類胡蘿卜素降解菌株的原位篩選及其在雪茄提質(zhì)增香中的應(yīng)用

吳巧茵 施友志 李林林 彭政 譚再鈺 劉利平 張娟 潘勇

（1.江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，無錫 214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無錫 214122；3.江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心，無錫 214122；4.湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，武漢 430040）

類胡蘿卜素是雪茄煙葉（Nicotiana tabacum）質(zhì)體色素的重要組成部分，包括葉黃素、β-胡蘿卜素、番茄紅素和新葉黃素等，常見的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物包括β-紫羅蘭酮、檸檬醛、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-大馬酮等［1］，不僅香氣閾值低、香氣芬芳，是常用的煙用香精成分，還具有抗炎癥、抗氧化、清除強(qiáng)自由基活性等藥理潛能，在食品、化妝品和香水中的應(yīng)用也十分廣泛［2-4］。類胡蘿卜素的降解方式主要為物理降解、化學(xué)降解和生物降解，物理降解以光降解和熱降解為主，降解較為緩慢、難以控制。目前工業(yè)生產(chǎn)類胡蘿卜素降解產(chǎn)物通常采用化學(xué)降解法，但化學(xué)試劑的大量使用對(duì)于環(huán)境的污染較大，且廢水處理成本較高。生物降解法較為安全，從煙葉中獲得的微生物來源較為可靠，在工業(yè)生產(chǎn)中使用較為便利［5］。

近年來有關(guān)煙葉來源的類胡蘿卜素降解菌株的研究較少，主要以分離篩選煙葉表面微生物為主，其中楊雪鵬等［6］獲得了一株美洲愛文氏菌（Ewingella americana），對(duì)葉黃素降解率最高可達(dá)90.02%；龍章德等［7］發(fā)現(xiàn)一株西方許旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）可降解β-胡蘿卜素，增加煙葉二氫獼猴桃內(nèi)酯、橙花基丙酮等物質(zhì)含量。煙葉內(nèi)生菌不僅種類多且具有與菌群和宿主互作、降堿增香等功能，還有食品安全性的優(yōu)勢，具有巨大的經(jīng)濟(jì)前景和科學(xué)研究價(jià)值［8］。例如，陳頤等［9］發(fā)現(xiàn)2株內(nèi)生細(xì)菌黃色氣微菌（Aeromicrobium flavum）和嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）分泌氧化酶活性較高并能使煙葉類胡蘿卜素降解速度加快；袁濤［10］通過分析一株根瘤菌屬（Rhizobium）W44T的代謝通路，發(fā)現(xiàn)其具有合成類胡蘿卜素的潛能。但由于內(nèi)生菌具有難以培養(yǎng)、豐度低且生長十分緩慢等特質(zhì)，目前仍有大量內(nèi)生菌資源未被發(fā)現(xiàn)［8,11］。近年來高通量篩選和原位培養(yǎng)技術(shù)的迅速發(fā)展，通過模擬煙葉微生物生長環(huán)境可獲得少量難以培養(yǎng)的微生物，利用類胡蘿卜素在400-500 nm具有最大吸收的特性，從優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉中原位培養(yǎng)并大量篩選可降解類胡蘿卜素內(nèi)生菌的可行性增加［12-14］。

本研究結(jié)合原位培養(yǎng)和流式細(xì)胞分選技術(shù)，從雪茄煙葉中原位篩選可降解類胡蘿卜素的內(nèi)生菌，將其應(yīng)用于來鳳CX81中部二級(jí)煙葉中發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵煙葉的類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量和感官質(zhì)量進(jìn)行分析，旨在為雪茄工業(yè)微生物菌劑的制備和煙葉內(nèi)生菌資源的挖掘提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 湖北來鳳CX81中部二級(jí)煙葉原料用于原位培養(yǎng)煙葉內(nèi)生菌和煙葉發(fā)酵，由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供，煙葉香氣質(zhì)中等、香氣量一般、刺激性較大；湖北十堰CX14中部一級(jí)煙葉、厄瓜多爾E-HABANA 2 000上部煙葉和多米尼加CRIOLLO 98上部煙葉用于篩選可降解β-胡蘿卜素的微生物，香氣質(zhì)較好、香氣量較足、煙香較豐富，由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1.1.2 試劑 β-胡蘿卜素97%，購自上海源葉生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、氯化鈉等試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 微量元素培養(yǎng)基 含Na2HPO4·12H2O 6.15 g/L、KH2PO41.52 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、Mg-SO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液I 10 mL/L。其中，微量元素溶液I：EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素溶液II 100 mL/L；微量元素溶液II：ZeSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、 H3BO30.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl2·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。培養(yǎng)基成分配制參考文獻(xiàn)［15］。

