不同懸鉤子屬植物ITS序列的多態(tài)性分析

高 柱,郭芙蓉,楊靜遠(yuǎn),汪 琪

(1.安徽國科檢測科技有限公司,安徽合肥 230041;2.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,安徽合肥 230036)

懸鉤子屬(Rubus)為薔薇科(Rosaceae)薔薇亞科(Rosoideae)中的一個屬,落葉稀常綠灌木、半灌木或匍匐草本,多年生宿根植物。據(jù)統(tǒng)計,該屬植物目前已發(fā)現(xiàn)700余種,分布于全世界,主要產(chǎn)地在北半球溫帶,少數(shù)分布到熱帶和南半球,我國有204種104變種[1]。懸鉤子植物在我國西南地區(qū),特別是四川、廣東、廣西、福建及云南等[2]地區(qū)有較多分布,占目前全國總懸鉤子屬植物種數(shù)的60%以上。多數(shù)懸鉤子屬植物的果實(shí)、種子、根及葉可入藥,具有驅(qū)寒祛濕、止血止痛、清熱解毒、活血化瘀及固腎澀精等功效[3];有些種類的果實(shí)多漿,味甜酸,可供食用[4]。

懸鉤子屬植物種類繁多[5],植物分類學(xué)家對其分類進(jìn)行了大量研究工作,但不同學(xué)者在懸鉤子屬植物的范圍劃分和亞屬的分類方面有不同見解。1979年劉金[6]將懸鉤子屬植物分為實(shí)心莓亞屬、刺毛莓亞屬、空心莓亞屬、大花莓亞屬和軟枝莓亞屬5個亞屬。俞德浚等[7-9]以懸鉤子屬植物主要器官性狀特征及細(xì)胞學(xué)資料為依據(jù),將已發(fā)現(xiàn)的194種懸鉤子屬植物分為8組24亞組,其中,空心莓組(Sect.Idaeobatus)和木莓組(Sect.Malachobatu)植物包含種類較多?？招妮M(Sect.Idaeobatus)植物又分為11個亞組,共83種50個變種;木莓組(Sect.Malachobatu)植物又分為13個亞組,85種35個變種。亞組之間的分類主要依據(jù)該植物的葉型、花序及葉片性狀等生物學(xué)特征[10]。近年來,我國植物學(xué)工作者在各國家和地區(qū)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)許多新種,如腺果懸鉤子(R.glandulosocarpus)、武夷懸鉤子(R.jiangxiensis)、鉛山懸鉤子(R.yanshanensis)、少花懸鉤子(R.spananthus)和九仙莓(R.yanyunii),補(bǔ)充并完善了我國懸鉤子屬植物的分類系統(tǒng)[11-14]。

懸鉤子屬植物因其種類繁多,變異性大,類型復(fù)雜,而且存在無融合生殖現(xiàn)象,并伴有多倍體出現(xiàn),僅依據(jù)外部形態(tài)特征進(jìn)行分類比較困難。筆者利用DNA條形碼技術(shù),探索懸鉤子屬植物ITS序列的特征,揭示其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,為懸鉤子屬植物的分類鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料用于ITS分析的13份懸鉤子屬核心種質(zhì)資源分別采集自安徽、貴州、浙江、廣西、江西和湖南,定植于安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)國家高新技術(shù)農(nóng)業(yè)園,種質(zhì)信息見表1。

表1 不同懸鉤子屬種質(zhì)資源所屬種類與產(chǎn)地

1.2 懸鉤子屬植物DNA的提取研缽、槍頭、離心管等器材均經(jīng)高溫滅菌處理,利用植物DNA提取試劑盒(艾德萊生物公司,北京)提取懸鉤子屬植物的基因組DNA,具體操作參照試劑盒說明書。檢測合成DNA樣品于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 懸鉤子屬植物ITS序列的克隆克隆ITS序列所用的PCR引物分別為ITS-F:GGAAGGAGAAGTCGTAACAAGG、ITS-R:CTTTTCCTCCGCTTATTGATATG,引物委托公司合成。PCR反應(yīng)體系參照2×TaqMaster Mix說明書(擎科生物科技有限公司,南京)。反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性3 min,變性10 s;55 ℃復(fù)性10 s;72 ℃延伸10 s,35個循環(huán);72 ℃延伸2 min。膠回收采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒(寶生物工程有限公司,大連),膠回收產(chǎn)物委托公司測序。

1.4 懸鉤子屬植物ITS序列的生物信息學(xué)分析采用基于隱馬爾科夫模型的注釋方法(http://its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de/),去除測序序列的5.8S和ITS1序列,獲得ITS2間隔區(qū)序列。利用NCBI網(wǎng)站BLAST工具,對ITS2序列進(jìn)行比對檢驗(yàn)。

