MSC 來(lái)源外泌體治療缺血性腦卒中機(jī)制及進(jìn)展

曹詩(shī)杰 ，安紅偉

（1）廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001;2）柳州市中醫(yī)醫(yī)院腦病科，廣西 柳州 545001）

腦部缺血性疾病是臨床上常見(jiàn)的疾病之一，其中缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）則是一種常見(jiàn)的損傷形式。在缺血性腦卒中中扮演重要角色。缺血誘導(dǎo)的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)加劇組織器官損傷，故減輕炎癥反應(yīng)和促進(jìn)血管生成是保護(hù)組織器官免受卒中損傷的主要途徑。目前研究[1]表明間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSC）表達(dá)趨化因子受體感知炎癥信號(hào)使炎細(xì)胞向炎癥部位遷移、釋放細(xì)胞因子以抑制炎癥反應(yīng)，同時(shí)表達(dá)生長(zhǎng)因子以促進(jìn)血管愈合并介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhao 等[2]研究發(fā)現(xiàn)，使用來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體進(jìn)行治療7 d 后，腦缺血大鼠的記憶、運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)能力顯著提高。然而間充質(zhì)干細(xì)胞存在移植存活率低、歸巢率低、低免疫原性和高致瘤率等不足限制了其在臨床上廣泛應(yīng)用。腦損傷的大鼠在使用外泌體治療后，表現(xiàn)出顯著的功能恢復(fù)，如軸突重塑、神經(jīng)生成及血管生成的增多等[3]。臨床研究方面[4]也表明外泌體作為干細(xì)胞移植的替代方案具有顯著的治療潛力，此外，經(jīng)過(guò)功能化修飾的外泌體能更好地滿足治療需求，從而提高治療效果。本文為缺血性腦卒中的臨床治療提供全新的治療思路，揭示了間充質(zhì)干細(xì)胞釋放的外泌體在治療腦卒中方面的作用機(jī)制，這一發(fā)現(xiàn)揭示了治療腦血管疾病的新奧秘。

1 腦卒中發(fā)生機(jī)制概述

在腦缺血再灌注過(guò)程中，血液供應(yīng)受到限制，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞屏障的功能受到破壞，同時(shí)，血管的通透性也會(huì)受到影響，導(dǎo)致滲出液的增加。缺血缺氧產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，激活免疫反應(yīng)，損傷血腦屏障功能，加重神經(jīng)元損傷。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)恢復(fù)再灌注的早期，腦毛細(xì)血管內(nèi)開(kāi)始聚集的白細(xì)胞引起血流淤積，形成機(jī)械損傷及微血栓等，造成下游灌注缺陷及無(wú)復(fù)流（缺血后血流得到了及時(shí)的恢復(fù)，但是缺血器官不一定能馬上恢復(fù)血液灌注）。這些損傷不僅對(duì)神經(jīng)元功能有直接影響，而且這些損傷信號(hào)的持續(xù)會(huì)激活局部或全身炎癥反應(yīng)。此外，再灌注損傷的特征表現(xiàn)為免疫反應(yīng)的增強(qiáng)和細(xì)胞死亡程序的激活，例如腦發(fā)生卒中時(shí)，腦卒中患者在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和修復(fù)反應(yīng)中都會(huì)擾亂免疫平衡，腦卒中觸發(fā)神經(jīng)免疫軸的激活，包括駐留在腦實(shí)質(zhì)、軟膜和血管床內(nèi)的免疫系統(tǒng)的多種細(xì)胞，以及通過(guò)分泌代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)和招募免疫細(xì)胞[5]。在缺氧的情況下，會(huì)產(chǎn)生大量的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧簇增多。同時(shí)，Toll樣受體4（TLR4）也會(huì)被激活，并啟動(dòng)下游核因κB（NF-κB）信號(hào)通路[6]。組織缺氧抑制氧敏感的脯氨酸羥化酶（prolyl hydroxylases，PHD），低氧抑制PHD 酶激活NF-kB，促進(jìn)炎癥，缺血期氧化應(yīng)激經(jīng)歷一系列過(guò)程促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]。缺血和再灌注期間的無(wú)菌炎癥以炎細(xì)胞聚集為特征。特別是在再灌注早期，天然免疫細(xì)胞在浸潤(rùn)細(xì)胞中占主導(dǎo)地位，激活炎癥加重組織損傷。而在缺血再灌注后，單核細(xì)胞從脾被招募到受損組織中，參與傷口愈合。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞特性及外泌體概述