1.1.4 富集培養(yǎng)基 β-胡蘿卜素作為唯一碳源，按照5 g/L的含量加入微量元素培養(yǎng)基，可富集原位培養(yǎng)微生物中可降解β-胡蘿卜素的菌株。

1.1.5 LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉 10 g/L，LB固體培養(yǎng)基中瓊脂按照15 g/L含量添加。

1.1.6 復(fù)篩培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、β-胡蘿卜素5 g/L。

1.1.7 主要儀器 電子天平EX124ZH（奧豪斯儀器（常州）有限公司），恒溫培養(yǎng)箱BXP-450（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），恒溫恒濕培養(yǎng)箱BXS-400S（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），恒溫振蕩搖床ZQZY-CF（上海知楚有限公司），孔板離心機(jī)CR21N（天美創(chuàng)科儀器有限公司），孔板搖床ZQZY-3cs8H（上海知楚有限公司），酶標(biāo)儀Cytation 3（美國Biotek公司），三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀TSQ8000（賽默飛世爾科技有限公司），流式細(xì)胞分選儀BD FACSArica III（美國BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 煙葉微生物原位培養(yǎng) 取優(yōu)質(zhì)煙葉樣品10 g于500 mL帶擋板三角瓶，加入75%乙醇至浸沒煙葉，于10℃、220 r/min振蕩10 min。表面消毒后的煙葉使用無菌水沖洗3次，煙葉樣品使用液氮充分研磨促進(jìn)內(nèi)生菌的釋放，將研磨的粉末添加入20 g/L CX81煙葉的90 mL LB培養(yǎng)基中，于37℃或30℃、220 r/min條件下振蕩培養(yǎng)48 h，厭氧微生物的原位培養(yǎng)需置于二氧化碳培養(yǎng)箱，培養(yǎng)48 h即可獲得煙葉原位培養(yǎng)微生物。

1.2.2 富集培養(yǎng) 將原位培養(yǎng)液按照1%、2%、5%（體積分?jǐn)?shù)）接種量分別加入添加20 g/L煙葉的富集培養(yǎng)基中，富集具有降解類胡蘿卜素功能的內(nèi)生菌，富集培養(yǎng)條件設(shè)置為30℃、37℃，轉(zhuǎn)速為220 r/min，培養(yǎng)24 h。富集培養(yǎng)后于4 000 ×g離心10 min收集菌體沉淀。

1.2.3 流式細(xì)胞分選 采用PI染液分選富集培養(yǎng)物中的活細(xì)胞，PI染色濃度和染色時(shí)間參考［16］，使用PBS重懸菌體沉淀并多次清洗菌體，最終調(diào)節(jié)菌體濃度為OD600=0.1-0.2。用1 mL PI染液于4℃避光孵育15 min，富集培養(yǎng)物中的活細(xì)胞將被分選到裝有200 μL富集培養(yǎng)基的96淺孔板中，30℃或37℃、170 r/min培養(yǎng)72 h。將初步分選具有類胡蘿卜素降解能力（發(fā)酵液顏色變淺或發(fā)酵液OD495較空白對(duì)照小）的菌株接種到裝有800 μL復(fù)篩培養(yǎng)基的96深孔板中，30℃或37℃、170 r/min培養(yǎng)72 h，12 000×g離心2 min取發(fā)酵上清液檢測發(fā)酵液OD495和觀察發(fā)酵液顏色，可篩選獲得高效降解類胡蘿卜素的菌株，將獲得的菌株進(jìn)行劃線純化。β-胡蘿卜素降解率的計(jì)算以未接種活細(xì)胞的孔板為空白對(duì)照，β-胡蘿卜素降解率（%）=（空白對(duì)照-菌株發(fā)酵上清液）/空白對(duì)照×100%。

