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    核桃JrSnRK1α1.1調(diào)控種子油脂合成與積累

    2023-10-25 05:05:36王貴芳姚元濤許海峰相昆梁家慧張淑輝王文茹張明娟張美勇陳新
    生物技術(shù)通報 2023年9期
    關(guān)鍵詞:種仁蛋白激酶株系

    王貴芳 姚元濤 許海峰 相昆 梁家慧 張淑輝 王文茹張明娟,4 張美勇 陳新

    (1.山東省果樹研究所 國家核桃板栗種質(zhì)資源圃 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃淮設(shè)施園藝工程重點實驗室,泰安 271000;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所,濟南 250100;3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院,泰安 271018;4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,泰安 271018)

    核桃(Juglans regia L.)是世界四大干果之一[1],具有很高的營養(yǎng)和保健價值。核桃種仁含油量高達(dá)63%以上,其中不飽和脂肪酸含量可達(dá)到90%,同時含有較多的生物活性成分,國內(nèi)外研究表明核桃油在預(yù)防糖尿?。?]、防治動脈粥樣硬化[3]和提高記憶力[4]等方面具有重要作用。另有研究表明,脂肪酸組成中的ω-3和ω-6不飽和脂肪酸比例約為1∶4-1∶6時對健康最有益,對預(yù)防心腦血管疾病有較好的作用[5]。與其他植物油相比,核桃種仁中ω-3和ω-6不飽和脂肪酸的組成較為理想,因此,核桃油脂是優(yōu)質(zhì)和健康的植物油脂[6]。

    種子是植物的“庫”端,由葉片(“源”端)合成的蔗糖通過韌皮部運輸?shù)椒N子中,油料種子首先積累淀粉,在種子發(fā)育后期全部或部分分解,用于合成油脂和蛋白質(zhì)[7]。種子油脂是由脂肪酸和甘油合成的高級脂肪酸甘油酯, 以三酰甘油的形式儲存于種子中。核桃種仁油脂合成與積累是堅果品質(zhì)和產(chǎn)量形成的關(guān)鍵,種仁油脂合成的原料物質(zhì)主要來源于光合作用產(chǎn)生的可溶性糖[8],蔗糖非發(fā)酵-1-蛋白激酶(sucrose non-fermentation1-related kinase1,SnRK1)是調(diào)節(jié)植物體內(nèi)碳氮代謝和能量平衡的重要樞紐[9-13],在碳代謝分配中起著關(guān)鍵的作用[14]。目前,有關(guān)植物SnRK1蛋白激酶研究主要集中于碳氮代謝[15-18]、生長發(fā)育[19-22]及脅迫響應(yīng)[12,23-25]方面。對SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累之間的關(guān)系和調(diào)節(jié)機制探討較少,主要以酵母(Saccharomyces cerevisiae)[26-27]及模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)[28]為主,在油料作物及木本油料樹種中的相關(guān)研究鮮見報道。作者前期對桃(Prunus persica)SnRK1蛋白激酶進行功能研究發(fā)現(xiàn),SnRK1能夠顯著提高植株的光合速率、可溶性糖含量、淀粉含量及其利用率,通過調(diào)節(jié)碳代謝進而調(diào)控植株的生長發(fā)育進程[29-30]。隨著人們對SnRK1蛋白激酶功能研究的逐漸深入,發(fā)現(xiàn)擬南芥中SnRK1同源基因KIN10與油脂合成轉(zhuǎn)錄因子WRI1相互作用調(diào)控油脂的合成與積累[28]。由于SnRK1蛋白激酶的結(jié)構(gòu)和功能屬于非常保守的基因家族[31],因此推測果樹SnRK1蛋白激酶可能參與油脂的合成與積累過程。而重要的木本油料樹種核桃SnRK1蛋白激酶在種子油脂合成與積累方面的研究至今未見報道。

    作者在前期研究的基礎(chǔ)上,為進一步探討果樹SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累中的作用,在本研究中以核桃種仁為試材,分離獲得核桃SnRK1蛋白激酶α催化亞基的一個編碼基因JrSnRK1α1.1(全長1 539 bp)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染花序?qū)⑵滢D(zhuǎn)化擬南芥,獲得超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥,探討核桃JrSnRK1α1.1對種子油脂合成和積累的影響,以期為調(diào)控核桃種仁油脂含量及改善核桃品質(zhì)提供理論依據(jù),同時為采用分子手段選育不同類型的核桃新品種提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    試驗于2017年4月-2020年10月在山東省干果育種工程技術(shù)研究中心和國家蘋果工程技術(shù)研究中心進行。

    所用的植物材料為‘香玲’核桃果實種仁,采自山東省泰安市岱岳區(qū)國家核桃種質(zhì)資源圃,采樣時間為2017年4月-2018年8月,核桃種仁總RNA提取樣品于液氮中迅速冷凍,保存于-80℃冰箱;擬南芥(Arabidopsis thaliana)為‘哥倫比亞’(Columbia)野生型,為實驗室保存。所用植物表達(dá)載體為pBI121,購自TaKaRa公司;所用大腸桿菌菌株為Trans5α,農(nóng)桿菌菌株為LBA4404,購自TIANGEN公司,用于轉(zhuǎn)化擬南芥。