炎癥環(huán)境中免疫細(xì)胞的組成和狀態(tài)變化會(huì)影響MSC 調(diào)節(jié)炎癥的能力，組織駐留的MSC 在恢復(fù)受損組織的免疫穩(wěn)態(tài)方面可能不如輸注的MSC有效[8]。這種差異的一個(gè)可能的解釋是，在體外擴(kuò)增的MSC 通常被大量輸入1～2×106/Kg（細(xì)胞數(shù)/體重），以及在正常狀態(tài)下，骨髓細(xì)胞內(nèi)干細(xì)胞濃度＜0.05×106/Kg（細(xì)胞數(shù)/體重），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于靜脈輸入的濃度。另外一個(gè)潛在的原因是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)，其免疫功能發(fā)生了變化。外泌體（Exosomes）是一種粒徑在40～90 nm 之間的脂質(zhì)膜囊泡[9]。外泌體的生成取決于細(xì)胞內(nèi)部的內(nèi)部切割體形成。在內(nèi)部切割體被泛素標(biāo)記后，它會(huì)被降解并封裝在囊泡中，形成腔內(nèi)小泡。這些腔內(nèi)小泡將會(huì)形成多囊泡體，即包含多個(gè)小泡的內(nèi)部結(jié)構(gòu)（multi-vesicular body，MVB）。溶酶體會(huì)從多囊泡體中接收這些腔內(nèi)小泡，并分解其內(nèi)部?jī)?nèi)容物為氨基酸和糖類物質(zhì)，這些降解物又回到細(xì)胞質(zhì)中以便進(jìn)一步再利用，當(dāng)腔內(nèi)小泡內(nèi)的物質(zhì)向細(xì)胞表面遷移并釋放到細(xì)胞外部時(shí)，這些內(nèi)容物被稱作外泌體，然而目前此機(jī)理尚不明確。最后，這些小的細(xì)胞外囊泡能夠經(jīng)由表面蛋白的靶向性傳遞到接受信號(hào)的細(xì)胞上。當(dāng)這些囊泡與靶細(xì)胞表面粘附時(shí)，它們可以與細(xì)胞表面的配體及受體相互作用，并被細(xì)胞吞噬或內(nèi)吞，甚至可以與細(xì)胞膜融合，將物質(zhì)輸送至細(xì)胞內(nèi)。此外，外泌體還可運(yùn)載多個(gè)信號(hào)分子，通過(guò)調(diào)控靶細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞的信息傳遞，進(jìn)而影響其生理功能。

3 來(lái)源的外泌體對(duì)腦卒中的影響研究

3.1 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體保護(hù)腦卒中抑炎反應(yīng)

