BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與肝癌TACE 聯(lián)合靶向治療療效及預(yù)后相關(guān)性

陸小華，袁洪新

（南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科，江蘇 南通，226001）

肝癌目前在我國(guó)是第四大惡性腫瘤，其致死率位居第二，僅次于肺癌，肝癌早期隱匿，疾病進(jìn)展較快，絕大多數(shù)患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期或伴有嚴(yán)重肝硬化，此時(shí)已經(jīng)失去最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，而介入治療是其有效替代最佳治療方案[1-2]。經(jīng)動(dòng)脈插管化療栓塞（transcatheter arterial chemoembolization，TACE）是目前治療中晚期肝癌患者常用手段，可有效殺傷腫瘤病灶，改善機(jī)體免疫功能、生活質(zhì)量[3]。臨床評(píng)價(jià)TACE 療效和預(yù)后主要依靠影像學(xué)數(shù)段，從腫瘤數(shù)目、大小等表觀學(xué)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]，但從微觀基因方面評(píng)價(jià)療效和預(yù)后的研究少見(jiàn)。人類(lèi)基因組計(jì)劃研究顯示，不同個(gè)體間相同基因組序列同源度達(dá)99%以上，其余約1%為遺傳變異，多見(jiàn)于單堿基改變，即單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）[5]。最近研究發(fā)現(xiàn)，B 及T 淋巴細(xì)胞弱化因子（B and T lymphocyte attenuator，BTLA）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞抗原-4（cytotoxicT-lymphocyte antigen-4，CTLA-4）等基因多態(tài)性與多種腫瘤易感性密切相關(guān)，其基因位點(diǎn)突變可增加腫瘤發(fā)生[6-7]?；谝陨媳尘埃狙芯縿?chuàng)新性觀察BTLA、CTLA-4基因多態(tài)性與肝癌TACE 聯(lián)合靶向治療療效及預(yù)后相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 病例選擇

選取2021 年1 月至2021 年12 月南通大學(xué)附屬醫(yī)院介入放射科收治的新發(fā)85 例肝癌患者作為研究對(duì)象，其中男65 例，女20 例；年齡36～65 歲，平均（52.35±5.34）歲；Child-Pugh 分級(jí)：75 例A 級(jí)，10 例B 級(jí)；BCLC 分期：20 例B 期，65 例C 期。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019 年版）》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診；均行TACE 聯(lián)合靶向治療；美國(guó)東部腫瘤協(xié)作組體能狀態(tài)評(píng)分均為0～1 分；Child-Pugh 分級(jí)為A 級(jí)、B 級(jí)；BCLC 分期為B 期、C 期；TACE 前白細(xì)胞≥4.0×109/L、血紅蛋白≥8.0 g/L；無(wú)全身性感染疾?。唤? 個(gè)月無(wú)免疫抑制、激素藥物治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：大量腹水經(jīng)治療后不能消除；近3 個(gè)月出現(xiàn)消化道出血；既往存在肝移植、放化療或系統(tǒng)性等治療；嚴(yán)重脾功能亢進(jìn)；其他惡性腫瘤；預(yù)計(jì)生存期 ＜ 6 個(gè)月；免疫系統(tǒng)疾??；妊娠期或哺乳期女性。本研究獲得南通大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)：2020-K024-01）。

1.2 治療方法

所有受試者均在Innova IGS540 DSA 血管造影X 射線(xiàn)機(jī)（美國(guó)GE 公司）行TACE 治療。操作步驟：常規(guī)碘伏消毒、1%利多卡因局部麻醉，采用Seldinger 改良法經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈穿刺置鞘，置入5F RH 導(dǎo)管至腹腔干、腸系膜上動(dòng)脈，行碘克沙醇造影，確定腫瘤供血?jiǎng)用}。用Progreat 微導(dǎo)管或Merit 微導(dǎo)管超選進(jìn)入肝臟腫瘤動(dòng)脈供血分支中，灌注表柔比星0～30 mg、洛鉑20～30 mg化療藥物，予表柔比星10 mg 與碘化油混制乳劑10～25 mL 栓塞，至腫瘤內(nèi)碘油沉積致密后終止栓塞。最后再次造影，顯示腫瘤供血?jiǎng)用}分支栓塞滿(mǎn)意后結(jié)束手術(shù)。所有入組患者均在TACE 治療后3～7 d 開(kāi)始口服索拉非尼（400 mg bid）或侖伐替尼（＜ 60 kg 患者，8 mg，qd；≥60 kg 患者，12 mg，qd），如患者出現(xiàn)藥物相關(guān)嚴(yán)重不良事件則適當(dāng)減少劑量或停藥觀察。

