RAD51AP1在腫瘤進(jìn)展和耐藥中的研究進(jìn)展

劉仁旺 李明彪 胡子軒 宋作慶 陳軍

腫瘤目前仍是全球范圍內(nèi)最常見的死亡原因之一，基因組失穩(wěn)是其發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制之一[1,2]。外源性DNA損傷（如重金屬、電離輻射等）和內(nèi)源性DNA損傷（如氧自由基等）都可以導(dǎo)致細(xì)胞基因組失穩(wěn)，從而使正常細(xì)胞獲得惡性表型[3]。同源性重組修復(fù)（homologous recombination repair, HRR）等DNA損傷修復(fù)機(jī)制是機(jī)體維持基因組穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[4]。HRR的缺失可能導(dǎo)致卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。

HRR的生物學(xué)過程比較復(fù)雜[6]。簡單來說，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷時，重組酶RAD51結(jié)合斷裂的單鏈DNA（single-stranded DNA, ssDNA）后，形成突觸前纖維，進(jìn)而捕獲供體DNA形成D-loop，以完成HRR[6]。RAD51相關(guān)蛋白1（RAD51 associated protein 1, RAD51AP1）作為重組酶RAD51的輔助蛋白，可以招募RAD51，并促進(jìn)RAD51和單端侵入中間體（single-end invasion intermediate, SEI）DNA的結(jié)合，進(jìn)而刺激D-loop的形成[7]。因此，RAD51AP1在HRR中具有重要作用，其可能通過促進(jìn)HRR以維持細(xì)胞基因組穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而減少腫瘤的發(fā)生。

然而，多項(xiàng)研究[8-11]表明，RAD51AP1在許多惡性腫瘤組織及轉(zhuǎn)移灶中顯著高表達(dá)，且其高表達(dá)往往提示不良預(yù)后。這些結(jié)果提示RAD51AP1可能具有促癌作用。其促癌機(jī)制尚不明確。同時，還有文獻(xiàn)[12,13]報道，RAD51AP1亦有促進(jìn)放化療耐藥的作用。RAD51AP1在腫瘤發(fā)生發(fā)展及耐藥中的廣泛作用提示其可能成為一個抑制腫瘤、逆轉(zhuǎn)耐藥的新靶點(diǎn)。

因此，本文綜述了RAD51AP1在腫瘤中的研究，并聚焦于其促癌作用的潛在機(jī)制。同時，回顧總結(jié)了其在放化療耐藥中的作用，并對其未來在逆轉(zhuǎn)靶向治療耐藥和腫瘤免疫治療中的研究進(jìn)行展望，旨在為后續(xù)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 RAD51AP1的生物學(xué)特性

RAD51AP1于1997年由Mizuta等首次發(fā)現(xiàn)[14]。人RAD51AP1基因定位于染色體12p13區(qū)帶[15]，其在脊椎動物中高度保守[16]。人RAD51AP1和小鼠Rad51ap1均主要分布在胸腺、骨髓、脾臟和睪丸中[14,17]，其細(xì)胞亞定位主要位于細(xì)胞核中[18]。

2 RAD51AP1在腫瘤中的促癌作用

RAD51AP1在多種腫瘤中顯著高表達(dá)。早在2004年，Song等[19]應(yīng)用互補(bǔ)DNA（complementary DNA, cDNA）微陣列芯片的方法首次報道了RAD51AP1在乙肝病毒陽性（hepatitis B virus positive, HBV+）的肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction, RT-PCR）在肝細(xì)胞癌細(xì)胞株中進(jìn)行了驗(yàn)證。此后，Henson等[20]和Matinez等[21]分別應(yīng)用類似的方法發(fā)現(xiàn)RAD51AP1在人乳頭狀瘤病毒陽性頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和套細(xì)胞淋巴瘤中均顯著高表達(dá)。2007年，Martin等[22]首次應(yīng)用一種類似于生信分析的方法，分析了van’t Veer等報道的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)RAD51AP1在乳腺癌易感基因-1（breast cancer susceptibility gene 1,BRCA-1）缺失的乳腺癌中顯著高表達(dá)。之后，各項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌、卵巢癌、卵巢漿液性囊腺癌、口咽鱗狀細(xì)胞癌、食管癌、結(jié)直腸癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、丙肝病毒陽性肝細(xì)胞癌及HBV+肝細(xì)胞癌中均有RAD51AP1的顯著高表達(dá)[8,9,13,17,23-31]。此外，切爾諾貝利事件后甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid cancer, PTC）即低劑量輻射暴露的PTC的RAD51AP1表達(dá)水平低于其他PTC水平，提示低劑量輻射的PTC可能存在不一樣的致癌因素，其具體機(jī)制尚無報道[32]。