1.2.4 菌種鑒定 菌株采用16S rDNA測序進(jìn)行分子鑒定，引物為通用引物27F和1492R，PCR反應(yīng)程序和反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)［17］。

1.2.5 煙葉發(fā)酵 以湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供的湖北來鳳CX81中部二級(jí)煙葉為樣品，取200 g煙葉于自封袋中，菌株接種至LB培養(yǎng)基中37℃、220 r/min培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)至菌液OD600為1，按照2%接種量均勻噴灑到煙葉表面并使得煙葉最終含水量為28%，室溫回潮一夜后于37℃、濕度為70%恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵20 d。以添加相同體積無菌水的煙葉作為對(duì)照，標(biāo)記為CK。

1.2.6 發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量分析 煙葉樣品的感官評(píng)價(jià)由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司進(jìn)行，按照1-5分對(duì)樣品的香韻、定性指標(biāo)和定量指標(biāo)進(jìn)行打分，不存在記0分。香韻類型包括：木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、焦甜香、清甜香、花粉香、奶香、干草香、烘焙香、樹脂香、果香、藥草香、堅(jiān)果味、皮革味、咖啡味、胡椒味。定性指標(biāo)分為：苦、甜、咸、辣、澀。定量指標(biāo)分為：煙氣濃度、煙氣強(qiáng)度、透發(fā)性、醇和度、雪茄風(fēng)格彰顯度、香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、刺激性、余味、甜潤感、燃燒性、灰色。質(zhì)量得分按照公式進(jìn)行計(jì)算：質(zhì)量得分=（香氣質(zhì)×0.18+香氣量×0.16+雜氣×0.10+刺激性×0.12+余味×0.16+甜潤感×0.10+燃燒性×0.10+灰色×0.08）/5×100。

1.2.7 發(fā)酵煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物測定 采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HSSPME/GC-MS），對(duì)發(fā)酵質(zhì)量得分較高的煙葉進(jìn)行煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物測定，SPME纖維組件二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷作為萃取頭，發(fā)酵結(jié)束的煙葉在40℃低溫烘干并研磨成粉末，取1.5 g煙葉粉末于頂空瓶中，添加2-辛醇作為內(nèi)標(biāo)，濃度為100 μg/μL。氦氣流速為1 mL/min，烘箱溫度固定為40℃保持2 min，在15℃/min下升溫至250℃并保持5 min，離子源溫度為210℃，傳輸線溫度為280℃。HS-SPME/GC-MS程序和類胡蘿卜素降解產(chǎn)物分析方法參考文獻(xiàn)［18-19］。

2 結(jié)果

2.1 β-胡蘿卜素降解菌株的原位篩選

優(yōu)質(zhì)雪茄煙葉內(nèi)生菌經(jīng)原位培養(yǎng)、富集培養(yǎng)后，使用流式細(xì)胞分選技術(shù)分離煙葉內(nèi)生菌，具體流程如圖1所示，從富集培養(yǎng)物中共分選480個(gè)菌株，如圖2所示，初篩得到42株具有β-胡蘿卜素降解能力的菌株，其中復(fù)篩后有21株菌株β-胡蘿卜素降解率在50%以上，降解率在80%以上的菌株按照由高到低的排序?yàn)?B1＞2B2＞1D3＞C31＞C7＞1F9＞2E5＞C42＞A71。

