肺癌疫苗研究進展

范昊 葛祥偉 周鑫 李瑤 王安 胡毅

腫瘤疫苗是近年來被廣大學者廣泛討論的腫瘤治療方法，其治療原理是將腫瘤抗原以某種方式導入患者體內，激發(fā)或增強患者自身免疫系統，誘導機體產生長期的體液和細胞免疫應答，從而殺傷腫瘤細胞，作用機制如圖1。腫瘤疫苗能夠以腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen, TSA）或腫瘤相關性抗原（tumor-associated antigen,TAA）為靶點，激活免疫系統，有效針對實體瘤或血液系統腫瘤[1]。由于腫瘤早期轉移和微小病灶的特性，局部根治性治療手段往往很難徹底治愈腫瘤，為了實現理想的治療效果，疫苗刺激的免疫反應需要殺死全身的隱匿性病灶。自2010年美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批準人類歷史上第一個前列腺癌治療性疫苗-Provenge以來，全球開展的腫瘤疫苗臨床研究總體呈上升的趨勢，如圖2。此外，肺癌、胃癌、前列腺癌等多種實體瘤的治療性疫苗也已進入了臨床試驗，取得了一些積極的結果，部分已經獲批于臨床應用[2-4]。但由于抗原制備困難、免疫原性低下、無法持久激活免疫系統等原因導致治療性腫瘤疫苗的療效與傳統治療方式相比不能盡如人意，目前仍存在一些問題需要進一步解決。例如，腫瘤抗原的多樣性和復雜性使得疫苗設計和制備較為困難，且其治療效果的評價標準尚不明確等[5-7]。因此，腫瘤疫苗是值得深入研究的一個課題，未來需要進一步完善腫瘤疫苗的制備技術，并建立相應的評價標準，推動其在臨床應用中的發(fā)展。本文將對最新腫瘤疫苗的臨床研究進展及研發(fā)中遇到的困難和難點作一回顧性總結，探索未來腫瘤疫苗的發(fā)展方向。

圖1 腫瘤疫苗作用機制Fig 1 Mechanism of cancer vaccine. mRNA: messenger ribonucleic acid; DC: dendritic cell; APC: antigen-presenting cells.

圖2 2010年以來腫瘤疫苗臨床研究開展數量Fig 2 Number of clinical trial since 2010

1 腫瘤疫苗分類及治療原理

根據FDA標準[8]，目前腫瘤疫苗按抗原類型分類可分為多肽疫苗、信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid,mRNA）疫苗、全細胞疫苗、重組病毒疫苗等。利用腫瘤抗原制備腫瘤疫苗時一般與細胞因子或佐劑合用以激活更強的免疫反應，另外腫瘤疫苗的不同給藥途徑也可能造成療效的差異，但可以肯定的是，已經有很多腫瘤疫苗在患者體內可以檢測出有意義的免疫應答[9,10]。

1.1 多肽疫苗 多肽疫苗是利用已知病原體的某段抗原表位的氨基酸序列，通過化學合成方式人工合成短肽作為抗原誘發(fā)機體免疫應答，是目前臨床研究最多的疫苗品種。由于多肽疫苗僅包含病原體的識別序列，可以誘發(fā)免疫應答但不致病，所以多肽疫苗技術廣泛應用于抗結核和抗人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV）等多種病毒疫苗。多肽疫苗具有安全性高、可大規(guī)模合成、易于純化和應用等特點。遺憾的是，由于其細胞攝取率低、快速清除率高、穩(wěn)定性差等缺點，臨床試驗效果往往較為局限。多肽疫苗往往需要與免疫佐劑聯合，或者通過病毒、樹突狀細胞（dendritic cell, DC）等合適的載體遞送至免疫反應細胞來增強T細胞的免疫效應。