RAD51AP1的高表達(dá)往往提示患者預(yù)后不良。Sankaranarayanan等[24]應(yīng)用Tensor GSVD方法，在生信層面對來源于腫瘤基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫的249例卵巢漿液性囊腺癌患者資料進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)RAD51AP1高表達(dá)患者總生存期（overall survival,OS）顯著低于低表達(dá)患者。其后，Chudasama等[26]通過收集患者組織和外周血樣本，分析發(fā)現(xiàn)RAD51AP1高表達(dá)的卵巢癌和肺癌患者均表現(xiàn)出較低的OS。Zhao等[33]通過生信分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌中，RAD51AP1高表達(dá)患者的OS及無進(jìn)展生存期（progression-free survival, PFS）均較差。Zhuang等[34]應(yīng)用同樣的方法發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）中RAD51AP1的表達(dá)與OS及PFS亦顯著負(fù)相關(guān)。Bridges等[12]通過生信分析發(fā)現(xiàn)，RAD51AP1高表達(dá)的乳腺癌患者不僅OS更差，其各種治療后的無復(fù)發(fā)生存時間（recurrence free survival, RFS）也更低。此后，各項(xiàng)研究[8-10]表明，在包括乳腺癌、肺腺癌等多種癌種中，RAD51AP1的高表達(dá)往往提示預(yù)后不良。因此，RAD51AP1可能是指導(dǎo)腫瘤的預(yù)后重要生物標(biāo)記物。然而亦有研究[29]報道，在口咽鱗狀細(xì)胞癌中尚未發(fā)現(xiàn)其與OS的相關(guān)性，而在Li等[30]的研究中也發(fā)現(xiàn)RAD51AP1高、低表達(dá)患者RFS的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在這些癌種中，RAD51AP1指導(dǎo)預(yù)后的作用仍需進(jìn)一步的驗(yàn)證。

RAD51AP1介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移、抑制凋亡等多項(xiàng)表型的重要作用也在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證。Obama等[17]最早在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌的細(xì)胞株TFK-1和SSP25中敲除RAD51AP1后發(fā)現(xiàn)，其克隆形成能力明顯下降，提示RAD51AP1對肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖至關(guān)重要。Chudasama等[26]應(yīng)用si-RAD51AP1轉(zhuǎn)染SKOV3和A549細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖能力明顯下降。Wu等[27]以非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549、H520為研究對象，敲減RAD51AP1后發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力明顯下降，凋亡細(xì)胞明顯增多，并在裸鼠中做了進(jìn)一步驗(yàn)證。

因此，RAD51AP1在多種腫瘤中顯著高表達(dá)，其高表達(dá)提示患者預(yù)后不良。其還可以在多種腫瘤中促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲并抑制凋亡，具有廣泛的促癌作用（表1）。

表1 RAD51AP1在腫瘤中的各項(xiàng)研究的材料、方法及結(jié)果Tab 1 The materials, methods and results in the investigations of RAD51AP1 on cancers