圖1 β-胡蘿卜素降解菌株的原位篩選Fig.1 In situ screening of β-carotene-degrading strains

圖2 菌株β-胡蘿卜素降解率Fig.2 β-carotene degrading rates of strains

對(duì)具有較好β-胡蘿卜素降解能力的21株菌株進(jìn)行菌種鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)篩選得到的菌屬包括農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、布氏桿菌屬（Brucella）和腸球菌屬（Enterococcus），共10個(gè)屬（圖3）。

圖3 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.2 發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量分析

將21株具有較好β-胡蘿卜素降解能力的菌株進(jìn)行雪茄煙葉發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，并對(duì)發(fā)酵結(jié)束的煙葉進(jìn)行感官質(zhì)量分析，共有8株β-胡蘿卜素降解菌株發(fā)酵煙葉質(zhì)量得分高于CK（表1）。結(jié)果表明，菌株C31、C11、H4發(fā)酵煙葉質(zhì)量得分明顯高于CK，香氣質(zhì)、香氣量、刺激性等各項(xiàng)指標(biāo)有較好的提升。其中C31香氣豐富度較好，香氣質(zhì)、香氣量明顯優(yōu)于CK，煙氣刺激性明顯下降；C11較CK香氣豐富度提升，香氣量充足，煙氣刺激性、雜氣較輕；H4煙葉刺激性和余味指標(biāo)提高，雜氣略有減輕；A5、F5、A72等菌株減輕了煙葉雜氣、刺激性，改善了余味、燃燒性等指標(biāo)。

表1 發(fā)酵煙葉質(zhì)量得分Table 1 Quality score of fermented tobacco leaves

以雷達(dá)圖表征質(zhì)量得分較高的C31、C11和H4發(fā)酵煙葉定性指標(biāo)、定量指標(biāo)和香韻類型（圖4）。發(fā)酵煙葉C31、C11和H4香韻類型多于CK，主要表現(xiàn)為C31煙葉共有9種香韻類型，木香、堅(jiān)果味較為突出，還輔以豆香、烘焙香、蜜甜香等香韻；C11木香最為突出，花香較為明顯，并輔以樹脂香、干草香、焦甜香等香韻，共有8種香韻類型；H4木香、豆香和焦甜香較為突出，輔以堅(jiān)果味、藥草香等香韻，共有9種香韻類型。從煙葉定性指標(biāo)和定量指標(biāo)可以看出，菌株C31、C11、H4發(fā)酵煙葉辣味、澀味減輕，甜味增加，煙氣醇和度、透發(fā)性提升，煙葉感官質(zhì)量得到明顯的改善。以上結(jié)果說明類胡蘿卜素降解菌株C31、C11、H4能夠增加國產(chǎn)煙葉香韻類型，提升醇和度和透發(fā)性，實(shí)現(xiàn)了雪茄煙葉的提質(zhì)增香。

圖4 發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量雷達(dá)圖Fig.4 Radar chart of sensory quality of fermented tobacco leaves

2.3 發(fā)酵煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物變化

對(duì)感官質(zhì)量較好的C31、C11、H4發(fā)酵煙葉進(jìn)行類胡蘿卜素降解產(chǎn)物測定，結(jié)果如圖5和表2所示，C31、C11、H4發(fā)酵煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量顯著增加，分別是CK的1.38、1.28、1.43倍，表明菌株接種煙葉發(fā)酵能夠促進(jìn)煙葉類胡蘿卜素降解。其中，菌株強(qiáng)化發(fā)酵煙葉中法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香葉基丙酮、六氫假紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等物質(zhì)含量增加。不同菌株發(fā)酵煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物差異較大，C31煙葉法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香葉基丙酮、甲基庚烯酮含量較高；C11香葉基丙酮含量最高，巨豆三烯酮含量也明顯高于C31和H4；H4煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物種類最多，橙化基丙酮和甲基庚烯酮含量最高，二氫獼猴桃內(nèi)酯含量略低于C31和C11。

表2 發(fā)酵煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物Table 2 Carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

圖5 發(fā)酵煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量Fig.5 Content of carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