1.2 mRNA疫苗 mRNA疫苗是將編碼外源性抗原的mRNA片段導入人體細胞內，由自體細胞的蛋白合成機制合成外源性抗原后引起全身免疫反應[11,12]。20世紀90年代，科學家Wolff等[13]利用小鼠實驗，發(fā)現RNA/脫氧核糖核酸（deoxyribo nucleic acid, DNA）直接注射入體內可以導致相關蛋白表達顯著增加，相關蛋白表達時間在2個月以上，為RNA疫苗打下了理論基礎。mRNA疫苗的優(yōu)點是可以同時呈遞多種抗原，覆蓋多種腫瘤特異性抗原（tumor-specific antigen, TSA）表位，與基于短肽疫苗容易受到主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex, MHC）的限制不同，mRNA疫苗可以編碼全長腫瘤抗原，允許抗原呈遞細胞（antigen-presenting cell, APC）將多個抗原表位同時或交叉呈遞，產生共刺激信號發(fā)揮佐劑作用，進一步激發(fā)T細胞效應[14-17]。此外，由于RNA無法整合至基因組中，避免了插入突變的可能，進一步提高了應用的安全性。然而，RNA疫苗也有一定的缺點，包括RNA穩(wěn)定性較差、裸RNA攝取率很低、容易被降解等。所以，開發(fā)有效的RNA遞送體、高效地將RNA穿透磷脂雙分子層到達細胞質、有效提高免疫應答效應是疫苗療效的重要保障[18-20]。

1.3 其他類型疫苗 其他類型的腫瘤疫苗還包括腫瘤全細胞疫苗、DC疫苗、病毒載體疫苗等。全細胞疫苗以APC為靶點，將經過處理的腫瘤細胞制備為抗原，純化后注射入體內引起機體免疫反應，或在離體條件下利用抗原先行激活APC，再將APC輸入體內激活T細胞，后者一般采用體內抗原呈遞活性最高的DC作為中介，也稱為DC疫苗[21-23]。全細胞疫苗不僅需要合適的佐劑來增強體內的免疫反應，提純TSA或TAA的技術也同樣重要，第二代測序技術（nextgeneration sequencing, NGS）和生物信息學工具可以讓我們更好地了解到腫瘤亞群之間的關系，對整個突變過程的每個參數進行大規(guī)模分析，對于檢測腫瘤亞群的突變、預測潛在表位、找到特異性新抗原有巨大的幫助[24]。新抗原一般在正常組織中不表達，僅在腫瘤組織中特異性表達，包括致瘤基因突變產生的突變蛋白和致瘤病毒整合進宿主基因產生的抗原等，新抗原不僅具有腫瘤特異性，還具有強免疫原性，新抗原強大的免疫原性可以幫助免疫細胞特異性殺傷腫瘤組織，比如Sebastian等[25]使用NGS技術對癌細胞系的人類白細胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）進行轉錄組測序，并映射到HLA表型中，建立了每個細胞系中抗原突變的目錄，為腫瘤疫苗的開發(fā)做出了貢獻。病毒載體疫苗是將TSA或TAA插入載體病毒或細菌質粒，由重組微生物表達腫瘤抗原引起或增強機體免疫反應[26,27]。而具有溶瘤特性、經基因工程改造后的腫瘤靶向溶瘤病毒則是屬于原位疫苗的類型，原位疫苗是在體內直接通過放療、注射溶瘤病毒等方式激活APC，將腫瘤微環(huán)境誘導為富含效應細胞的免疫刺激環(huán)境，產生整體和長效的抗腫瘤反應，原位疫苗的關鍵步驟是誘導腫瘤細胞死亡、APC的募集和效應細胞的激活[28,29]。重組基因疫苗目前主要應用于癌癥預防方面，比如重組人乳頭瘤病毒（human papilloma virus, HPV）疫苗就是預防宮頸癌的有效武器。重組基因疫苗的優(yōu)點是免疫系統已經建立了針對病毒的高效、強大、持久的免疫反應，通過病毒病原體相關的分子模式識別受體（pattern recognition receptor, PRR）來促進APC的激活。而缺點是體內強大的記憶性抗病毒免疫反應容易中和病毒抗原，從而降低了重復接種的可能。