3 RAD51AP1促癌作用的潛在機(jī)制

3.1 RAD51AP1通過提高腫瘤細(xì)胞干性促進(jìn)增殖RAD51AP1的促癌機(jī)制尚不明確。其可能通過提高腫瘤干性來促進(jìn)腫瘤的增殖。如Pathania等[8]發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合應(yīng)用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase, DNMT）和組蛋白去乙酰酶（histone deacetylase, HDAC）抑制劑可以顯著降低乳腺癌干細(xì)胞數(shù)量，并通過測序發(fā)現(xiàn)，乳腺癌干細(xì)胞的RAD51AP1的轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，提示聯(lián)用藥物抑制腫瘤的干性的作用機(jī)制可能是經(jīng)由抑制RAD51AP1介導(dǎo)的。隨后，他們進(jìn)一步研究[12]發(fā)現(xiàn)，RAD51AP1敲減后的乳腺癌細(xì)胞相關(guān)干性標(biāo)記物CD44、CD49f、NANOG和KLF4等表達(dá)明顯降低，腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells, CSCs）數(shù)目明顯降低，CSCs的成球能力也明顯降低，并在轉(zhuǎn)基因小鼠和裸鼠中均進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了RAD51AP1通過提高腫瘤細(xì)胞的干性來促進(jìn)增殖和轉(zhuǎn)移。進(jìn)一步，他們應(yīng)用同樣的方法驗(yàn)證了RAD51AP1在結(jié)直腸癌中也是通過類似的機(jī)制促癌發(fā)生發(fā)展[13]。另外，Redmer等[35]也發(fā)現(xiàn)，在CD271穩(wěn)轉(zhuǎn)的黑色素瘤細(xì)胞T20/02和A375中，RAD51AP1明顯高表達(dá)，提示RAD51AP1可能與黑色素瘤干性維持作用密切相關(guān)。同時，我們的前期工作中，通過對泛癌種進(jìn)行生信分析發(fā)現(xiàn)，RAD51AP1的表達(dá)在多個癌種中與干性指標(biāo)mRNAsi評分和mDNAsi評分呈顯著正相關(guān)，提示其可能具有廣泛的提高腫瘤干性的作用。然而，RAD51AP1提高干性的作用并未在乳腺癌和結(jié)直腸癌以外的腫瘤中得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的證實(shí)。其維持腫瘤干性的機(jī)制也尚不明確，未來基于此研究可能有助于找尋抑制CSCs的新靶點(diǎn)。

3.2 RAD51AP1促癌發(fā)生發(fā)展的其他機(jī)制 RAD51AP1還可能通過其他機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。例如，其可以通過刺激端粒延長代替機(jī)制（alternative lengthening of telomeres,ALT）以維持腫瘤細(xì)胞的端粒長度，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤細(xì)胞主要通過兩種端粒維持機(jī)制（telomere maintenance mechanisms, TMM）來抑制端?？s短。其中之一就是HRR介導(dǎo)的ALT，占所有腫瘤的10%-15%[36,37]。Barroso-Gonzalez等[38]研究發(fā)現(xiàn)，E3連接酶MMS21介導(dǎo)的RAD51AP1蘇木化可以有效地維持其在ALT陽性腫瘤細(xì)胞中的穩(wěn)定性，進(jìn)而通過招募POLD3和RAD52蛋白后介導(dǎo)的斷裂誘導(dǎo)端粒DNA合成（break induced telomere DNA synthesis, BITS）以維持ALT系統(tǒng)，延長端粒長度，促進(jìn)增殖。同時，研究[39]表明，RAD51AP1還能夠以RAD52非依賴形式上調(diào)ALT。其可以與端粒重復(fù)序列RNA（telomere repeat-containing RNA, TERRA）結(jié)合，在端粒形成R-loop，刺激G-四聚體（G-quadruplexes, G4s）的合成，進(jìn)而上調(diào)ALT。Kaminski等[40]也發(fā)現(xiàn)，基于其自身的SUMO-SIM調(diào)節(jié)軸作用，RAD51AP1可以結(jié)合并穩(wěn)定含有TERRA的R-loop，刺激端粒延長，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。