3 討論

3.1 煙葉內(nèi)生菌的原位篩選

煙葉內(nèi)生菌廣泛存在于煙葉根際、莖、葉，因其豐富的多樣性及抗病蟲害、促進(jìn)煙草生長、降低有害物質(zhì)等特點(diǎn)成為行業(yè)研究的重要方向，但目前仍主要采用傳統(tǒng)平板分離技術(shù)進(jìn)行內(nèi)生菌篩選［8,20-21］。煙葉中包含的信號(hào)分子、關(guān)鍵酶、蛋白及電子供體或受體等某些關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)可促進(jìn)煙葉內(nèi)生菌的生長，但由于煙葉化學(xué)成分復(fù)雜，難以對(duì)煙葉內(nèi)生菌生長繁殖的自然條件進(jìn)行模擬［11,22］。本研究將20 g/L的煙葉加入原位培養(yǎng)基，同時(shí)β-胡蘿卜素作為富集培養(yǎng)基的唯一碳源，提供較匱乏的營養(yǎng)物質(zhì)，適合培養(yǎng)具有降解β-胡蘿卜素能力且生長緩慢的內(nèi)生菌。

流式細(xì)胞術(shù)在煙草中的研究相對(duì)于其他植物較少，主要應(yīng)用于煙氣細(xì)胞毒理學(xué)分析、煙草原生質(zhì)體分析、檢測煙草青枯菌密度等［23］；流式細(xì)胞分選技術(shù)作為目前較為廣泛使用的一種高通量篩選技術(shù)，Zheng等［24］基于一種羰基的特異性熒光探針建立了一套細(xì)胞分選方法，標(biāo)記并分選出產(chǎn)羰基化合物的菌株，說明流式分選技術(shù)可應(yīng)用于煙葉微生物的篩選。本研究通過原位篩選得到21株具有較好β-胡蘿卜素降解能力的菌株，包括農(nóng)桿菌屬、根瘤菌屬、鞘氨醇桿菌屬、腸桿菌屬、芽孢桿菌屬等，這些菌屬在已有研究中報(bào)道為煙葉內(nèi)生菌或根際微生物中常見的菌屬，通常具有促進(jìn)煙草生長、增加煙葉香氣、可降解煙堿等有害物質(zhì)等作用［8,20,25-26］。以上結(jié)果表明，本研究中原位培養(yǎng)和富集培養(yǎng)的培養(yǎng)基和條件適合生長緩慢的微生物和內(nèi)生菌的培養(yǎng)，與現(xiàn)代篩選技術(shù)相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)煙葉特定功能內(nèi)生菌的高通量、高效、靶向篩選。

3.2 類胡蘿卜素降解菌株及降解產(chǎn)物對(duì)煙葉品質(zhì)的影響

類胡蘿卜素降解產(chǎn)物是煙葉香氣組成和影響煙葉品質(zhì)的重要物質(zhì)，劉晶等［27］研究表明國外產(chǎn)地雪茄煙中甲基庚烯酮、巨豆三烯酮、法尼基丙酮等類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量較高，這使得國外雪茄煙葉在煙氣濃度、豐滿度和醇和度等方面優(yōu)于國產(chǎn)雪茄煙葉，與本研究中煙葉醇和度提升的結(jié)果相似［1,27-28］。因此通過接種類胡蘿卜素降解菌株促進(jìn)煙葉類胡蘿卜素的降解，可作為提升國產(chǎn)雪茄煙葉香氣和品質(zhì)的技術(shù)手段。但目前雪茄煙葉中類胡蘿卜素降解菌株的篩選和應(yīng)用鮮有報(bào)道，龍章德等［7］從烤煙鮮葉中分離到一株腸桿菌屬可高效降解β-胡蘿卜素，產(chǎn)物為β-紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯、β-環(huán)檸檬醛等物質(zhì)；蔡文等［17］篩選到一株高斯芽孢桿菌高產(chǎn)蛋白酶，加入烤煙發(fā)酵煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量明顯提高。本研究篩選的菌株C31、C11和H4應(yīng)用于國產(chǎn)雪茄發(fā)酵，煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量分別為CK的1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香葉基丙酮、六氫假紫羅蘭酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯等物質(zhì)增加，增強(qiáng)了煙葉烘焙香、清甜香、花香和木香等香韻，表明類胡蘿卜素降解菌株應(yīng)用于國產(chǎn)雪茄能改善煙葉質(zhì)量、提升煙葉香氣。

