丹潤方HPLC 指紋圖譜及多成分含量測定研究

吳淑輝，劉 娟，肖 婷，鄭慧娥，朱明芳，2*

1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005；2.血管生物學與轉(zhuǎn)化醫(yī)學湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208

丹潤方（專利號：201510648346.6）是湖南省中醫(yī)院朱明芳教授在國家級名中醫(yī)歐陽恒教授“以皮治皮”理論指導下，結(jié)合其近30 年臨床工作經(jīng)驗，對多種藥物進行反復(fù)篩選化裁，最終形成的一種天然中草藥面膜[1]，主要由石榴皮、忍冬藤、白芷、烏梅組成，廣泛用于痤瘡、玫瑰痤瘡、黃褐斑及色素沉著性疾病的治療[2-3]。 現(xiàn)代藥理學研究表明，丹潤方組成具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)皮脂代謝紊亂、抗氧化、抑制黑色素形成等作用[2，4-5]。 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，丹潤方可明顯降低痤瘡患者皮損積分，降低痤瘡患者復(fù)發(fā)率，同時因其具備美白潤膚、提亮膚色功效，故名曰丹潤[6]。 丹潤方為湖南省科技進步獎科技成果轉(zhuǎn)化產(chǎn)品，在湖南省中醫(yī)院、衡陽市中醫(yī)院等多家三甲醫(yī)院廣泛應(yīng)用。然而，目前對于丹潤方的質(zhì)量控制主要集中于各單味藥，尚缺乏全方整體性質(zhì)量控制的方法。中藥指紋圖譜指中藥經(jīng)適當處理后，采用一定的分析方法得到的能夠體現(xiàn)中藥整體特性的圖譜，能夠反映中藥多成分特點，整體評價中藥質(zhì)量，確保其內(nèi)在質(zhì)量的均一、穩(wěn)定，可用于中藥材、飲片、提取物或中間體、成方制劑的質(zhì)量控制[7]。 此外，研究表明丹潤方酸類成分含量豐富，是其主要的功效成分之一，綠原酸、沒食子酸具有抗氧化、抗炎、抗衰老等功效[8-9]；鞣花酸可顯著抑制酪氨酸酶活性，具有抗炎、抗衰老、美白等功效[10-11]。 基于此，本研究以丹潤方為研究對象，建立其HPLC 指紋圖譜，結(jié)合化學模式識別技術(shù)分析圖譜信息，并在同樣的色譜條件下測定其3 種有效成分含量，將指紋圖譜與多成分定量分析相結(jié)合，以期完善丹潤方整體質(zhì)量評價方法，為丹潤方的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；Agilent 5 TC-C18型色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司）；JY5002型電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；AL204 型萬分之一天平、XSR205DU 型十萬分之一電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；SB-3200D 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9145A 型真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；HH-S8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 主要試劑及藥物

乙腈（色譜純，批號：32Y1612PT，美國ASC Grace化工科技有限公司）；甲醇（分析純，批號：20190328）、磷酸（分析純，批號：20210220）均購自國藥集團化學試劑有限公司；鞣花酸（純度88.8%，批號：111959-201903）、沒食子酸（純度91.5%，批號：110831-201906）、綠原酸（純度96.1%，批號：110753-202018）均購自中國食品藥品檢定研究院。15 批丹潤方組成藥物均由湖南中醫(yī)藥大學聶孝平教授鑒定，其藥物來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 15 批丹潤方浸膏樣品制備

對制備的15 批白芷、烏梅、石榴皮、忍冬藤中藥飲片進行編號并排序，通過隨機數(shù)字表法組合出15批全方，制備15 批丹潤方樣品，見表2。每批按照原處方稱取白芷10 g、烏梅10 g、石榴皮10 g、忍冬藤10 g，加入8 倍水浸泡30 min，加熱至沸騰，60 ℃保持微沸回流提取30 min，過濾；濾渣加6 倍水加熱至沸騰，60 ℃保持微沸回流提取30 min， 過濾合并2次濾液，濃縮至約100 mL，于恒溫水浴鍋中水浴蒸干后，置真空干燥箱干燥，得丹潤方浸膏備用。

2.2 對照品及供試品溶液制備

混合對照品溶液制備：精密稱定各對照品適量，加入甲醇，制成含沒食子酸、鞣花酸、綠原酸0.400、0.540、0.044 mg/mL 的混合對照品儲備液。

供試品溶液制備：精密稱定丹潤方浸膏0.500 0 g，置具塞錐形瓶中，加入25 mL 60%甲醇，超聲30 min，放冷，60%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm 濾膜，即得。