另外，還有研究[33]發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中，siRAD51AP1后，SMAD2-4、TGFBR1轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，p-SMAD2、p-SMAD3表達(dá)明顯下降，提示RAD51AP1可能通過轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）/Smad信號通路促進(jìn)腫瘤增殖。同時，Chudasama等[26]通過敲減卵巢癌和肺癌細(xì)胞中的RAD51AP1后，發(fā)現(xiàn)干性相關(guān)蛋白SOX2、促轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白SNAI1及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）信號通路相關(guān)蛋白有不同程度的低表達(dá)，提示其可能通過mTOR信號通路介導(dǎo)增殖。然而上述兩種機(jī)制的研究者僅分析了RAD51AP1與TGF-β/Smad和mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)相關(guān)性，并未對其分子相互作用等直接機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究。未來基于RAD51AP1通過何種機(jī)制調(diào)控這兩個下游信號通路的研究可能能夠發(fā)現(xiàn)阻斷其促進(jìn)腫瘤增殖的靶點(diǎn)和方法。

3.3 上調(diào)RAD51AP1表達(dá)的機(jī)制 腫瘤中調(diào)控RAD51AP1表達(dá)的機(jī)制尚不明確。Wang等[41]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子ZEB1是RAD51AP1的重要上游調(diào)控分子之一。該研究證實(shí)，miR-320a可以通過與RAD51AP1的3’UTR區(qū)域結(jié)合而抑制其翻譯，而ZEB1可以結(jié)合miR-320a啟動子中的E-box區(qū)域來抑制miR-320a的表達(dá)，從而促進(jìn)RAD51AP1的表達(dá)。同時，RAD51AP1的蘇木化/泛素化平衡對其表達(dá)也具有重要作用。Barroso-Gonzalez等[38]發(fā)現(xiàn)，在ALT陽性腫瘤細(xì)胞中，E3連接酶MMS21可以介導(dǎo)RAD51AP1的蘇木化，以減少泛素化對其的降解作用，從而維持RAD51AP1蛋白的穩(wěn)定表達(dá)。還有一些學(xué)者應(yīng)用生信分析發(fā)現(xiàn)可能存在一些功能基因和microRNA（如has-miR-140-3p等）與RAD51AP1的表達(dá)密切相關(guān)，但這些研究均未對其進(jìn)行進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[10,23,24]。

3.4 小結(jié) 我們對RAD51AP1下游及上游相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)行了綜述。研究表明RAD51AP1主要通過提高干性、促進(jìn)ALT及上調(diào)TGF-β/Smad和mTOR通路等機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。在腫瘤中，其高表達(dá)主要經(jīng)由ZEB1和MMS21調(diào)控。未來基于其調(diào)控機(jī)制的研究將有助于進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。

4 RAD51AP1與耐藥

RAD51AP1的高表達(dá)還可以促進(jìn)腫瘤對化療和放療的耐藥。Obama等[17]應(yīng)用γ-射線對肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌細(xì)胞進(jìn)行照射后，檢測到RAD51AP1在細(xì)胞核內(nèi)顯著聚集。Henson等[20]在Hela細(xì)胞中敲減RAD51AP1后，可以明顯提高其對絲裂霉素（mitomycin C, MMC）的敏感性。Zhou等[42]發(fā)現(xiàn)，在多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，敲減RAD51AP1可以顯著增強(qiáng)替莫唑胺的敏感性。Li等[43]證實(shí)，甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferase-like 3, METTL3）通過上調(diào)RAD51AP1促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）耐藥。

RAD51AP1促進(jìn)耐藥的機(jī)制尚不明確。Bridges等[13]發(fā)現(xiàn)RAD51AP1在5-FU耐藥的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)明顯高于敏感株，且耐藥細(xì)胞株的克隆成球能力更強(qiáng)，干性分子標(biāo)記物NANOG、KLF4、OCT4和SOX2表達(dá)水平更高，提示耐藥可能與RAD51AP1介導(dǎo)的干性維持作用有關(guān)。同時，他們還發(fā)現(xiàn)在乳腺癌細(xì)胞中敲減RAD51AP1可以顯著提高培美曲塞（paclitaxel, PTX） 和電離輻射介導(dǎo)的凋亡作用，并在耐藥株CAL51-PTX-R中發(fā)現(xiàn)RAD51AP1顯著高表達(dá)，敲減RAD51AP1可能通過降低其干性能力來逆轉(zhuǎn)耐藥[12]。CSCs在腫瘤放化療耐藥中具有重要作用[44-46]。在腫瘤中，優(yōu)勢CSCs分化主導(dǎo)腫瘤的進(jìn)展，而其他CSCs處于靜默狀態(tài)?；熤委熀螅瑑?yōu)勢腫瘤細(xì)胞被殺滅，而靜默的CSCs通過篩選后得到發(fā)生發(fā)展的機(jī)會，進(jìn)而引起耐藥[13]。因此，RAD51AP1提高腫瘤干性的作用可能是其促進(jìn)腫瘤放化療耐藥的重要機(jī)制之一。

