燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球質(zhì)量評(píng)價(jià)

羅 田，賀智勇，茅向軍，2，沈祥春，陶 玲*，許乾麗，3*

［1.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州省天然藥物資源高效利用工程中心（貴州省高等學(xué)校天然藥物藥理與成藥性評(píng)價(jià)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州醫(yī)科大學(xué)-貴陽(yáng)市聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天然藥物資源優(yōu)效利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省藥品監(jiān)督管理局檢查中心，貴州 貴陽(yáng) 550081； 3.貴州省食品檢驗(yàn)檢測(cè)院，貴州 貴陽(yáng) 550004］

藥品質(zhì)量檢驗(yàn)方法是保證藥品合格性的關(guān)鍵［1］，進(jìn)一步發(fā)展藥品質(zhì)量檢驗(yàn)方法具有一定意義。燈盞花乙素是從菊科植物燈盞花中提取出的主要活性成分［2］，具有抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮等作用［3-5］，可用于治療各種心腦血管疾?。?-8］。但該成分脂水溶解性差，生物利用度低，導(dǎo)致相關(guān)傳統(tǒng)劑型限制了其臨床應(yīng)用。

脂微球遞送系統(tǒng)是平均粒徑為200 nm 的亞微乳遞送系統(tǒng)，作為一種新型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)具有選擇性蓄積于炎癥部位的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)［9］。課題組前期根據(jù)文獻(xiàn)［10-12］ 報(bào)道，先將燈盞花乙素制成磷脂復(fù)合物以提高其脂溶性，再進(jìn)一步將其制成脂微球，以期為開發(fā)可更好透過(guò)血腦屏障的相關(guān)制劑提供參考。

另外，乳劑中游離脂肪酸過(guò)高會(huì)導(dǎo)致心力衰竭、高血壓、2 型糖尿?。?3-15］； 油相容易氧化產(chǎn)生過(guò)氧化物，破壞人體細(xì)胞膜的正常生理功能，引發(fā)安全問(wèn)題［16］，故游離脂肪酸含量、過(guò)氧化值、甲氧基苯胺值等是衡量脂肪乳質(zhì)量的重要指標(biāo)。為了保障燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球安全性，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定上述指標(biāo)以建立該制劑質(zhì)量控制方法。

1 材料

85-2B 型恒溫加熱磁力攪拌器（金壇市科析儀器有限公司）； ME104/02 型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］； PB-10 型PH 計(jì)（德國(guó)賽多利斯公司）；BS-223S 型電子天平 （北京賽多利斯儀器有限公司）；KQ3200 型超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；UltiMate 3000 型高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher 公司）； NanoBrook 90Plus PALS 型激光粒度儀（美國(guó)布魯克海文儀器公司）。

燈盞花乙素對(duì)照品（成都克洛瑪生物科技有限公司，批號(hào)CHB18060，純度≥95%）。注射用大豆磷脂、蛋黃卵磷脂（上海太偉藥業(yè)股份有限公司）； 注射用中鏈脂肪酸甘油三酯、注射用甘油（浙江遂昌惠康藥業(yè)有限公司）；注射用大豆油（浙江田雨山藥用油有限公司）； 泊洛沙姆188 （F-68，西安悅來(lái)醫(yī)藥科技有限公司）； 對(duì)甲氧基苯胺（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）； 棕櫚酸（梯希愛上?；晒I(yè)有限公司，純度≥97.0%）； 油酸、四氫呋喃（西隴科學(xué)股份有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純（美國(guó)天地公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 磷脂復(fù)合物制備 根據(jù)文獻(xiàn)［10-12］ 報(bào)道和課題組前期優(yōu)化結(jié)果，精密稱取燈盞花乙素原料藥0.6 g、大豆磷脂1.8 g，溶于20 mL 混合溶劑（甲醇∶四氫呋喃＝1 ∶1）中，35 ℃水浴恒溫冷凝回流2.5 h，減壓回收溶劑，加入適量二氯甲烷以充分溶解大豆磷脂、磷脂復(fù)合物，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜，適量二氯甲烷沖洗濾膜，合并濾液、洗液，減壓除去二氯甲烷，即得，干燥12 h，收集濾膜上的沉淀，計(jì)算復(fù)合率，公式為復(fù)合率＝ ［（W總-W沉） /W總］ ×100%（W沉為未復(fù)合燈盞花乙素沉淀量，W總為燈盞花乙素投藥量），結(jié)果為（93.21±1.09）%。

2.2 脂微球制備 稱取F-68 0.3 g、注射用甘油1.25 g，分散于適量超純水中，65 ℃磁力攪拌混合均勻，作為水相； 稱取蛋黃卵磷脂0.6 g、中鏈脂肪酸甘油三酯3.75 g、大豆油1.25 g、油酸0.25 g，磷脂復(fù)合物25 mg，超聲溶解，作為油相，用注射器將油相緩慢加到水相中，高速剪切得初乳，稀NaOH 調(diào)節(jié)pH 值，待溫度降至室溫后進(jìn)行均質(zhì)，即得。同法制備不含磷脂復(fù)合物的空白脂微球。