利用DNAMAN軟件對5.8S、ITS1和ITS2序列進(jìn)行比對;利用BioEdit 7.0軟件對ITS2序列單個堿基進(jìn)行分析;利用MEGA7軟件對ITS2序列進(jìn)行分析,利用鄰接法(Neighbor Jioning,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。構(gòu)建ITS2系統(tǒng)進(jìn)化樹的近緣植物的相關(guān)序列見表2。

表2 薔薇科近緣植物的ITS2序列

2 結(jié)果與分析

2.1 懸鉤子屬植物基因組DNA的ITS序列克隆及鑒定選取不同懸鉤子屬種質(zhì)資源13份,開展基因組DNA的ITS克隆和分析。以不同供試材料DNA為模板,進(jìn)行了ITS序列的PCR擴(kuò)增,將克隆的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠回收檢測,結(jié)果見圖1。由圖1可知,核心種質(zhì)資源均獲得單一的PCR條帶,條帶大小約500 bp。

注:1～13.A9、A29、S、GH14、JF9、HH2、GB3、TW1、GA1、W5、B1-1、B2-1、B3-1。圖1 13份懸鉤子屬種質(zhì)資源ITS序列的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of ITS sequences of thirteen germplasm resources in the genus Rubus

對供試材料PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,對測序結(jié)果進(jìn)行5.8S、ITS1和ITS2序列分析(表3)。結(jié)果顯示,13份懸鉤子屬種質(zhì)資源ITS區(qū)域的長度在462～464 bp。ITS1的序列長度在208～210 bp,GC含量為55.29%～58.17%;ITS2的序列長度在254～255 bp,GC含量為53.73%～55.12%;13份懸鉤子屬種質(zhì)資源的5.8S序列相對保守,長度均為164 bp,GC含量為54.27%或54.88%。

表3 13份懸鉤子屬種質(zhì)資源ITS序列的長度及GC含量

2.2 懸鉤子屬植物5.8S序列用DNAMAN軟件對ITS序列的5.8S區(qū)域進(jìn)行分析,結(jié)果表明,懸鉤子屬植物的5.8S序列是高度保守的一個變異位點(diǎn)(124位的堿基A變成G)。其中,A9、A29、W5、GH14、JF9、HH2的5.8S區(qū)域序列一致為TAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGA-TGAAGAACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAG-AATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCC-AAAGCCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC;B1-1、B2-1、B3-1、S、GB3、TW1、GA1的序列一致為TAAACGACTCTCGGCAACGGATATCTCGGCTCTCGCATCGATGAAG-AACGTAGCGAAATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCC-CGTGAACCATCGAGTCTTTGAACGCAAGTTGCGCCCGAAG-CCATTAGGCCGAGGGCACGCCTGCCTGGGCGTCACAC。

2.3 懸鉤子屬植物ITS2序列利用BioEdit 7.0和DNAMAN軟件對懸鉤子屬植物的ITS2序列進(jìn)行比對和差異分析(圖2)。結(jié)果顯示,13份懸鉤子屬種質(zhì)資源的ITS2序列變異較大,存在堿基缺失的現(xiàn)象。其中JF9、GB3和TW1在+14 bp處存在1個堿基缺失,B1-1、B2-1和B3-1在+86 bp處存在1個堿基缺失。另外,除了A29、B1-1、S和HH2之外,其余種質(zhì)資源在+123 bp處均存在1個堿基缺失。ITS2含有223個保守位點(diǎn),32個信息位點(diǎn),其中變異位點(diǎn)18個,單個核苷酸差異位點(diǎn)14個。

圖2 13份懸鉤子屬種質(zhì)資源ITS2序列比對Fig.2 Comparison of ITS2 sequences among thirteen germplasm resources in Rubus

2.4 懸鉤子屬植物ITS2序列系統(tǒng)發(fā)育用MEGA7對13份懸鉤子屬種質(zhì)資源的ITS2序列進(jìn)行Kimura 2-parameter遺傳距離分析。并利用相關(guān)植物的ITS2序列作為內(nèi)參,構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖3可知,供試的懸鉤子屬植物與草莓親緣關(guān)系較近(70%的自展支持率),與蘋果、梨和擬南芥分屬不同的進(jìn)化支。不同懸鉤子植物可以分為4個亞簇。其中,簇Ⅰ由空心莓組的掌葉覆盆子A9、A29 和甜葉懸鉤子GH14 3個種質(zhì)資源組成,簇Ⅱ由空心莓組的山莓HH2、JF9和W5 3個種質(zhì)資源組成,簇Ⅲ由懸鉤子組的歐洲木莓B1-1、B2-1和B3-1 3個種質(zhì)資源組成,簇Ⅳ由空心莓組的插田泡GA1、S、GB3和TW1 4個種質(zhì)資源組成,分別獲得87%、85%、96%、58%的自展支持率。

圖3 基于ITS2序列構(gòu)建的懸鉤子屬植物及常見植物的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of plants in Rubus and common plants based on ITS2 sequences