療效評(píng)估：治療1 個(gè)月后，根據(jù)RECIST 實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)估[9]，完全緩解：腫瘤病灶完全消失，部分緩解：病灶直徑減小≥50%，穩(wěn)定：病灶直徑減小 ＜ 50%，進(jìn)展：病灶直徑增加 ＞ 25%或出現(xiàn)新病灶。有效組：完全緩解、部分緩解、穩(wěn)定；疾病進(jìn)展組：進(jìn)展。

1.3 BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性檢測(cè)

采集2 組患者靜脈血3 mL，經(jīng)抗凝處理后，按照DNA 抽提試劑盒（上海生工公司）提取患者DNA，并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)定量。獲取CTLA-4 基因rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點(diǎn)、BTLA 基因 rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成SNP 位點(diǎn)擴(kuò)增引物，PCR 體系如下：2 μL DNA 模板（10 ng/μL），上下游引物各1 μL，15 μL 2×PCR Ready Mix，在PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min、94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，共35 次循環(huán)，72℃終延伸10 min，4℃保存。反應(yīng)結(jié)束后，采用1%瓊脂糖膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，確定產(chǎn)物大小，用AMPure XP 磁珠純化、回收。最后使用HiSeq XTen 測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。采用panel 高通量數(shù)據(jù)分析基因分型。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）比較2 組臨床資料，包括性別、腫瘤最大徑、年齡、腫瘤數(shù)目、BMI、Child-Pugh 分級(jí)、BCLC 分期、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯；（2）分析BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果，CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點(diǎn)、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859 629T 位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律；（3）比較2 組BTLA、CTLA-4 基因位點(diǎn)基因型；（4）單因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與療效的相關(guān)性；（5）比較不同BTLA、CTLA-4 基因位點(diǎn)基因型患者生存預(yù)后狀況；（6）單因素、多因素分析BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與生存預(yù)后的相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臨床病歷資料收集使用EXCEL 2019，數(shù)據(jù)處理使用軟件SPSS 25.0，計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料用Ridit檢驗(yàn)；計(jì)量資料呈方差齊性、近似服從呈正態(tài)分布以（）表示，采用t檢驗(yàn)；采用K-M 法繪制生存曲線(xiàn)，單因素、Logistic 多因素回歸分析BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與療效、預(yù)后相關(guān)性。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組臨床資料

2 組年齡、性別、BMI 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目、Child-Pugh 分級(jí)、BCLC 分期、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

表1 2 組臨床資料比較[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

表1 2 組臨床資料比較[n（%）/（）]Tab.1 Comparison of clinical data between two groups [n（%）/（）]

*P ＜ 0.05。

2.2 BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果

經(jīng) TaqMan qRT-PCR 檢測(cè)顯示，BTLA rs2171513 位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA；rs3112270位點(diǎn)基因型為AA、AG、GG；rs1982809 位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA；rs16859629T 位點(diǎn)基因型為T(mén)T、TC、CC；CTLA-4 rs231775 位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA；rs733618 位點(diǎn)基因型為CC、CT、TT；rs3087243 位點(diǎn)基因型為GG、GA、AA；rs4553808 位點(diǎn)基因型為AA、AG、GG。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，隨機(jī)選取10%樣本進(jìn)行基因測(cè)序驗(yàn)證，使用SeqMan 軟件查看測(cè)序結(jié)果，證實(shí)上述位點(diǎn)存在基因多態(tài)性。

本研究85 例患者CTLA-4 rs231775、rs733618、rs3087243、rs4553808 位點(diǎn)、BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點(diǎn)基因型分布情況，見(jiàn)表2。經(jīng)符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)，具有人群代表性。

2.3 2 組BTLA、CTLA-4 基因型分布情況

2 組 BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位點(diǎn)基因型分布情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；治療有效組BTLA rs3112270 位點(diǎn)AG、GG 基因型比例、rs1982809 位點(diǎn)GA、AA比例、rs16859629 位點(diǎn)CC 基因型、CTLA-4 rs231775 位點(diǎn)AA 基因型比例、rs3087243 位點(diǎn)GA、AA 基因型低于疾病進(jìn)展組，BTLA rs3112270位點(diǎn)AA 基因型比例、rs1982809 位點(diǎn)GG 比例、rs16859629 位點(diǎn)TT 基因型、CTLA-4 rs231775 位點(diǎn)GG 基因型比例、rs3087243 位點(diǎn)GG 基因型高于疾病進(jìn)展組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表3。

