參苓白術(shù)散調(diào)控TLR4/NF-κB 通路抑制LPS 誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎性損傷的機(jī)制

黃 娟，王一陽，肖 凡，劉 秀，喻 嶸*

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病主要的心血管并發(fā)癥之一，是糖尿病患者心力衰竭高發(fā)生率和高死亡率的主要病因[1-2]。 目前，DCM 的發(fā)病機(jī)制及診治方面的研究尚有許多未知領(lǐng)域和難點(diǎn)。 近年研究認(rèn)為，DCM 是心肌在長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下發(fā)生的一種慢性炎癥性疾病[3]。 研究報(bào)道，糖尿病患者的血清和糖尿病動(dòng)物模型的心肌組織中，多種炎癥因子的表達(dá)水平顯著升高[4-5]。因此，早期抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)是防治DCM 的一個(gè)新靶點(diǎn)。 Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4, TLR4）作為炎癥反應(yīng)的重要受體及機(jī)體免疫防御系統(tǒng)中的重要組成，是免疫反應(yīng)與慢性炎癥的橋梁[6]。 但TLR4是否介導(dǎo)DCM 早期炎癥損傷的發(fā)生發(fā)展，需要進(jìn)一步探究。

新近研究表明，腸道菌群具有內(nèi)分泌器官的特征，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體代謝及免疫炎癥反應(yīng)影響糖尿病心肌病的病理進(jìn)程[7]。 腸道微生物群落參與機(jī)體免疫細(xì)胞的分化成熟，生理狀態(tài)下，腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整并通過宿主模式識(shí)別受體，調(diào)控菌群結(jié)構(gòu)，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)；當(dāng)腸黏膜屏障損傷時(shí)，通透性增加，大量促炎物質(zhì)[如脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）]通過通透性升高的腸屏障進(jìn)入血液循環(huán)到達(dá)心臟組織，直接激活TLR4 相關(guān)通路，誘導(dǎo)病原相關(guān)模式分子信號(hào)活化，觸發(fā)局部炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)；另一方面，心肌細(xì)胞功能缺失，并出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡，與黏附因子相互作用產(chǎn)生炎癥效應(yīng)，引起心肌纖維化及心室重構(gòu)等病理狀態(tài)出現(xiàn)[8-9]。 前期臨床研究表明，以益氣健脾立法組方的參苓白術(shù)散可調(diào)節(jié)糖脂代謝，對(duì)心血管疾病療效確切[10]。 同時(shí)，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其可改善脂代謝和減少腸道炎癥因子釋放，減緩血管病變的風(fēng)險(xiǎn)，抑制免疫炎癥反應(yīng)過度損傷，但其靶向調(diào)控心血管的機(jī)制需要進(jìn)一步研究[11-12]。 故本研究進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，擬以心肌細(xì)胞作為研究對(duì)象，從免疫炎癥角度出發(fā)，探討參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)腸道代謝物L(fēng)PS 介導(dǎo)的TLR4/核因子κB（nu clear factor-κB, NF-κB）信號(hào)通路及炎癥相關(guān)因子白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞株

20 只8 周齡SD 雄性大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)；溫度（22±2） ℃，濕度50%～65%，自由飲食、飲水，12 h/12 h光/暗周期（光照時(shí)間為6:00～18:00）。 本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：430727221101382931。 大鼠H9C2 心肌細(xì)胞（批號(hào)：CL-0089），購自武漢普諾賽生物科技有限公司。

1.2 藥物

參苓白術(shù)散由人參、茯苓、白術(shù)（炒）、山藥、白扁豆（炒）、蓮子、薏苡仁（炒）、砂仁、桔梗、甘草組成，批號(hào)：22101037，國藥準(zhǔn)字號(hào)：Z110020755，購自北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（批號(hào)：SA210518）、胰蛋白酶-EDTA消化液（批號(hào)：WH0221A171）、高糖DMEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：WH0022P299）、PBS 緩沖液（批號(hào)：AD17792273）、CCK-8 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：AI07246697）、無血清細(xì)胞凍存液（批號(hào)：WH0221A091）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；兔抗TLR4 多克隆抗體（批號(hào)：ab13556）、兔抗核因子κB p56（nuclear factor-κB p56,NF-κB p56）單克隆抗體（批號(hào)：ab207297）、兔抗NFκB 抑制蛋白α（degradation of protein κB-α, IκBα）單克隆抗體（批號(hào)：ab32518）；兔抗TNF-α 單克隆抗體（批號(hào)：ab215188）、兔抗IL-1β 單克隆抗體（批號(hào)：ab234437）均購自英國Abcam 公司。