王玉華等［26］研究發(fā)現(xiàn)香葉基丙酮、法尼基丙酮、二氫獼猴桃內(nèi)酯與焦甜香顯著正相關(guān)，其中法尼基丙酮與香氣質(zhì)正相關(guān)；巨豆三烯酮與干草香、正甜香顯著正相關(guān)，具有溫和甜潤的木香、玫瑰花香味；甲基庚烯酮與清甜香顯著正相關(guān)，能夠較好地提升香氣質(zhì)。本研究中C31煙葉法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香葉基丙酮、甲基庚烯酮含量較高，與煙葉木香、烘焙香、甜味的增強(qiáng)和香氣質(zhì)的增加相符；C11香葉基丙酮含量高于C31和H4，使發(fā)酵煙葉花香明顯增強(qiáng)，巨豆三烯酮增強(qiáng)了煙葉干草香、木香香韻，以上結(jié)果與王鵬澤等［28］的研究結(jié)果相似。二氫獼猴桃內(nèi)酯含量與煙葉香氣量正相關(guān)，這可能是C31、C11香氣量較H4改善較為明顯的原因，與姜慧娟等［29］的研究相似。茅中一等［30］研究發(fā)現(xiàn)，香葉基丙酮具有清甜香和花香、二氫獼猴桃內(nèi)酯具有清香、甲基庚烯酮具有清香和果香，與本研究結(jié)果相似；且甲基庚烯酮、香葉基丙酮閾值較低，這表明通過增加香葉基丙酮、甲基庚烯酮等物質(zhì)含量能夠強(qiáng)化煙葉花香和清甜香，這有助于特征香韻雪茄的定制。本研究對(duì)功能菌株強(qiáng)化發(fā)酵提升雪茄及其他發(fā)酵產(chǎn)品特征香韻提供了技術(shù)基礎(chǔ)和可借鑒的研究思路。

從發(fā)酵煙葉感官質(zhì)量看，并非類胡蘿卜素降解能力越好、類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量越高則煙葉香韻和感官質(zhì)量得分越高，可能是因?yàn)閮?nèi)生菌難以在接種煙葉表面存活或受菌群間相互作用的影響使得煙葉感官質(zhì)量一般，且煙葉致香物質(zhì)含量、比例和香韻組成的復(fù)雜性導(dǎo)致不同煙葉感官質(zhì)量存在一定的差異［13,31］。除類胡蘿卜素降解產(chǎn)物增加外，煙葉感官質(zhì)量改善可能與煙葉其余化學(xué)成分相關(guān)，如陳倫旺［32］從煙葉表面微生物中分離出一株假單胞菌屬（Pseudomonas）不具備類胡蘿卜素降解能力，但發(fā)酵煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加。此外，枯草芽孢桿菌311（Bacillus subtilis）和彎曲芽孢桿菌117（Bacillus flexus）除類胡蘿卜素降解能力外，還分別能夠產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶，使發(fā)酵煙葉總氮和煙堿含量變化。因此，類胡蘿卜素降解內(nèi)生菌C31、C11和H4對(duì)于煙葉原生菌群和化學(xué)成分的影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從優(yōu)質(zhì)煙葉中共獲得了21株具有較好的類胡蘿卜素降解能力的內(nèi)生菌，其中C31、C11、H4煙葉類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量顯著提升，分別提高了1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、巨豆三烯酮、香葉基丙酮等類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量增加。煙葉焦甜香、木香、花香等香韻增強(qiáng)，香氣質(zhì)提升、香氣量足、刺激性降低、雜氣減輕，煙葉感官質(zhì)量得到明顯改善。