基于RAD51AP1與耐藥的研究可能具有較大的應(yīng)用前景。Ni等[47]發(fā)現(xiàn)，放射處理的宮頸癌細(xì)胞中RAD51AP1明顯高表達(dá)，且與劑量呈正相關(guān)。而轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BRD4的抑制劑JQ1可以抑制RAD51AP1的表達(dá)，進(jìn)而增加放療的敏感性。其主要機(jī)制是，BRD4直接結(jié)合RAD51AP1上游350 bp的啟動子區(qū)域而促進(jìn)RAD51AP1的表達(dá)，而JQ1通過抑制BRD4的表達(dá)，減少了RAD51AP1的轉(zhuǎn)錄。另外，高劑量硒化物可以與細(xì)胞毒化療藥物產(chǎn)生協(xié)同作用以達(dá)到一定程度的逆轉(zhuǎn)耐藥[48]。Song等[49]研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢癌細(xì)胞中，卡鉑可以顯著提高RAD51AP1的表達(dá)，而聯(lián)合應(yīng)用亞硒酸時，RAD51AP1卻明顯降低，提示硒化物可能存在通過降低RAD51AP1的表達(dá)而中和細(xì)胞毒藥物耐藥的機(jī)制。

總之，RAD51AP1可以介導(dǎo)多種腫瘤的放化療耐藥，其耐藥機(jī)制主要與其提高腫瘤干性密切相關(guān)?；赗AD51AP1介導(dǎo)放化療耐藥的研究可能具有較大的臨床應(yīng)用前景。

5 總結(jié)與展望

綜上所述，RAD51AP1不僅在正常細(xì)胞的HRR中具有重要作用，還可能具有廣泛的促癌作用。其在多種腫瘤組織中高表達(dá)，并提示不良預(yù)后。RAD51AP1主要通過提高腫瘤干性、延長端粒、調(diào)控TGF-β/Smad和mTOR信號通路等機(jī)制來促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲及遷移。其提高腫瘤干性的能力也是其促進(jìn)多種腫瘤放化療耐藥的主要機(jī)制之一。以RAD51AP1為靶點(diǎn)，對其上游和下游調(diào)控機(jī)制進(jìn)行干預(yù)可能能夠成為研究逆轉(zhuǎn)腫瘤放化療耐藥的重要方向。

此外，RAD51AP1在靶向治療耐藥和腫瘤免疫治療中的作用報道罕見。靶向治療可以通過調(diào)節(jié)表觀修飾、改變腫瘤微環(huán)境、上調(diào)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等機(jī)制介導(dǎo)耐藥[50,51]。聯(lián)合CSCs抑制劑可以部分逆轉(zhuǎn)腫瘤靶向治療的耐藥[52]。同時，CSCs還可以通過減少抗原呈遞和上調(diào)Wnt、Notch等信號通路的方式促進(jìn)腫瘤免疫逃逸[53,54]。靶向CSCs逆轉(zhuǎn)免疫治療耐藥的治療效果已在動物實(shí)驗(yàn)、預(yù)臨床實(shí)驗(yàn)中得到了部分驗(yàn)證[55,56]。而RAD51AP1可以顯著提高腫瘤中CSCs的數(shù)量和干性能力，未來基于RAD51AP1的研究可能能夠?yàn)槟孓D(zhuǎn)靶向治療耐藥和增效免疫治療療效的研究提供重要的參考。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.