2.3 燈盞花乙素含量測(cè)定 采用HPLC 法。

2.3.1 色譜條件 Ultiamte?LP-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸（20 ∶80）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫30 ℃； 檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm； 進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取燈盞花乙素對(duì)照品10 mg，置于50 mL 量瓶中，適量甲醇溶解并定容，得0.2 mg/mL貯備液，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.2 供試品溶液 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲破乳溶解，定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.3 空白溶液 精密吸取空白脂微球溶液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，加適量甲醇超聲破乳溶解，定容，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 專屬性試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品、供試品、空白溶液各10 μL，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 燈盞花乙素HPLC 色譜圖

2.3.3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取貯備液0.05、0.10、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、6.40 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積（Y） 對(duì)質(zhì)量濃度（X） 進(jìn)行回歸，得方程為Y＝0.417X-0.112 7 （r＝0.999 8），在1～128 μg/mL 范圍內(nèi)內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液適量，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得燈盞花乙素峰面積RSD為0.95%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取脂微球6 份，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得燈盞花乙素含量RSD 為1.35%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取脂微球乳液0.8 mL，置于10 mL 量瓶中，按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h 在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得燈盞花乙素峰面積RSD 為2.22%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取空白脂微球0.8 mL，共9 份，置于10 mL 量瓶中，分別精密加入200 μg/mL 貯備液100、125、150 μL，按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，燈盞花乙素平均加樣回收率分別為89.85%、97.52%、92.98%，RSD 分別為1.87%、1.12%、0.35%。

2.3.4 樣品含量測(cè)定 精密量取脂微球乳液3 份，按“2.3.2.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果，燈盞花乙素平均含量為（35.77±0.14） μg/g。

2.4 外觀形態(tài)觀察 所得脂微球?yàn)槿榘咨?，在透射電鏡下呈球形或類球形，流動(dòng)性良好，分布均一，見圖2。

圖2 燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球透射電鏡圖

2.5 專屬性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液適量，在“2.2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，兩者中燈盞花乙素色譜峰保留時(shí)間一致，均為7.46 min，并且分離度理想，表明該方法專屬性良好。

2.6 pH 值測(cè)定 制備3 批樣品，按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部（通則0631） 測(cè)定pH 值，結(jié)果為7.00 ～7.05，符合人體pH 值。

2.7 粒徑測(cè)定 取脂微球乳液適量，適量水稀釋后加到樣品池中，測(cè)定其粒徑，結(jié)果平均值為（160.59±4.46） nm，見圖3。

圖3 燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球粒徑分布

2.8 酸值測(cè)定 稱取脂微球適量，按照2020 年版《中國(guó)藥典》 四部 （通則0713） 測(cè)定酸值，結(jié)果平均值為（0.94±0.01） mg/g。

2.9 甲氧基苯胺值測(cè)定 參考文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道。

精密稱取脂微球5 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加20 mL無(wú)水乙醇，60 ℃水浴減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)15 min，重復(fù)3次以除盡水分，加異丙醇-異辛烷混合溶液（2 ∶8） 使殘?jiān)芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，混合溶液稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

精密吸取上述供試品溶液、混合溶液各5 mL，分別置于甲、乙2 支10 mL 具塞試管中，精密加入含0.25%對(duì)甲氧基苯胺的冰醋酸溶液1 mL （當(dāng)天制備，以異丙醇-異辛烷為參比，1.00 cm 比色池，在350 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，其數(shù)值不得大于0.2），振搖，避光放置10 min，以乙管中溶液為空白，采用紫外-可見分光光度法在350 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定甲管中樣品溶液吸光度； 另取供試品溶液適量，以混合溶液為空白，在350 nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A0。結(jié)果，3 批樣品中甲氧基苯胺值分別為0.81、0.77、0.83，未超過(guò)5.0，均符合限度要求。

2.10 游離脂肪酸含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［18］ 報(bào)道。

精密稱取棕櫚酸（因處方中含有油酸，故稱取量為0.153 9 g），置于50 mL 量瓶中，正庚烷稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

精密吸取上述對(duì)照品、“2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液各1 mL，置于10 mL 具塞試管中，加入異丙醇-正庚烷-0.5 mol/L 硫酸混合溶液（40 ∶10 ∶1） 5.0 mL，振搖1 min，靜置10 min，供試品溶液中精密加入正庚烷、水各3 mL，對(duì)照品溶液中精密加入正庚烷2 mL、水4 mL，密塞，上下翻轉(zhuǎn)10 次，靜置至少15 min 分層，精密量取上層液3 mL，置于10 mL 離心管中，加尼羅藍(lán)指示液l mL，在通氮?dú)鈼l件下用氫氧化鈉滴定液滴至溶液顯淡紫色，規(guī)定供試品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L） 體積不得大于對(duì)照品溶液消耗氫氧化鈉滴定液（0.01 mol/L） 體積。結(jié)果，3批樣品中游離脂肪酸含量分別為3.61、3.49、3.61 mmol/L，未超過(guò)7 mmol/L，均符合限度要求。