2.3 色譜條件

采用Agilent 5 TC-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫（0～10 min，90% A，10% B；10～25 min，10% A，90% B；25～45 min，12% A，88% B；45～60 min，20% A，80% B；60～65 min，40% A，60% B；65～70 min，50% A，50% B）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長315 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度考察 隨機選取1 批丹潤方浸膏，按“2.2”方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6 次，以峰面積較大、分離度較好的9 號峰作為參照，計算相對保留時間的相對標準偏差（relative standard deviation,RSD）范圍為0.039%～0.153%，相對峰面積RSD范圍為0.293%～4.109%，表明儀器精密度良好。詳見表3—4。

表3 丹潤方相對峰面積精密度考察

2.4.2 重復(fù)性考察 隨機選取1 批丹潤方浸膏，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，以峰面積較大、分離度較好的9 號峰作為參照，計算各共有峰的相對保留時間RSD 范圍為0.088%～0.378%，相對峰面積RSD 范圍為0.125%～6.602%。 詳見表5—6。

表5 丹潤方相對峰面積精密度考察

表6 丹潤方相對保留時間精密度考察

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液按“2.3”色譜方法于0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖，以峰面積較大、分離度較好的9 號峰作為參照，計算各共有峰的相對保留時間RSD 范圍為0.059%～0.551%，相對峰面積RSD 范圍為1.534%～5.872%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。 詳見表7—8。

表7 丹潤方相對峰面積穩(wěn)定性考察

表8 丹潤方相對保留時間穩(wěn)定性考察

2.5 指紋圖譜建立及相似度評價

取S1～S15 批丹潤方浸膏樣品，按“2.2”項制備相應(yīng)供試品溶液，按“2.3”色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖，精密吸取沒食子酸、綠原酸、鞣花酸的對照品溶液，按“2.3”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，標定峰3 為沒食子酸，峰10 為綠原酸，峰14 為鞣花酸。 采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）進行分析，選定參照圖譜后，采用中位數(shù)法，時間窗寬度設(shè)置為0.3 min，經(jīng)多點校正后，進行Mark譜匹配，生成丹潤方共有模式的對照指紋圖譜（圖1），共標定丹潤方19 個共有峰，15 批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.938～0.990，各批次間樣品相似度均＞0.8（表9），表明各批次相似度較高，所建立的指紋圖譜可以較全面地反映丹潤方整體成分。

表9 15 批樣品指紋圖譜相似度

2.6 化學計量學分析

2.6.1 聚類分析 將15 批丹潤方共有峰面積導入SPSS 22.0，以組間均連法及平方距離作為度量標準對其進行聚類分析，結(jié)果顯示，當度量距離為15 時，15 批丹潤方可以分為兩類：其中S2、S3 為一類，余下批次聚為一類（圖2）。 這表明即使在指紋圖譜相似度較好的情況下，不同批次藥材質(zhì)量仍存在一定差異。

圖2 15 批樣品聚類分析

2.6.2 主成分分析 將15 批丹潤方共有峰面積導入SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析，得到15 批丹潤方得分圖及載荷圖（圖3—4），從得分圖可以看出15 批樣品可以分為兩類，其中S2、S3 聚為一類，余下聚為一類，與聚類分析結(jié)果一致，從載荷圖可以看出成分3、12、7、14 對丹潤方質(zhì)量影響較大。

圖3 15 批樣品得分圖

圖4 15 批樣品載荷圖

2.6.3 差異成分分析 為進一步明確對樣品分類貢獻較大的成分，采用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis, OPLS-DA）擬合模型，結(jié)合變量重要性投影（variable importance projected value, VIP）篩選出導致樣品分類影響較大的差異性成分（圖5）。 其中具有統(tǒng)計學意義且VIP>1.0 的峰有6 個，按VIP 大小排列為：峰3、峰7、峰12、峰14、峰5、峰1、峰9，其中峰14 為鞣花酸。

圖5 VIP 圖

2.7 3 種成分含量測定

2.7.1 精密度考察 精密吸取“2.2”項混合對照品溶液，按“2.3”項色譜條件連續(xù)進樣6 次，記錄色譜圖，測得沒食子酸、綠原酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為0.26%、0.34%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.7.2 重復(fù)性考察 隨機選取1 批丹潤方浸膏，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，測得沒食子酸、綠原酸、鞣花酸峰面積RSD 分別為0.16%、0.37%、0.28%。2.7.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液按“2.3”色譜方法于0、2、4、8、12、24 h 進樣，記錄色譜圖，測得沒食子酸、 綠原酸、 鞣花酸峰面積RSD 分別為0.18%、0.09%、0.35%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.4 線性關(guān)系考察 取適量“2.2”制備的混合對照品儲備液，過0.45 μm 濾膜，精密吸取混合對照品1、2、4、6、8、10 μL，按“2.3”項色譜條件進樣分析。 以對照品溶液質(zhì)量為橫坐標，對照品峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。 詳見表10。

表10 3 種成分線性方程

2.7.5 加樣回收實驗 精密稱定6 份已測定指標成分含量的樣品各0.500 0 g，加入各對照品適量，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄各色譜峰峰面積，計算得到的平均加樣回收率分別109.73%、102.02%、101.88%。RSD 分別為1.01%、0.52%、0.27%。