2.4 BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與療效的相關(guān)性

在進(jìn)行Logistic 多因素回歸分析時(shí)，將腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目、Child-Pugh 分級(jí)、BCLC 分期、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯等其他混雜因素進(jìn)行校正。經(jīng)單因素、Logistic 多因素回歸分析顯示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 與療效無(wú)關(guān)（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與療效相關(guān)（P＜ 0.05），見(jiàn)表4。

2.5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存預(yù)后狀況

85 例患者隨訪(fǎng)18 個(gè)月，脫落3 例，生存率為 68.29%（56/82）。KM 曲線(xiàn)分析，BTLA rs2171513、CTLA-4 rs733618、rs4553808 位點(diǎn)不同基因型患者隨訪(fǎng)18 個(gè)月生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270 位點(diǎn)AA、AG 基因型患者18 個(gè)月生存率高于GG 基因型患者，rs1982809 位點(diǎn)GG、GA 基因型患者18 個(gè)月生存率高于AA 基因型患者，rs16859629 位點(diǎn)TT 基因型患者18 個(gè)月生存率高于TC、CC 基因型患者（P＜ 0.05）；CTLA-4 rs231775 位點(diǎn)GG、GA 基因型患者18 個(gè)月生存率高于AA 基因型患者、rs3087243 位點(diǎn)GG 基因型18 個(gè)月生存率高于GA、AA 基因型患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05），見(jiàn)表5、圖1～2。

圖1 不同BTLA 位點(diǎn)基因型患者生存曲線(xiàn)Fig.1 Survival curves of patients with different BTLA loci genotypes

圖2 不同CTLA-4 位點(diǎn)基因型患者生存曲線(xiàn)Fig.2 Survival curves of patients with different CTLA-4 genotypes

表5 不同BTLA、CTLA-4 基因型患者生存預(yù)后狀況比較Tab.5 Comparison of survival and prognosis of patients with different BTLA and CTLA-4 genotypes

2.6 BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與生存預(yù)后的相關(guān)性

在進(jìn)行Logistic 多因素回歸分析時(shí)，將腫瘤最大徑、腫瘤數(shù)目、Child-Pugh 分級(jí)、BCLC 分期、肝外轉(zhuǎn)移、血管侵犯等其他混雜因素進(jìn)行校正。單因素、Logistic 多因素回歸分析顯示，BTLA rs2171513G ＞ A、CTLA-4 rs733618C ＞ T、rs4553808A ＞ G 與生存預(yù)后無(wú)關(guān)（P＞ 0.05）；BTLA rs3112270A ＞ G、rs1982809G ＞ A、rs16859629T ＞C、CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與生存預(yù)后相關(guān)（P＜ 0.05），見(jiàn)表6。

表6 BTLA、CTLA-4 基因多態(tài)性與生存預(yù)后的相關(guān)性Tab.6 Correlation between BTLA and CTLA-4 gene polymorphism and survival prognosis

3 討論

TACE 是治療中晚期肝癌的首選治療手段，與靜脈滴注或口服化療藥物不同，TACE 是利用股動(dòng)脈插管至肝動(dòng)脈，將化療藥物送入行局部治療并進(jìn)行栓塞，可有效提高病灶組織藥物濃度，阻斷腫瘤血供，提高治療率[10-11]。臨床有關(guān)TACE 后治療療效和疾病預(yù)后評(píng)估方法較多，主要采取實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和影像學(xué)等，從宏觀和表觀學(xué)方面對(duì)其進(jìn)行評(píng)估[12]。