2 腫瘤疫苗在臨床中的應用價值

2.1 腫瘤疫苗在肺癌中的應用 肺癌作為世界上發(fā)病率位居第二位、死亡率位居第一位的癌癥，也是癌癥中免疫治療和靶向治療研究最為深入的病種。以肺癌舉例，現階段治療性腫瘤疫苗的臨床研究往往選擇與常規(guī)治療方式聯合應用的治療方案。Ott等[30]的研究表明腫瘤疫苗與程序性死亡受體1（programmed cell death 1, PD-1）藥物納武利尤單抗聯合治療，可以顯著提高腫瘤疫苗的治療效果，降低不良反應發(fā)生率，疫苗誘導的T細胞會隨著時間的推移而持續(xù)存在，顯示出細胞毒性潛力，并可以遷移到腫瘤微環(huán)境中殺傷腫瘤細胞；Gray等[31]在疫苗聯合T細胞趨化因子CCL21（CC chemokine ligand 21）在晚期肺腺癌中的療效的研究表明，免疫調節(jié)因子能夠影響人體的免疫系統，從而增強腫瘤疫苗的療效。腫瘤疫苗的遞送方式和靶向器官在動物實驗中也取得了一些進展，Chen等[32]認為將mRNA疫苗以脂質納米顆粒的形式靶向輸送到淋巴結內可以提高療效，與PD-1藥物聯合治療在黑色素瘤小鼠模型中完全緩解（complete response, CR）率達到了40%，并且表現出了長期免疫應答，CR的小鼠相比于未接種疫苗的小鼠，再次接種腫瘤組織后沒有觀察到肺部轉移結節(jié)的發(fā)生。由于每個患者的癌癥類型和免疫系統狀態(tài)都不同，針對每個患者制定個性化的治療方案更有指導意義，腫瘤疫苗的個體化診療也變得愈加重要。Fang等[33]分析了接受多肽疫苗治療的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者的T細胞受體（T cell receptor, TCR），開發(fā)了一個高通量的TCR分析系統，可以為接受免疫療法的各種類型的患者提供詳細的T細胞免疫反應信息，從而更好地了解腫瘤的發(fā)病機制和演變過程；Ding等[34]采集了復發(fā)的晚期肺癌患者血液和腫瘤標本進行了完整外顯子組測序以找到體細胞非同義突變基因，此外還對腫瘤樣本進行了RNA測序（RNA-sequencing, RNA-seq）以確認突變狀態(tài)和確定可能的新抗原，使用個性化的新抗原合成多肽后在體外沖擊自體DC制備成的疫苗成功激活了體內的T細胞，并產生了腫瘤殺傷效應。

2.2 腫瘤疫苗的安全性和有效性 大部分實體瘤早期臨床研究仍然主要關注的是注射疫苗安全性和特異性免疫應答率，雙臂試驗中采用的治療方式為疫苗治療組對比安慰劑組居多，患者對疫苗沒有產生明顯的高級別不良反應，最常見的是注射部位的局部反應[35-38]。除了安全性，治療周期和接種劑量也獲得了不少研究者的關注，在一項尚未完成的隊列[39]中接受高劑量DC疫苗治療的患者總生存期（overall survival, OS）要明顯優(yōu)于低劑量DC疫苗的患者（P＜0.0038）；Vreeland等[40]在2018年發(fā)起了一項研究，確定了減毒多肽疫苗的療效和最佳治療次序、周期；Brunsvig等[41]報道的研究確定了一種端粒酶逆轉錄酶疫苗在700 μg治療劑量下對NSCLC治療效果最好。產生疫苗特異性抗體的患者預后一般要好于預期，部分學者還提出免疫細胞的活性和持續(xù)時間的增加與臨床獲益相關，但整體人群臨床最終結局OS和無進展生存期（progression-free survival,PFS）結果較少[42-44]，這可能是由于疫苗制備技術不完善、腫瘤抗原預測準確性不高、MHC與T細胞親和力較低、免疫應答細胞無法大規(guī)模殺傷腫瘤細胞所致，疫苗的臨床效用轉化為OS和PFS的提升仍然是一項艱巨的任務。在多種實體瘤的聯合治療方面，與PD-1藥物歷史治療數據對比，聯合治療效果優(yōu)于單用免疫治療，也不會引起額外的免疫相關不良事件，這可能是聯合治療方案的優(yōu)勢[30]。一項針對乳腺癌治療的研究[45]指出三陰性乳腺癌亞組可能對腫瘤疫苗獲益更高，作者認為可能是由于疫苗與單克隆抗體產生了免疫協同作用；一項與傳統化療聯合的研究[46]認為腫瘤疫苗可以提高T細胞功能，加強傳統化療方案的療效。Kjeldsen等[47]的小樣本量（n=15）研究指出，與晚期不可切除的NSCLC患者5年OS率小于5%的歷史數據對比，一種多肽疫苗治療中晚期NSCLC患者中位PFS為8.5個月，6年OS率為20%，并且有2例患者在沒有接受其他抗腫瘤治療的情況下在6年后仍有持續(xù)的臨床反應，還有一些PFS和OS獲益的小樣本研究[48]需要擴大樣本量進行下一階段的臨床試驗。