2.7.6 樣品含量測定 取S1～S15 批丹潤方浸膏樣品，按“2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.3”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，根據(jù)標準曲線計算樣品中各成分質(zhì)量分數(shù)，結(jié)果見表11。

表11 15 批丹潤方各成分質(zhì)量分數(shù)

3 討論

丹潤方由石榴皮、忍冬藤、白芷、烏梅組成。 石榴皮，味酸澀，《本草撮要·果部》記載其“入手太陰足少陰經(jīng)”，可“涂瘡拔毒”，亦有記載其“入手陽明大腸”，肺與大腸相表里。 《醫(yī)學啟源·肺之經(jīng)》云：肺之經(jīng)“外養(yǎng)皮毛，內(nèi)榮腸胃，與大腸為表里，手太陰（陽明）是其經(jīng)也”，肺在體合皮，其華在毛，皮膚病多可責之于肺，選用入肺經(jīng)之藥能直達病所[12]。 “藥之為枝者達四肢，為皮者達皮膚”，基于“同氣相求”原理，選用動物或植物的皮部入藥，相互感應(yīng)，奏“以皮達皮”“因病在皮，以皮行皮”“以皮治皮”之效[13]。 忍冬藤，又名金銀花藤，味甘，性寒，歸肺、胃經(jīng)，具有清熱解毒、消紅活血、通絡(luò)散結(jié)的功效，是外用的良藥。白芷，“長肌膚，潤澤顏色，可作面脂”，具有潤澤顏面、祛斑增白之功效[14]。 烏梅，味酸，性溫，歸肝、脾、肺、大腸經(jīng)，可“去青黑痣”。 四藥相伍，共奏活血行氣通絡(luò)之功，起潤澤顏面、祛斑美白之效。 現(xiàn)代藥理學研究表明，丹潤方主要由黃酮類、有機酸類、多酚類組成[15-17]，其中，沒食子酸、綠原酸、鞣花酸等酸類成分具有抗氧化、抗衰老、抗炎等藥理作用，可作為天然氧自由基清除劑應(yīng)用于化妝品中[16，18]。 研究顯示，鞣花酸可清除自由基，參與抗氧化防御相關(guān)酶的表達、 增強抗氧化酶活性及基因表達來達到抗氧化目的[19]；此外，鞣花酸能抑制酪氨酸酶，從而減少黑色素的形成[20]。沒食子酸，可阻止自由基對脂肪酸分子中雙鍵的進攻來發(fā)揮抗氧化作用[21]。 綠原酸則可通過抑制脂質(zhì)過氧化，上調(diào)過氧化物分解酶活性，發(fā)揮抗氧化作用[22]。

由于丹潤方化學成分復(fù)雜，部分化學成分結(jié)構(gòu)相似，色譜峰易重疊，增加了指紋圖譜的建立難度，為使丹潤方各組分成分較好分離，在指紋圖譜的建立過程中，綜合考慮圖譜信息量、色譜峰響應(yīng)和分離效果，考察了安捷倫Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、依利特Supersil ODS2色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters XBridge R○C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對丹潤方色譜圖的影響，結(jié)果表明，安捷倫Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱峰形對稱、分離度較好、穩(wěn)定性較好，故本研究選用Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱。 同時，考察了280、315、323、327、350、360 nm 不同波長及不同流動相甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液對丹潤方色譜圖的影響，結(jié)果表明以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相，檢測波長為315 nm 時，各色譜峰分離效果較好，峰形較好，且基線較為平穩(wěn)。

中藥多指標成分整體質(zhì)量控制已成為中藥質(zhì)量控制的必然發(fā)展趨勢[23]，中藥指紋圖譜能夠反應(yīng)方劑所含成分，可揭示成分的特征性、溯源性及可測性，具有整體性與動態(tài)性的特點，是一種有效的質(zhì)量評價方法[24]。 本研究構(gòu)建了15 批丹潤方HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)共有峰19 個，15 批樣品指紋圖譜與對照圖譜的相似度為0.938～0.990，各批次間樣品相似度大于0.9，提示不同批次丹潤方整體質(zhì)量較穩(wěn)定。通過聚類分析、主成分分析等化學計量學分析發(fā)現(xiàn)，15批丹潤方可以大致分為兩類，這表明不同批次共有成分存在一定差異，影響各批次間差異的主要峰有峰3、峰7、峰12、峰14、峰5、峰1、峰9，其中峰14為鞣花酸，這可能與不同產(chǎn)地藥材的含量差異有關(guān)。此外，本研究建立了沒食子酸、綠原酸、鞣花酸3 種有效成分的含量測定方法，將指紋圖譜與多成分定量分析相結(jié)合，可為丹潤方質(zhì)量評價的整體性及準確性提供科學依據(jù)。