SW-CJ-2G 型超凈工作臺(tái)（美國Thermo Scientific 公司）；TGL-18R型冷凍高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；YP1002N 型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；EnSpire2300 型多功能酶標(biāo)分析儀（新加坡PerkinElmer 公司）；JSM-6700F 型掃描顯微鏡（日本Jeol 公司）。

2 方法

2.1 含藥血清制備

將20 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成2 組：空白血清組、參苓白術(shù)散含藥血清組，每組10只。 給藥劑量為等效劑量的5 倍，依據(jù)體表面積方法換算[13]，參苓白術(shù)散含藥血清組大鼠用藥劑量=（5×12 g×6.3）/70 kg=5.4 g/kg，給予參苓白術(shù)散藥液灌胃；空白血清組采用等容量的滅菌超純水灌胃，每日1 次，連續(xù)7 d。 末次灌胃1 h 后，腹主動(dòng)脈取血，用含肝素抗凝管收集血液，靜置3 h 后；以3 000 r·min-1離心（離心半徑10 cm）15 min，收集上層血清，0.22 μm一次性濾過器過濾，56 ℃恒溫水浴鍋滅活30 min；將滅活的血清分裝至無菌EP 管中標(biāo)記，置于-80 ℃保存。

2.2 含藥血清濃度篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2 細(xì)胞接種于96 孔板中，按照每孔100 μL、每孔5×103個(gè)細(xì)胞，在5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，設(shè)空白對(duì)照組、空白血清組及含藥血清組，設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%的濃度梯度。 培養(yǎng)24 h 后，吸棄上清液，每孔加入CCK-8 溶液10 μL 及完全培養(yǎng)基90 μL，2 h 后用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)各組細(xì)胞的OD 值。

2.3 細(xì)胞分組及處理

H9C2 細(xì)胞用10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于6 孔板中，予以10 μg/mL LPS 干預(yù)處理24 h 后收集細(xì)胞。隨機(jī)分成空白血清組（10%空白血清）、模型組（10 μg/mL LPS+10%空白血清）、參苓白術(shù)散含藥血清組（10 μg/mL LPS+10%參苓白術(shù)散含藥血清）及TAK-242組（10 μg/mL LPS+5 μmol/L TAK-242[14]）。

2.4 CCK-8 法篩選含藥血清干預(yù)濃度

H9C2 細(xì)胞以5×104mL-1密度接種至96 孔板中，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；吸棄培養(yǎng)基后，分別加入稀釋后的胎牛血清、空白血清及含藥血清，每組設(shè)置5%、10%、15%、20%、25%的濃度梯度，每組均設(shè)6 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)處理24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液及90 μL 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育2 h 后采用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各組細(xì)胞的OD 值。

2.5 ELISA 法檢測(cè)細(xì)胞IL-1β、TNF-α 含量

取生長(zhǎng)良好的H9C2 細(xì)胞按照分組干預(yù)后，吸取細(xì)胞上清液，以3 000 r·min-1（離心半徑15 cm）離心20 min，取上清液檢測(cè)。 分別設(shè)空白孔、待測(cè)樣品孔。 在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測(cè)樣品10 μL。將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻；每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL，空白孔除外；用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min；棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s 后棄去；每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min；加終止液50 μL，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，450 nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的OD 值，計(jì)算IL-1β、TNF-α 含量變化。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)

將H9C2 細(xì)胞按照每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于含細(xì)胞爬片的6 孔板。按照分組加入相應(yīng)藥物干預(yù)，培養(yǎng)24 h 后，以4%預(yù)冷的多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定（15 min），PBS 溶液洗3 遍后加入5% BSA 封閉30 min，加入稀釋的IL-1β、TNF-α（1∶50）一抗孵育過夜；滴加稀釋的IgG/FITC 二抗孵育60 min；洗滌后復(fù)染核，然后進(jìn)行封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.7 Western blot 法檢測(cè)TLR4、NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)

將H9C2 細(xì)胞以5×105/mL 的細(xì)胞密度接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，按照分組加入相應(yīng)藥物干預(yù)，培養(yǎng)24 h 后，棄培養(yǎng)上清液，用PBS 洗滌2次，加入適量RIPA 裂解液重懸；低溫下勻漿后將樣品轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，以12 000 r·min-1（離心半徑10 cm）離心5 min，取上清液分裝。 采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜切膠后封閉，加入一抗TLR4（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶1 000）抗體，4 ℃下孵育過夜；PBST洗膜3 次，加入HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（1∶5 000）、山羊抗兔IgG（1∶5 000）二抗，室溫孵育90 min。PBST洗膜3 次，ECL 顯色液中顯影1 min，沖洗膠片、掃描。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 計(jì)量資料滿足正態(tài)性和方差齊性者用“±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較用LSD 檢驗(yàn)；不滿足正態(tài)性和方差齊性者用Tamhane's T2 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)H9C2 細(xì)胞增殖的影響

