱（常州金壇恒豐儀器制造有限公司，型號：HH-W600）。

2 方法

2.1 模型制備

模型組與針刺組采用改良版線栓法[13]制備CIRI模型。 大鼠術(shù)前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉。以仰臥位固定大鼠于鼠板，局部消毒備皮，取頸正中線偏左側(cè)3 mm 行長約10 mm的縱向切口，鈍性剝離左側(cè)頸總動脈（common carotid artery, CCA）、頸內(nèi)動脈（internal carotid artery, ICA）、頸外動脈與迷走神經(jīng)；將線栓經(jīng)CCA 緩送入ICA 以阻斷血流，當(dāng)線栓黑色標(biāo)記點處于CCA 分叉時固定線栓，消毒縫合切口，對留于切口外的線栓進行固定和標(biāo)記。完成上述操作2 h 后，將線栓向外抽拉10 mm，實現(xiàn)缺血側(cè)的再灌注。 假手術(shù)組不插入線栓，其余操作與上述步驟相同。大鼠清醒后，采用Longa 5 分制評分法[13]對其進行評定，評分1～3 分者納入后續(xù)實驗，并對各組缺失大鼠以相同模型制備方法進行數(shù)量補齊。

2.2 分組及干預(yù)

待所有入組大鼠生命體征平穩(wěn)（約模型制備后2 h），對其進行捆綁固定。 針刺組取穴參考大鼠穴位圖譜[14]，選取大椎、百會、水溝穴，大椎直刺3 mm，百會向后平刺2 mm，水溝朝鼻中隔方向斜刺2 mm，行平補平瀉捻轉(zhuǎn)手法1 min，頻率為90 次/min，間隔15 min 行針1 次，留針30 min；假手術(shù)組與模型組僅捆綁不針刺。 每12 h 干預(yù)1 次，共7 次。

2.3 神經(jīng)功能缺損評估

分別于首次干預(yù)前、末次干預(yù)后，對3 組大鼠采用改良Garcia 評分法[15]綜合評估大鼠健側(cè)、患側(cè)比對運動、感覺及自主活動，總分18 分，分值愈低則提示神經(jīng)功能缺損愈重。

2.4 TTC 染色法

結(jié)束末次Garcia 評分后，從每組隨機選取5 只大鼠取腦組織，經(jīng)冷凍30 min 后制成約2 mm 厚的均勻切片，取相鄰5 個冠狀腦切片浸泡于2%TTC 染液的燒杯中，37 ℃恒溫水浴箱遮光孵育30 min，使其染色均勻。 完成染色后，將切片放入4%多聚甲醛固定24 h，觀察腦組織梗死情況，通過Image J 軟件量化腦梗死面積比。

2.5 篩選核心共同差異表達circRNA

從各組余下大鼠中，隨機選取3 只大鼠海馬組織，應(yīng)用Nano Drop 測定評估所提取RNA 的純度和濃度，使用RNaseR 富集circRNA；隨機引物擴增并轉(zhuǎn)錄，樣本標(biāo)記并雜交至微陣列載玻片，經(jīng)孵育、洗滌、固定后，借助G2505C 掃描儀掃描分析切片。 通過Feature Extraction 軟件提取芯片數(shù)據(jù)，Gene Spring軟件將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，參照差異倍數(shù)（fold change, FC）＞1.25、P＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn)，篩出差異表達circRNA；而后進行韋恩交集分析，選取針刺組/模型組、模型組/假手術(shù)組共同差異表達circRNA（common deferentially expressed circRNA, co-DEcircRNA）。

根據(jù)基因芯片表達譜及生物信息學(xué)分析結(jié)果，以FC＞1.25 和基因本體功能富集條目計數(shù)前2 為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出核心co-DEcircRNA。

2.6 qRT-PCR 驗證

對基因芯片檢測后余下樣本進行核心co-DEcircRNA 表達水平驗證。 實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，選擇β-actin 作為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCt法計算其表達量，各引物序列詳見表1。

表1 引物序列

2.7 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

使用TargetScan 結(jié)合miRanda 軟件，以Seq Mirna Coverage＞0.3、CeMirna Coverage＞0.3、P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，預(yù)測與核心co-DEcircRNA 可能結(jié)合的miRNA及其下游靶基因mRNA，構(gòu)建ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，通過Cytoscape 3.10 軟件將網(wǎng)絡(luò)可視化呈現(xiàn)。

2.8 靶基因本體功能富集分析

利用在線數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org）對circRNA-miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)中的下游靶基因mRNA 進行本體功能富集分析。