在卒中動(dòng)物模型中，組織細(xì)胞的壞死會(huì)引起發(fā)炎。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促炎因子聚集是引發(fā)炎癥的重要原因。初期的炎癥反應(yīng)會(huì)把死亡的細(xì)胞和細(xì)胞碎片都清除掉，同時(shí)還會(huì)對(duì)存活的神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生進(jìn)一步的損傷，但是這種損傷會(huì)慢慢地被抑制炎癥的修復(fù)所替代，此時(shí)傷口愈合和疤痕形成。而在腦卒中，炎癥途徑不僅被激活，炎癥導(dǎo)致腦血管的脆性增加和凝血失衡，其特征由最初的微血管血栓形成至后腦出血。Zou 等[10]先前的研究指出，在應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血-再灌注損傷大鼠模型后，大鼠體內(nèi)的炎性因子，如干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素6（IL-6）等的表達(dá)水平被降低。常駐的小膠質(zhì)細(xì)胞是腦卒中首先感知損傷的免疫細(xì)胞，其次是微環(huán)境特定的內(nèi)皮細(xì)胞，然后是招募的白細(xì)胞。腦缺血后，巨噬細(xì)胞會(huì)進(jìn)入大腦并轉(zhuǎn)化為小膠質(zhì)細(xì)胞。在中風(fēng)的早期階段，M1 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量也會(huì)增多并被募集到炎性區(qū)，通過(guò)鑒定損傷相關(guān)分子在損傷細(xì)胞表面的表達(dá)或釋放，以確定損傷位置并對(duì)死亡細(xì)胞和細(xì)胞碎片進(jìn)行清除。神經(jīng)元損傷時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，并上調(diào)表面特異性分子，如CD11b、Iba-1、CD40、CD80/86 和主要組織相容性復(fù)合體II 類，星形膠質(zhì)細(xì)胞具有分泌作用，可以產(chǎn)生促炎因子，例如單核細(xì)胞趨化蛋白-1 和CxC-趨化因子配體，并且也具有分泌抗炎因子的能力，例如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-Β、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等趨化因子或細(xì)胞因子。以促進(jìn)損傷或修復(fù)[5]。Zou 等[11]在大鼠缺血1h 后，立即注射間充質(zhì)干細(xì)胞衍生的外泌體，發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注過(guò)程中可以明顯提高CX3C 趨化因子配體1（CX3CL1）在組織中的表達(dá)。而注射外泌體后下調(diào)其表達(dá)，CX3CL1 通過(guò)與相應(yīng)受體（chemokine receptor 1，CX3CR1）結(jié)合，CX3C 趨化因子配體1可促進(jìn)巨噬細(xì)胞在炎性微環(huán)境中的浸潤(rùn)，已證實(shí)，來(lái)源于外泌體的MSC 可以降低CX3CL1 的表達(dá)水平，從而減少巨噬細(xì)胞的聚集。進(jìn)一步的研究表明，miR-16、miR-15a 和miR-15b 等分子可以抑制CX3CL1 的表達(dá)，從而阻止促炎細(xì)胞在缺血區(qū)的聚集[8]。在晚期，M2 型巨噬細(xì)胞的數(shù)量明顯增多，除了分泌抗炎因子外，它們還可以釋放多種生長(zhǎng)因子。這些細(xì)胞在創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并且可以減輕梗死導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。

經(jīng)過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體逆轉(zhuǎn)作用，可抑制半胱氨酰白三烯受體（CysLT2R）的作用，同時(shí)通過(guò)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK1/2）調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的M1 極化，從而顯著改善腦損傷。這種作用有助于降低小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，并增強(qiáng)促炎因子的減少，同時(shí)激活M2 小膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)修復(fù)，增加CD206 含量，從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受神經(jīng)炎癥的影響。深入研究表明，這種作用可以導(dǎo)致胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracelluar signal-regulated kinase，ERK1/2）的表達(dá)和磷酸化水平顯著降低[2]。Zhao等[12]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-182 可抑制TLR4/NFκB 信號(hào)通路，從而負(fù)性調(diào)節(jié)M1 型巨噬細(xì)胞并緩解炎性反應(yīng)。經(jīng)過(guò)MSC 來(lái)源外泌體處理或miR-182 轉(zhuǎn)染后，TLR4/NF-κB 被抑制，而磷脂酰肌醇3 激酶（PI-3K）/蛋白激酶B（PKB）被活化。然而，TLR4/NF-B 與PI3K/Akt 信號(hào)通路之間的交互作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。另外，Liu 等[13]的研究表明，在腦缺血后，機(jī)體內(nèi)TLR4 的表達(dá)升高，而不是TLR2、TLR7 或是TLR9，同時(shí)MSC 及其分泌的外泌體可促進(jìn)損傷修復(fù)。