2.11 過(guò)氧化值測(cè)定 參考文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道。取三氯甲烷-冰醋酸混合溶液（2 ∶3） 30 mL，置于150 mL 碘量瓶中，通氮?dú)?0 min，精密稱取脂微球5.0 g，迅速加到碘量瓶中，蓋上塞子輕輕振搖，精密加入碘化鉀飽和溶液0.5 mL，密塞避光，振搖萃取3 min，加新沸并放冷的水30 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 滴定并充分振搖直至黃色消失，加淀粉指示液5 mL，Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L）滴定并充分振搖至紫藍(lán)色消失，同時(shí)進(jìn)行空白試驗(yàn)校正，規(guī)定消耗的Na2S2O3滴定液（0.01 mol/L） 體積不得超過(guò)1.0 mL。結(jié)果，3 批樣品過(guò)氧化值分別為0.56、0.40、0.40 mmol/kg，未超過(guò)6 mmol/kg，均符合限度要求。

2.12 有關(guān)物質(zhì)檢查 參考文獻(xiàn)［20］ 報(bào)道。

2.12.1 色譜條件 同“2.3.1” 項(xiàng)。

2.12.2 破壞性試驗(yàn) 未破壞： 精密吸取“2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，置于25 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度，再精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇定容至刻度。

酸破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，置于150 mL 錐形瓶中，加入1 mol/L 鹽酸10 mL，加熱回流4 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為酸破壞產(chǎn)物。

堿破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，置于150 mL 錐形瓶中，加入1 mol/L 氫氧化鈉10 mL，加熱回流4 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中，精密吸取1 mL 至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為堿破壞產(chǎn)物。

氧化破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，加入30%過(guò)氧化氫10 mL，靜置2 h，精密吸取1 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為氧化產(chǎn)物。

熱破壞： 精密吸取 “2.3.2.2” 項(xiàng)下供試品溶液1.0 mL，置于坩堝中，放到150 ℃烘箱中干燥2 h，冷卻，甲醇反復(fù)洗滌后移至25 mL 量瓶中并定容，精密吸取1.0 mL至10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，作為熱解產(chǎn)物。

2.12.3 結(jié)果分析 圖4B、4C、4E 顯示，燈盞花乙素色譜峰完全消失，其前后無(wú)雜質(zhì)峰出現(xiàn)，表明脂微球在酸性、堿性、高溫條件下均被破壞，而且無(wú)相關(guān)雜質(zhì)產(chǎn)生； 圖4D顯示，燈盞花乙素色譜峰峰面積減小，說(shuō)明脂微球在氧化條件下穩(wěn)定性較差。

圖4 破壞性試驗(yàn)HPLC 色譜圖

3 討論與結(jié)論

2020 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定，當(dāng)待測(cè)成分含量小于100 μg/g 時(shí)，其加樣回收率限度為85% ～110%，而本實(shí)驗(yàn)測(cè)得3 批燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球中原料藥平均含量為（35.77±0.14） μg/g，加樣回收率為89.85% ～97.52%，符合上述要求。另外，該制劑粒徑范圍為46.60 ～564.75 nm，平均值為160 nm，并且90%的乳滴粒徑均在1 μm 以下，未檢測(cè)出＞5 μm 者［21］，表明其分布范圍合理。

在游離脂肪酸含量、過(guò)氧化值測(cè)定過(guò)程中均通入氮?dú)?，可避免從空氣中?dǎo)入額外的氧化產(chǎn)物而產(chǎn)生誤差。在甲氧基苯胺測(cè)定過(guò)程中采用少量多次的方法加入乙醇，并減壓回收該溶劑以除盡水分，可防止相關(guān)氧化物質(zhì)干擾，并控制氧含量。在燈盞花乙素磷脂復(fù)合物制備過(guò)程中采用四氫呋喃、二氯甲烷、甲醇，三者均屬于二類有機(jī)溶劑。

文獻(xiàn)［22］ 報(bào)道，在差示掃描量熱法檢測(cè)過(guò)程中殘留溶劑會(huì)升溫吸熱，產(chǎn)生吸熱峰。但課題組前期發(fā)表的燈盞花乙素磷脂復(fù)合物表征文獻(xiàn)中，熱分析結(jié)果顯示未產(chǎn)生其他明顯吸熱峰，故本實(shí)驗(yàn)未對(duì)其溶劑殘留進(jìn)行檢測(cè)。

在有關(guān)物質(zhì)檢查過(guò)程中，酸堿破壞選擇回流方式，可減少加熱過(guò)程中溶劑揮發(fā)及反應(yīng)物混入生成物中，從而提高相關(guān)雜質(zhì)的純度。

綜上所述，上述方法檢測(cè)靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，可較好地評(píng)價(jià)燈盞花乙素磷脂復(fù)合物脂微球質(zhì)量。