2.9 Western blot 法

通過Western blot 法檢測海馬區(qū)神經(jīng)元生物標(biāo)記物神經(jīng)元核抗原抗體（neuron specific nuclear protein, NEUN）相對表達量。 各組余下的5 只大鼠海馬組織加入蛋白提取液，勻漿及冰浴30 s/次，組織裂解后取上清液，BCA 蛋白定量檢測試劑盒進行目標(biāo)蛋白定量。 將同等濃度的蛋白上樣，凝膠電泳使蛋白與樣本分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，而后加一抗4 ℃孵育過夜，次日清洗后加二抗室溫下孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進行可視化。 Image J 軟件分析各條帶灰度值，以GAPDH作為參照計算NEUN 相對表達量。

2.10 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。 符合正態(tài)分布的資料以“±s”表示，組內(nèi)比較采用配對t 檢驗，組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用LSD 法，方差不齊者使用Tamhane's T2 法。 不符合正態(tài)性分布則以“M（Q）”進行描述，組內(nèi)比較使用配對秩和檢驗，組間比較采用非參數(shù)檢驗。 均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠干預(yù)前后Garcia 評分比較

干預(yù)前，與假手術(shù)組相比，模型組和針刺組Garcia評分明顯降低（P＜0.01）。 干預(yù)后，與假手術(shù)組相比，模型組評分明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組評分顯著升高（P＜0.01）。 干預(yù)后，針刺組Garcia 評分較干預(yù)前顯著升高（P＜0.01）。 詳見表2。

表2 各組大鼠干預(yù)前后Garcia 評分比較（分，±s）

表2 各組大鼠干預(yù)前后Garcia 評分比較（分，±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01；與干預(yù)前比較，&&P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組針刺組n 13 13 13干預(yù)前18.00±0.00 9.85±1.95**11.54±1.66**干預(yù)后18.00±0.00 9.92±1.19**13.62±1.50##&&

3.2 各組大鼠缺血側(cè)梗死面積比比較

TTC 染色結(jié)果如圖1 所示，假手術(shù)組未見梗死區(qū)域；模型組、針刺組切片均呈現(xiàn)不同程度的梗死區(qū)域。 通過Image J 軟件與Swanson 法量化腦梗死面積比，相較于假手術(shù)組，其余兩組腦梗死面積比顯著升高（P＜0.01）；相較于模型組，針刺組腦梗死面積比顯著降低（P＜0.01）。 詳見表3。

圖1 各組大鼠腦組織TTC 染色

表3 各組大鼠缺血側(cè)梗死面積比（%，±s）

表3 各組大鼠缺血側(cè)梗死面積比（%，±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組針刺組n555腦梗死面積比0 24.14±4.97**15.01±2.50**##

3.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織circRNA 差異表達譜及差異表達circRNA 數(shù)量

基于基因芯片檢測結(jié)果，根據(jù)FC＞1.25、P＜0.05的標(biāo)準(zhǔn)篩選組間差異表達circRNA，差異表達譜詳見圖2。 模型組與假手術(shù)組比較，差異表達circRNA為603 個；針刺組與模型組比較，差異表達circRNA為51 個。 模型組/假手術(shù)組、針刺組/模型組co-DEcircRNA 為23 個，在模型組中上調(diào)、針刺組下調(diào)的co-DEcircRNA 為7 個，在模型組中下調(diào)、針刺組上調(diào)的co-DEcircRNA 為16 個。 詳見圖3。

圖2 各組大鼠circRNA 差異表達譜

圖3 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織差異表達circRNA 韋恩圖

3.4 核心co-DEcircRNA 的篩選

以P＜0.05、FC＞1.25 為標(biāo)準(zhǔn)，對co-DEcircRNA基因本體功能富集的條目進行計數(shù)，經(jīng)篩選，circ_009775確定為核心co-DEcircRNA。 詳見表4。

3.5 qRT-PCR 驗證核心co-DEcircRNA 表達水平

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)circ_009775 表達量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組circ_009775 表達量顯著上升（P＜0.01）。詳見表5。

表5 各組大鼠缺血側(cè)海馬組織circ_009775 表達水平的比較[M（Q）]

3.6 構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA 三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

采用TargetScan 與miRanda 軟件，預(yù)測與circ_009775 可結(jié)合的miRNA 以及下游靶基因mRNA，使用Cytoscape 3.10 軟件繪制構(gòu)建了含有1 個circRNA、12 個miRNA、31 個mRNA 的三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)。詳見圖4。

圖4 circRNA-miRNA-mRNA 三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)

3.7 靶基因GO 功能富集分析

以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，對31 個靶基因進行GO 功能富集分析，發(fā)現(xiàn)富集的生物進程主要為神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元生成等；細胞成分主要為細胞質(zhì)、細胞器、突觸等；分子功能主要為蛋白質(zhì)結(jié)合、微管結(jié)合、酶結(jié)合等。 詳見圖5。