3.2 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體促進(jìn)腦卒中血管生成機(jī)制

研究表明，MSC 釋放的外泌體可以對(duì)缺血再灌注過(guò)程中受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞起到保護(hù)作用，這種作用是通過(guò)活化蛋白激酶B（Akt）實(shí)現(xiàn)的[14]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[15]，MSC 來(lái)源的外泌體中miR-126 的過(guò)度表達(dá)或敲除會(huì)分別增加或減弱MSC 釋放的外泌體中Akt 和內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）的磷酸化水平。進(jìn)一步研究表明，MSC 來(lái)源的外泌體中的miR-126 可以通過(guò)PI3K 信號(hào)通路減輕缺血再灌注損傷[16]，這提示MSC 來(lái)源的外泌體miR-126 可能通過(guò)激活PI3K/Akt/eNOS 途徑，提高血小板源生長(zhǎng)因子（PDGF）和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的水平，從而維持缺血損傷早期的血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)和功能、增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、存活和血管生成能力、促進(jìn)后期血管生成和血管重塑。據(jù)報(bào)道，MSC 來(lái)源miR-126 還可以激活MAPK/ERK 途徑，該信號(hào)通路有助于下游轉(zhuǎn)錄因子Ets-1 的上調(diào)，由此推測(cè)MSC 來(lái)源外泌體可能通過(guò)激活MAPK/ERK 通路和上調(diào)血管內(nèi)皮中Ets-1 來(lái)增加內(nèi)源性miR-126 的表達(dá)，這有待于進(jìn)一步的研究。Chen 等[17]研究表明MSC 來(lái)源的外泌體miR-150-5p 下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶14（Matrix metallo protein，MMP14）與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 和VEGF，調(diào)節(jié)血管穩(wěn)定性和血管對(duì)組織損傷的反應(yīng)。

3.3 間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體保護(hù)腦卒中凋亡機(jī)制

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的外泌體減少了一種催化天冬氨酸羧基側(cè)鏈切斷肽鍵的半胱氨酸蛋白酶種屬中Caspase-3、Caspase-9 和Bax（BCL-2-Associated X 的蛋白質(zhì)）的表達(dá)量，增強(qiáng)BCL-2的表達(dá)水平，證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其分泌的外泌體抑制了線粒體細(xì)胞凋亡[18]。單獨(dú)使用外泌體對(duì)中風(fēng)的影響與MSC 相似，這表明外泌體可能是MSC 抗細(xì)胞凋亡的重要因素。趙金璇等[19]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路失活時(shí)，細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶Alpine-3 的表達(dá)也減少。推測(cè)MSC 泌體mi-182 通過(guò)TLR4/NF-κB 信號(hào)通路對(duì)腦缺血起到保護(hù)作用，抑制血管上皮細(xì)胞凋亡。郝海珍等[20]發(fā)現(xiàn)，MSC 外泌體顯著抑制了大鼠缺血性卒中后細(xì)胞色素C（CYP3A）和IL-1β 以及神經(jīng)元凋亡指數(shù)的表達(dá)水平。Wang 等[21]發(fā)現(xiàn)，MSC 來(lái)源外泌體中的C-趨化因子受體2（CCR2）降低了其配體（CCL2）的表達(dá)水平，從而達(dá)到其對(duì)免疫細(xì)胞吸引和激活的抑制作用，而MSC 外泌體在下調(diào)CCR2 后對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用明顯降低。

4 腦卒中的治療方法

4.1 現(xiàn)有治療手段的不足

在腦卒中的治療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)單純抗炎的效果并不理想，而且不能有效促進(jìn)修復(fù)途徑的激活。鑒于此，近年來(lái)干細(xì)胞成為治療卒中的研究熱點(diǎn)。然而，靜脈輸注的間充質(zhì)干細(xì)胞大部分會(huì)粘附于毛細(xì)血管，真正達(dá)到損傷靶組織的量較少，MSC難以輸送到卒中病灶，限制其在缺血性卒中治療中的臨床應(yīng)用，此外，盡管在全身輸注后，缺血損傷部位中可能會(huì)積聚少量的MSC，但MSC 在炎癥和缺氧條件下的存活率很低[22]。這些是干細(xì)胞治療卒中最嚴(yán)重的缺點(diǎn)[23]。除靜脈輸入MSC 外，侵襲性的腦內(nèi)輸入MSC 可能會(huì)對(duì)腦組織造成額外損害。與直接輸入相比，靜脈給藥更簡(jiǎn)單，侵入性更小。