近年研究證實(shí)，遺傳易感性可影響肝癌發(fā)生發(fā)展，迄今為止，研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)在人類(lèi)基因組中約有一千萬(wàn)個(gè)SNPs，平均每100～300 個(gè)堿基對(duì)有一個(gè)SNPs 位點(diǎn)[13]。大量遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，一些基因SNPs 與疾病、腫瘤易感性、療效評(píng)估、預(yù)后有關(guān)[14-15]。BTLA 是免疫蛋白超家族成員，也是第3 個(gè)被發(fā)現(xiàn)免疫抑制受體，主要位于細(xì)胞膜表面，定位在3 號(hào)染色體3q13 區(qū)域，結(jié)構(gòu)與CTLA-4、程序死亡因子-1 的抑制因子類(lèi)似，主要通過(guò)調(diào)節(jié)T、B 淋巴細(xì)胞、DC 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等表達(dá)，在T 淋巴細(xì)胞活化階段發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用[16]。正常情況下，BTLA 可與配體結(jié)合，進(jìn)而抑制淋巴細(xì)胞過(guò)度活化，以防止自身免疫系統(tǒng)損傷；體內(nèi)免疫功能一旦失衡，BTLA 可通過(guò)介導(dǎo)Th1/Th2 細(xì)胞平衡、CD8+T 細(xì)胞毒性，促進(jìn)細(xì)胞釋放過(guò)量炎性因子，進(jìn)而加重疾病進(jìn)展[17]。目前有文獻(xiàn)報(bào)道，BTLA 基因多態(tài)性與腫瘤發(fā)生具有明顯關(guān)聯(lián)性[18]，如Fu 等[19]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，BTLA rs1844089 C ＞ G、rs2705535A ＞ G 位點(diǎn)可增加乳腺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。王居巳[20]研究顯示，BTLA rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 基因多態(tài)性可增加非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞易感性，但rs2171513 G ＞A、rs3112270 A ＞ G 可降低非小細(xì)胞肺癌易感性。本研究通過(guò)分析BTLA rs2171513、rs3112270、rs1982809、rs16859629T 位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)2 組BTLA rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點(diǎn)基因型比較，差異顯著，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，BTLA rs3112270 A ＞ G、rs1982809 G ＞ A、rs16859629 T ＞ C 與肝癌療效、預(yù)后密切相關(guān)。先前有報(bào)道顯示，接受鉑類(lèi)藥物化療可損傷患者DNA，引起堿基序列改變，導(dǎo)致基因?qū)NA 損傷修復(fù)不及時(shí)，不能及時(shí)修復(fù)化療藥物引起的NA 損傷，增加化療藥物耐藥性，影響治療效果[21]。本研究中TACE 聯(lián)合靶向治療，化療藥物采用表柔比星、洛鉑，前者為細(xì)胞周期非特異性藥物，可迅速進(jìn)入細(xì)胞核與DNA 結(jié)合，有效抑制核酸合成和有絲分裂進(jìn)程，阻止RNA 合成；而后者是第3 代鉑類(lèi)化療藥物，不僅影響DNA 合成、復(fù)制，還可影響原癌基因c-mye 表達(dá)。

CTLA-4 是T 淋巴細(xì)胞表面較為重要共刺激基因，與CD28 屬同一家族，主要位于染色體2q33 區(qū)域，可與CD28 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B7-1/B7-2 分子，從而發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞增殖分化作用，還可抑制細(xì)胞因子分泌、阻止細(xì)胞周期進(jìn)展[22]。CTLA-4 也是腫瘤免疫檢查點(diǎn)基因，在腫瘤免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，目前已有研究顯示，CTLA-4 基因多態(tài)性與腫瘤、自身免疫疾病遺傳和環(huán)境易感性中存在關(guān)聯(lián)性，可增加腫瘤、疾病患病風(fēng)險(xiǎn)[23-24]。如Liu 等[25]研究顯示，CTLA-4 rs231775與轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌療效、預(yù)后密切相關(guān)。Qin等[26]通過(guò)分析CTLA-4 rs231775、rs3087243、rs4553808、rs5742909、rs733618 位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)rs733618 GG 位點(diǎn)與骨髓瘤療效、預(yù)后密切相關(guān)。本研究顯示，2 組CTLA-4 rs231775、rs3087243位點(diǎn)基因型差異比較，存在明顯差異，單因素和多因素分析顯示，CTLA-4 rs231775A ＞ G、rs3087243G ＞ A 與療效、預(yù)后相關(guān)，這與Qin 等[26]研究結(jié)果不一致。分析原因：可能是因?yàn)? 種化療方式、化療藥物、CTLA-4 基因位點(diǎn)較多等有關(guān)，機(jī)體內(nèi)基因調(diào)控機(jī)制較為復(fù)雜，相同基因位點(diǎn)在不同腫瘤中表現(xiàn)不一。

綜上所述，本研究證實(shí)BTLA 基因rs3112270、rs1982809、rs16859629 位點(diǎn)、CTLA-4 基因rs231775、rs3087243 位點(diǎn)多態(tài)性與肝癌TACE 聯(lián)合靶向治療療效、預(yù)后存在相關(guān)性，測(cè)定相關(guān)基因型可為臨床制定治療方案提供參考依據(jù)。因樣本量偏少，不可避免存在選擇偏倚。在今后的研究中我們將擴(kuò)充樣本量，以期取得更有說(shuō)服力的結(jié)果。