2.3 肺癌相關臨床試驗結果 截至2023年9月，全球共有2936項與腫瘤疫苗有關的臨床試驗，以經濟發(fā)達的美國和西歐地區(qū)為主，肺癌相關腫瘤疫苗臨床試驗有415項（數據來源：ClinicalTrials.gov）。一項2022年針對已注冊的全球NSCLC治療性疫苗臨床試驗特點的研究[49]指出，目前治療性腫瘤疫苗的研究方向以多肽類疫苗為主（41.88%），研究對象主要為III或IV期患者（26.5%），大部分為單臂試驗（52.14%），以小樣本量為主（50人以下的試驗占比56.41%）。這可能是由于多肽疫苗制備容易，副反應小，注射方式簡單，可行性高，晚期患者也是免疫治療的主要針對人群，而單臂小樣本量試驗可以降低獲得試驗結果的成本，盡管隊列入組人數不多，但還是為免疫聯合治療方案提供了有利的依據。在近五年已發(fā)表的與肺癌相關的臨床試驗中（表1）可以觀察到患者不良反應較少，對疫苗較敏感的實體瘤包括黑色素瘤、前列腺癌、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌等，聯合治療方案也產生了一些生存獲益[55,56]，但腫瘤疫苗在最終III期臨床試驗中治療效果表現往往不及預期。黑色素瘤相關抗原3（melanoma antigen family A3, MAGE-A3）是腫瘤組織表達最多的腫瘤-睪丸抗原之一，具有嚴格的組織特異性，除睪丸和胎盤組織外在正常組織和細胞中不表達，但在30%-50%的NSCLC中表達，其中鱗癌的比例相對更高。Vansteenkiste等[57]針對MAGE-A3陽性的NSCLC患者進行了一項III期臨床試驗MAGRIT，MAGRIT是一項針對腫瘤特異性抗原MAGE-A3開發(fā)出的免疫療法，這是迄今為止最大的腫瘤疫苗臨床試驗，有超過14,000例患者接受了篩查，最終取得了陰性結果，目前在臨床I、II期試驗結果較為理想的腫瘤疫苗如L-BLP25、Belagenpumatucel-L、TG4010等在不同癌種的III期臨床試驗結果均為陰性[58-68]。

表1 近5年發(fā)表的肺癌相關有代表性的腫瘤疫苗臨床試驗（數據來源：Clinicaltrials.gov）Tab 1 Representative clinical trials of cancer vaccines related to lung cancer published in the past 5 years (data resource: Clinicaltrials.gov)