4.2 MSC 來(lái)源外泌體在卒中中的的療效潛力

前期研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）的外泌體擁有與MSC 類似的治療中風(fēng)的效果。相比之下，外泌體具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）外泌體的分子質(zhì)量較小，能夠穿過(guò)各種組織屏障，包括血腦屏障。由于外泌體為納米級(jí)，因此它們能夠穿過(guò)肺部毛細(xì)血管，有效地預(yù)防由于系統(tǒng)輸液后導(dǎo)致肺部積液積聚；（2）外泌體治療方法可以減少干細(xì)胞療法可能帶來(lái)的危害，包括由免疫原性造成的排異反應(yīng)和MSC 治療由于生存率低而造成的治療效果差等問(wèn)題[24-25]；（3）外泌體不依賴于血管栓塞，也不依賴于干細(xì)胞的分化，它可以自己攜帶蛋白和核酸，具有比干細(xì)胞更加精準(zhǔn)的療效[26]；（4）外泌體的表面標(biāo)志物CD9、CD63 和CD81 是特定的[27]，這為治療腦血管病提供了新的機(jī)會(huì)。增加外泌體與目標(biāo)組織的相互作用[28]，可以提高它們與腦小膠質(zhì)細(xì)胞的粘附度，最終可輕松地穿透血腦屏障并被腦小膠質(zhì)細(xì)胞有選擇性地吞噬[29]；（5）針對(duì)需要緊急治療的患者而言，自體間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療可能并不是最理想的選擇。這是因?yàn)樵谶M(jìn)行移植治療之前，需要進(jìn)行體外擴(kuò)增自體間充質(zhì)干細(xì)胞的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程非常耗時(shí)。此外，通過(guò)利用細(xì)胞外囊泡可以避免已經(jīng)發(fā)生基因突變或細(xì)胞損傷的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

總的來(lái)說(shuō)，因?yàn)橥饷隗w的納米尺寸、提供了內(nèi)部的微環(huán)境，使其所含物質(zhì)能遠(yuǎn)距離地在體內(nèi)擴(kuò)散而不會(huì)被分解以及將被傳遞物質(zhì)傳遞至受體細(xì)胞的能力，可作為一種有潛力的基因或者藥物載體而被廣泛應(yīng)用于臨床[30]。

5 小結(jié)

外泌體因其特有的優(yōu)勢(shì)，已成為腦梗死防治的新靶點(diǎn)。但是，當(dāng)前外泌體的異質(zhì)性，也就外泌體的性質(zhì)隨著其來(lái)源細(xì)胞的種類和狀態(tài)的差異而發(fā)生變化，這給研究人員帶來(lái)了困擾。為了識(shí)別并有選擇地分離每種外泌體，需要根據(jù)其特性進(jìn)行分類。此外，還需要將外泌體在培養(yǎng)環(huán)境中的影響、將分離方法、干細(xì)胞來(lái)源和干細(xì)胞狀態(tài)考慮在內(nèi)，以達(dá)到對(duì)干細(xì)胞的純化，這也是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。未來(lái)研究的主要方向是如何增強(qiáng)外泌體作為藥物傳遞系統(tǒng)的效率，以更好地為臨床醫(yī)學(xué)提供服務(wù)。所幸的是，經(jīng)過(guò)改良的外泌體可以部分地解決針對(duì)歸巢性的問(wèn)題。例如，將含有Arg-Gly-Asp（RGD）肽的配體引入外泌體表面的修飾，可以增加來(lái)自MSC 的外泌體在腦缺血區(qū)的聚集[31]。然而，RGD 肽的結(jié)合需要多次復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)步驟，這可能會(huì)對(duì)外泌體內(nèi)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生一定的影響。令人可惜的是，MSC 釋放的細(xì)胞外囊泡數(shù)量有限，100 萬(wàn)的間充質(zhì)干細(xì)胞每日產(chǎn)出少于4 μg 的外泌體，這可能會(huì)限制它在臨床應(yīng)用方面的使用。既往研究由于劑量和對(duì)不同疾病終點(diǎn)的評(píng)估不一致，因此較難得出比較可靠的療效結(jié)論。改進(jìn)分離和產(chǎn)量?jī)?yōu)化、療效測(cè)定、重復(fù)性儲(chǔ)存和回收、特定臨床適應(yīng)癥的劑量確定等問(wèn)題也困擾相關(guān)科研人員。綜上所述，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體治療卒中的作用機(jī)制還需要更加深入的探討，以期更好地應(yīng)用臨床。