通過對4種標(biāo)準(zhǔn)外緣序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)不同懸鉤子植物ITS2序列在16～18和181～183位點(diǎn)上存在堿基差異,其他位置序列相對保守。由圖4可知,掌葉覆盆子、山莓、歐洲木莓和插田泡的16～18位堿基分別為AAC、AAT、AAA和AAC,其181～183位堿基分別為CGA、CGA、CAA和TGA。因此,不同懸鉤子ITS序列的16～18位、181～183堿基可作為懸鉤子屬植物分類的候選差異位點(diǎn)。由進(jìn)化關(guān)系可知,GH14與掌葉覆盆子為同緣植物,在16～18位點(diǎn)上與掌葉覆盆子一致,但在181～183位點(diǎn)上由掌葉覆盆子的CGA變成了CGG,推測GH14可能是掌葉覆盆子與另一種懸鉤子屬植物的雜交或變異后代。遵循相同的判斷依據(jù),A29在16～18上與掌葉覆盆子一致,在124～126位點(diǎn)上與掌葉覆盆子不一致,而與HH2一樣,HH2為山莓,推測A29可能為掌葉覆盆子與山莓的雜交后代。

圖4 懸鉤子屬植物ITS2區(qū)域的物種鑒定Fig.4 Identification of species in the ITS2 region of plants in the Rubus

3 討論

分子標(biāo)記技術(shù)分為很多種,如RAPD標(biāo)記、SCAR標(biāo)記、DNA序列分析、特殊基因引物的PCR等技術(shù),每種技術(shù)的用途不同。DNA分子標(biāo)記技術(shù)與形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記和蛋白質(zhì)標(biāo)記等傳統(tǒng)的標(biāo)記技術(shù)相比,具有其獨(dú)特性和優(yōu)越性,因?yàn)樗粫艿郊竟?jié)、環(huán)境等條件的限制,在植物發(fā)育的不同時期,均可便捷地獲得DNA樣本[15]。另外,分子標(biāo)記技術(shù)能夠鑒別出目標(biāo)DNA的基因型是否為雜交,也可為任何植物提供較為完整的遺傳信息[16]。因此,DNA分子標(biāo)記技術(shù)在懸鉤子屬植物種間種內(nèi)鑒定中具有較廣的應(yīng)用前景,可提高懸鉤子品種選育的效率。

ITS序列共包含3個部分,分別是ITS1、5.8S和ITS2,其中5.8S序列保守,ITS2應(yīng)用最為廣泛,特別適用于植物種屬之間的系統(tǒng)發(fā)育分析。Chen等[17]對6 000余份樣本進(jìn)行測序分析,指出序列中ITS2的分辨率高達(dá)92.7%;若以屬為基礎(chǔ),ITS2的分辨率甚至可達(dá)到99.8%。我國傳統(tǒng)中藥材由于長期貯藏引起材料中DNA部分降解,ITS2具有較高的PCR擴(kuò)增和測序效率,性能穩(wěn)定,廣泛應(yīng)用于多個科屬植物及藥材的鑒定中[18-19]。例如,以ITS2為基礎(chǔ),針對藥用植物DNA條形碼鑒定的方法也被2010版和2015版的《中國藥典》納入[20]。對于藥用植物中,利用ITS分析可應(yīng)用于藥材真?zhèn)纹返蔫b定上,構(gòu)建藥材的DNA指紋圖譜[21]。例如,用來自全國26個不同地方的牛蒡和4個偽品為材料,ITS序列可準(zhǔn)確將牛蒡和偽品區(qū)別開[22]。

懸鉤子屬植物資源豐富,進(jìn)化歷程相對復(fù)雜,在進(jìn)化中經(jīng)歷了廣泛的雜交[23]、多倍化[24]和基因漸滲[25]等。因此,懸鉤子屬植物種間區(qū)分和進(jìn)化關(guān)系亟待深入研究。筆者在13份懸鉤子屬種質(zhì)資源基因組DNA提取的基礎(chǔ)上,開展了其ITS序列克隆、測序和鑒定。研究發(fā)現(xiàn),不同懸鉤子屬植物5.8S區(qū)域的序列相對保守,僅有一個兼并堿基(14位A變?yōu)镚)差異。不同懸鉤子屬種質(zhì)資源的ITS2序列差異較大,具有區(qū)別不同品系的潛在優(yōu)勢。NJ進(jìn)化樹分析表明,13份懸鉤子屬種質(zhì)資源與同為薔薇科的草莓親緣關(guān)系較近,分為掌葉覆盆子組、山莓組、歐洲木莓組和插田泡組4個亞簇。針對不同亞族間ITS2序列差異堿基,挖掘到ITS2序列在16～18和181～183位點(diǎn)存在種間差異,可作為候選位點(diǎn)區(qū)分不同亞族的品系?；谝陨咸攸c(diǎn),該研究鑒定的ITS2序列作為屬中種間的物種鑒別是可行的。該研究的供試種質(zhì)資源包括懸鉤子屬栽培品種及課題組收集的地方種質(zhì)資源,對其ITS序列進(jìn)行了克隆和分析,為今后研究該屬植物的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。