圖5 靶基因GO 功能富集分析

3.8 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)NEUN 表達比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)海馬組織NEUN 表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，針刺組NEUN 表達水平上調(diào)（P＜0.05）。 詳見表6、圖6。

圖6 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)NEUN 蛋白電泳圖

表6 各組大鼠缺血側(cè)海馬區(qū)NEUN 相對表達量的比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組針刺組n555 NEUN/GAPDH 0.66±0.10 0.31±0.19**0.55±0.21#

4 討論

在全球范圍內(nèi)，缺血性腦卒中占比腦卒中發(fā)病率的87%左右[1]，CIRI 通常繼發(fā)于缺血性腦卒中，是引起腦組織損傷與功能障礙進一步惡化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。盡管藥物與介入治療取得了一定成效，但仍存在治療窗口狹窄、增加出血風(fēng)險性等局限性[16-17]。 這促使我們深入了解CIRI 的發(fā)生發(fā)展機制，尋找有效、安全的治療策略。 中醫(yī)學(xué)將CIRI 歸于“中風(fēng)”范疇，多因風(fēng)、火、痰、瘀等病邪上擾清竅，導(dǎo)致腦絡(luò)痹阻、神失其用，病位在腦。針刺作為治療“中風(fēng)”的主要手段之一，已有數(shù)千年歷史?！安∽冊谀X，首取督脈”，腦為元神之府，督脈入絡(luò)腦，大椎、百會、水溝皆屬督脈，三穴合用可調(diào)神導(dǎo)氣以醒腦開竅，是治療缺血性腦卒中的常用腧穴[18]。 課題組前期研究表明，針刺大椎、百會、水溝穴可緩減神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的病理改變，促進神經(jīng)元的修復(fù)，激活血管內(nèi)皮生長因子，誘導(dǎo)血管新生，從而在一定程度上減輕CIRI[19]。本研究結(jié)果提示，針刺可改善CIRI 大鼠Garcia 神經(jīng)功能評分、降低缺血側(cè)的腦梗死面積、促進神經(jīng)元發(fā)育，這與先前研究報道一致[20]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，circRNA 在CIRI 發(fā)生與進展中均有異常表達，常通過ceRNA 機制途徑影響CIRI 進程[21]。CHEN 等[22]研究表明，circSHOC2 在體外氧-糖剝奪缺血模型與大腦中動脈閉塞小鼠模型中的過表達，可通過海綿miR-7670-3p 促進去乙酰化酶1 的表達，進而減輕缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡。 此外，BAI等[23]通過基礎(chǔ)與臨床研究發(fā)現(xiàn)，circDLGAP4 作為內(nèi)源性miR-143 海綿抑制其活性， 調(diào)節(jié)HECT-E3 型泛素連接酶的表達水平， 以減輕CIRI 對血腦屏障的損傷。 本研究中，通過芯片檢測技術(shù)發(fā)現(xiàn)3 組大鼠海馬區(qū)circRNA 表達的改變，其中23 個circRNA共同在模型組/假手術(shù)組、針刺組/模型組中發(fā)生了改變，提示針刺對CIRI 的治療機制可能與這類基因的表達變化相關(guān)。 而后qRT-PCR 法對篩選出的核心co-DEcircRNA 驗證結(jié)果顯示，circ_009775 的表達趨勢與芯片結(jié)果一致，提示針刺對circ_009775 的上調(diào)涉及抗CIRI 過程，是可能的治療靶點之一。為明確circ_009775 潛在的分子調(diào)控機制， 本研究預(yù)測并構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，對下游mRNA 的GO 功能富集結(jié)果顯示其與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元生成等生物進程密切相關(guān)。 良好的神經(jīng)元發(fā)育是CIRI 后神經(jīng)功能恢復(fù)的必要條件，本研究中對神經(jīng)元生物標(biāo)記物的檢測顯示， 針刺組NEUN 表達水平明顯高于模型組， 說明針刺具有一定的神經(jīng)元保護作用，與上述GO 功能富集分析有一致的部分。

綜上所述，本研究從circRNA 的角度闡釋了針刺抗CIRI 的另一潛在效應(yīng)機制，可能與激發(fā)多種ciriRNA 的改變有關(guān)，通過介導(dǎo)以circ_009775 為中心的circRNA-miRNA-mRNA 三元轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)元生成過程發(fā)揮其治療效應(yīng)，從而改善CIRI 大鼠的神經(jīng)功能缺損、縮小腦梗死面積、促進CIRI 海馬區(qū)的神經(jīng)元修復(fù)，為揭示針刺多靶點、多途徑治療CIRI 的作用機制提供了理論依據(jù)。