與空白對(duì)照組相比，參苓白術(shù)散含藥血清組及空白血清組在10%濃度水平的OD 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而參苓白術(shù)散血清濃度為5%、15%、20%、25%時(shí)，OD 值明顯降低，細(xì)胞增殖受到抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 結(jié)果表明，10%參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)H9C2 細(xì)胞無明顯毒性作用，故以此濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)含藥血清的干預(yù)濃度。詳見圖1。

圖1 各組H9C2 細(xì)胞增殖情況比較（±s，n=6）

3.2 參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)H9C2 細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 水平的影響

與空白血清組相比，模型組H9C2 細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1β 含量增加（P＜0.01）。 與模型組相比，參苓白術(shù)散含藥血清組及TAK-242 組細(xì)胞中的TNF-α、IL-1β 含量顯著降低（P＜0.01）。 詳見圖2。

圖2 各組H9C2 細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 水平比較（±s，n=6）

3.3 參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)H9C2 細(xì)胞IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)的影響

與空白血清組比較，模型組H9C2 細(xì)胞的IL-1β、TNF-α 的平均OD 值明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，參苓白術(shù)散含藥血清組及TAK-242 組細(xì)胞的IL-1β、TNF-α 平均OD 值明顯下降（P＜0.01）。 詳見圖3。

圖3 各組H9C2 細(xì)胞IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

3.4 參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)H9C2 細(xì)胞TLR4、NFκB p65、IκBα 蛋白表達(dá)的影響

與空白血清組相比，模型組H9C2 細(xì)胞內(nèi)TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。 與模型組相比，參苓白術(shù)散含藥血清組及TAK-242 組細(xì)胞的TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)減少（P＜0.01）。詳見圖4。

圖4 各組H9C2 細(xì)胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)比較（±s，n=6）

4 討論

據(jù)最新國際糖尿病聯(lián)盟的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球約有4.25 億糖尿病患者，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，預(yù)計(jì)到2045 年將達(dá)到7 億[15]。持續(xù)的血糖增高可誘導(dǎo)機(jī)體代謝紊亂、免疫炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激等多種病理狀態(tài)出現(xiàn)，引起機(jī)體組織及細(xì)胞的損傷，而糖尿病心血管并發(fā)癥是糖尿病患者的主要死亡原因[16]。DCM 是糖尿病常見并發(fā)癥之一，是獨(dú)立于冠心病及高血壓的特異性心肌病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。糖尿病心肌病既有“消渴”癥狀，也存在“心病”表現(xiàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，先天不足或后天失養(yǎng)及他臟病變累及脾胃，可導(dǎo)致其胃火偏盛，脾陰虧損，運(yùn)化不能，氣機(jī)失暢，水谷精微疏布失常，痰濁內(nèi)生。病程遷延不愈，氣陰耗傷，久病內(nèi)舍于心，心氣不足，運(yùn)血無力，心陰虧虛，則燥熱內(nèi)盛，暗耗心血，瘀滯內(nèi)生。 脾不散精是DCM 的中醫(yī)病機(jī)關(guān)鍵，故選用參苓白術(shù)散，探究從脾治心的科學(xué)內(nèi)涵。 方中君藥人參、白術(shù)、茯苓益氣健脾，滲濕化濁；臣以蓮子、山藥補(bǔ)氣生津；合用白扁豆、薏苡仁、砂仁健脾滲濕，行氣化滯；桔梗宣通肺氣，載藥上行于心肺為佐；甘草健脾和中，調(diào)和諸藥。 全方以補(bǔ)中氣、滲濕濁、行氣滯為要。 近年來，隨著腸道微生態(tài)相關(guān)內(nèi)容的研究深入，發(fā)現(xiàn)腸道菌群與DCM 的發(fā)生密切相關(guān)[17-18]。 腸道菌群與宿主免疫系統(tǒng)相互協(xié)調(diào)平衡，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。 正常狀態(tài)下，腸道屏障功能能夠抑制病原微生物的蓄積及移位，并通過宿主模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor, PRR）感知微生物的異?；顒?dòng)，激活免疫反應(yīng)識(shí)別清除；而病理情況下，出現(xiàn)腸道滲漏、腸屏障功能降低、腸道通透性升高，伴隨腸道菌群豐度及結(jié)構(gòu)變化，可觸發(fā)局部炎癥反應(yīng)，大量釋放的炎癥因子可進(jìn)入循環(huán)，發(fā)生移位，靶向損傷心肌細(xì)胞[19-20]。微生物相關(guān)模式分子和LPS 是腸道菌群與宿主相互作用的主要介質(zhì)，可與PRR 識(shí)別結(jié)合，直接作用于免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)DCM 的發(fā)生發(fā)展。