2.4 腫瘤疫苗臨床試驗瓶頸 2010年美國Dendreon公司開發(fā)的前列腺癌疫苗Sipuleucel-T（商品名Provenge）為前列腺癌患者的治療帶來了里程碑式的突破[2]，與安慰劑組相比，死亡風險相對降低了22%，風險比（hazard ratio, HR）為0.78，95%置信區(qū)間（confidence interval, CI）為0.61-0.98（P=0.03），中位生存期延長了4.1個月（Sipuleucel-T組為25.8個月，安慰劑組為21.7個月），試驗組的36個月OS率為31.7%，高于安慰劑組的23.0%，最終被FDA批準上市，成為全球首個治療性腫瘤疫苗。但腫瘤疫苗研究遇到的問題主要還是在于相比于化療、靶向治療等免疫治療手段沒有比較優(yōu)勢，僅有部分試驗相較安慰劑組獲得了生存獲益，這可能是受限于實體瘤的異質性高、抗原開發(fā)難度大、疫苗制備技術不完善等。我們認為不同腫瘤疫苗面對的技術難點也略有不同，多肽疫苗的缺點是遞送系統較弱，免疫原性低，可以重點開發(fā)合適的佐劑，并適當增加疫苗的接種次數提高多肽疫苗的遞送能力；mRNA疫苗的主要應用障礙在于mRNA易降解，很難長時間保證RNA的有效性，研究的重點應放在RNA序列設計方面，Zhang等[69]認為可以通過增加mRNA的二級結構等方式延長mRNA的半衰期，并設計了一種機器學習算法使得設計出的疫苗表現出高度穩(wěn)定和效力更強的特征；病毒載體疫苗的劣勢在于大部分人已經對病毒載體產生了免疫力，導致腺病毒、痘病毒等常用的載體無法激發(fā)特異性免疫反應，免疫原性低下，我們認為病毒載體的構建的關鍵在于增強載體的構建，如何增強載體復制能力、提高外源序列表達是下一步研究的重點。

2.5 臨床試驗設計的問題與不足 我們注意到很多臨床試驗中發(fā)生疾病進展、治療副反應、病情惡化的患者往往不能完成整個治療周期或由于改變治療意愿等原因而提前退出試驗[31,64]，最終完成全部疫苗治療周期的人數相比于試驗設計時少。Patel等[52]發(fā)起的臨床試驗入組篩選標準嚴格，需完成同步放化療并鞏固化療4個周期后病情評估為穩(wěn)定或緩解的患者才有資格進入疫苗聯合貝伐珠單抗的維持治療評價隊列，最終完成治療評價的人數不到入組人群的一半，停止治療的最常見原因是疾病進展（16%），其次是毒性并發(fā)癥（15%），所以得到的結論可能出現選擇偏倚，病情較輕的患者在最終結果統計方面可能占比更高，同時由于疫苗的治療方式和原理與免疫制劑類似，非嚴格設計的雙盲試驗容易讓研究者產生信息偏倚。

3 腫瘤疫苗發(fā)展展望

隨著腫瘤發(fā)生機制研究的深入，臨床上對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有了更加深刻的理解，免疫治療受到了更多臨床醫(yī)生的關注[6]。近十年的基礎研究充分說明基于通用腫瘤靶點的免疫治療可以展現可觀的臨床治療效果，而腫瘤疫苗概念的提出正是基于自體免疫反應治療腫瘤的有效方案，其設計原理為治療實體瘤提供了廣闊的研究空間。與手術、放療等局部治療手段不同，腫瘤疫苗的優(yōu)勢在于可以通過免疫系統精準殺傷影像不可見的隱匿性病灶，為根治晚期實體瘤提供了可能。雖然腫瘤疫苗的研究尚處于起步階段，但是隨著新一代分子測序技術的普及、人工智能算法改進和疫苗制備工程的進步，腫瘤疫苗的研究思路將會發(fā)生革命性改變[68,70-72]。腫瘤疫苗需要攻克的關鍵難題是根據不同的腫瘤抗原制備個性化的免疫反應，抗原的選擇是腫瘤疫苗設計最重要的部分，其次就是通過佐劑或制備工藝提高疫苗的免疫效力，最終需要最優(yōu)化的劑量、周期、部位注射方案來實現治療目的[73]。目前來看新抗原似乎是理想條件下抗原的最優(yōu)解，在臨床研究中已經嶄露頭角，新抗原具有強大的免疫效應，而且新抗原又是腫瘤細胞生長發(fā)育所必須的，基本不存在免疫逃逸的可能，尋找合適的新抗原并將其以一定的方式導入APC或組成免疫復合物是解決腫瘤疫苗治療難題的重中之重[68,70,74]。隨著腫瘤新抗原提純技術不斷發(fā)展、抗原提呈過程的研究不斷深入，腫瘤疫苗的設計和制備將會不斷優(yōu)化，實現增強免疫應答、改善免疫微環(huán)境、避免免疫逃逸，為腫瘤治療提供了新的可能。

Competing interests

The authors declare that they have no competing interests.