TLR4 是一種廣泛表達(dá)于心肌細(xì)胞表面的PRR，可響應(yīng)不同病原相關(guān)分子模式，啟動(dòng)識(shí)別、靶向結(jié)合并誘導(dǎo)一系列的信號(hào)傳輸，在機(jī)體內(nèi)環(huán)境免疫炎癥調(diào)控中具有重要作用，與心血管疾病緊密相關(guān)[21-22]。 持續(xù)的代謝紊亂狀態(tài)及氧化應(yīng)激可觸發(fā)機(jī)體免疫炎癥反應(yīng)，TLR4 可識(shí)別并激活機(jī)體的免疫細(xì)胞，促使炎癥介質(zhì)及趨化因子釋放，同時(shí)活化經(jīng)典的下游炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB。 在靜息狀態(tài)下，NF-κB 常以2 個(gè)亞單位p65 和p50 結(jié)合成異源二聚體，與IκB 抑制蛋白家族結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的三聚體，存在于細(xì)胞質(zhì)中[23-24]。IκBα 是IκB 家族中的一員，是NF-κB 蛋白的主要抑制劑，當(dāng)受到細(xì)胞外信號(hào)刺激時(shí)，IκBα 發(fā)生泛素化、磷酸化并降解，IκB從三聚體中解離出來，釋放p65/p50，進(jìn)行核移位，使其移至細(xì)胞核與靶基因啟動(dòng)區(qū)或增強(qiáng)子的NFκB p65 位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)IL-6、IL-8、TNF-α 等促炎因子的表達(dá)[25-26]。 IL-1β、TNF-α 可協(xié)同介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大[27]。 IL-1β 是炎性反應(yīng)啟動(dòng)因子，應(yīng)激狀態(tài)下，以前體形式剪切活化，IL-1β 釋放增加可促進(jìn)血管細(xì)胞分泌大量的黏附因子，介導(dǎo)氧自由基及炎性遞質(zhì)蓄積[28]。 同時(shí)，可上調(diào)TNF-α 的合成與表達(dá)，激活凋亡通路，加快心肌細(xì)胞凋亡[29-30]。 本研究以LPS 作為誘導(dǎo)劑，模擬“腸漏”狀態(tài)下，LPS 通過循環(huán)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞炎癥損傷的過程。 采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，篩選含藥血清濃度，10%參苓白術(shù)散含藥血清對(duì)細(xì)胞增殖狀態(tài)無明顯影響，故選做實(shí)驗(yàn)含藥血清干預(yù)濃度。 研究結(jié)果顯示，參苓白術(shù)散含藥血清可有效抑制H9C2 細(xì)胞中TNF-α、IL-1β 的含量，降低炎癥因子的釋放。 H9C2 細(xì)胞在LPS 刺激后，可激活炎癥相關(guān)通路，參與細(xì)胞炎性損傷過程。 本研究中，與空白血清組比較，LPS 誘導(dǎo)的模型組H9C2 細(xì)胞TLR4、NF-κB p65、IκBα 及TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，繼發(fā)的炎性反應(yīng)明顯。 而參苓白術(shù)散含藥血清可抑制TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)，其中NF-κB p65 活化后的核移位效應(yīng)可促進(jìn)成熟的IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)變化，并促進(jìn)其分泌至細(xì)胞外，引起炎性反應(yīng)，其作用效應(yīng)與TLR4 抑制劑相當(dāng)。 參苓白術(shù)散含藥血清組IL-1β、TNF-α 蛋白表達(dá)差異與TLR4、NF-κB p65、IκBα 的結(jié)果具有一致性。

綜上所述，參苓白術(shù)散含藥血清可能通過細(xì)胞炎癥信號(hào)通路TLR4/NF-κB，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β 的釋放與表達(dá)，阻斷慢性炎性反應(yīng)的持續(xù)過程，維持心肌細(xì)胞正常功能狀態(tài)。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證參苓白術(shù)散通過抑制炎癥機(jī)制調(diào)控LPS 對(duì)心肌細(xì)胞的損傷效應(yīng)，為臨床診療DCM 的應(yīng)用提供依據(jù)。