    所用的主要試驗試劑及儀器為瓊脂糖、石油醚、體式顯微鏡、索氏抽提器、干燥鍋、分析天平、恒溫水浴鍋、烘箱和粉碎機。

    1.2 方法

    1.2.1 核桃種仁JrSnRK1α1.1基因的克隆與載體構(gòu)建 以‘香玲’核桃種仁為試材提取總RNA,采用OMEGA植物組織總RNA提取試劑盒,反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈采用寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time),參照說明書進行操作?;騄rSnRK1α1.1克隆依據(jù)GenBank登錄的核桃SnRK1蛋白激酶α亞基編碼基因(基因登錄號:LOC108985954)的CDS序列進行,采用Primer Premier 5設(shè)計引物,引物序列見表1。以上述cDNA為模板進行基因JrSnRK1α1.1全長PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,54℃退火70 s,72℃延伸30 s,36個循環(huán);最后72℃延伸10 min,4℃保存。PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳,回收,將其與克隆表達(dá)載體pMD-19T連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,挑取3個對陽性菌落進行測序,與參考基因序列進行比對,序列正確者連接植物表達(dá)載體為pBI121,獲得重組質(zhì)粒pBI121- JrSnRK1α1.1,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5α,再次進行測序、比對,測序正確的菌落提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404,以備轉(zhuǎn)化擬南芥。

    表1 目的基因JrSnRK1α1.1的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene JrSnRK1α1.1

    1.2.2 不同發(fā)育時期核桃種仁JrSnRK1α1.1基因表達(dá)定量分析 依據(jù)核桃JrSnRK1α1.1測序結(jié)果,運用NCBI中Primer-BLAST設(shè)計核桃JrSnRK1α1.1熒光定量引物(表1),以18S作為內(nèi)參基因。熒光定量采用ChamQTMUniversal SYBR Qpcr Master Mix試劑盒(Vazyme公司),實驗參照說明書進行。待反應(yīng)結(jié)束,獲得擴增曲線,通過StepOne Software v2.3導(dǎo)出數(shù)據(jù),利用Excel進行數(shù)據(jù)分析,根據(jù)CT值用2-ΔΔCT相對定量法計算目的基因的相對表達(dá)量。

    1.2.3 核桃JrSnRK1α1.1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及超表達(dá)株系的篩選 在溫度22℃,16 h光照/8 h黑暗的植物智能光照培養(yǎng)箱中,播種野生型擬南芥種子,待野生型擬南芥開花時將擬南芥主花序的頂端剪掉,以誘導(dǎo)更多側(cè)花序的生成,且側(cè)花序同時開花,便于轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化前澆透營養(yǎng)液,轉(zhuǎn)化后控制澆水。

    在轉(zhuǎn)化前2 d,將含重組質(zhì)粒pBI121-JrSnRK1α1.1的農(nóng)桿菌加到10 mL的YEP培養(yǎng)基中(含有利福平和卡那霉素),28℃搖床振蕩培養(yǎng),過夜,活化農(nóng)桿菌。取1 mL的菌液加到20 mL的YEP培養(yǎng)基中再次過夜培養(yǎng),至菌液呈金黃色時收集菌體,5 000-6 000 r/min離心10 min,棄上清液。以含有3%蔗糖的侵染液懸浮菌體,懸浮菌液中加入0.05%的Silwet L-77表面活性劑,將擬南芥的花序浸到菌液中8-10 min,然后用濾紙吸干多余的菌液。侵染過的擬南芥黑暗培養(yǎng)1 d。第2天取出放到光下繼續(xù)生長。根據(jù)浸染過的植株的長勢,隔5-7 d再浸一次。浸染4-5次后的擬南芥植株正常生長,收種子。將收集到的T0代擬南芥種子進行陽性篩選獲得3個植株J-1、J-2和J-3。提取陽性植株和野生型擬南芥葉片總RNA,反轉(zhuǎn)錄作為模板,進行PCR擴增JrSnRK1α1.1,瓊脂糖凝膠電泳檢測;熒光定量檢測JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)水平。凝膠電泳檢測含目的基因條帶、并結(jié)合熒光定量檢測結(jié)果確定植株J-1、J-2和J-3為轉(zhuǎn)基因擬南芥。收集獲得T1代種子,對T1代種子進行陽性植株篩選獲得T2代植株,單株采收種子;繼續(xù)對單株采收的T2代種子進行陽性篩選,全部為陽性植株的種子即為純合型。采收種子,獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。

    1.2.4 超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子表型觀察及粗脂肪含量檢測

    1.2.4.1 種子表型觀察 以野生型擬南芥植株為對照,對超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1的T3代擬南芥株系進行生長表型觀察。收集擬南芥的種子,將轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥株系的種子在體式顯微鏡下進行觀察,對比兩者表型的差異。

    1.2.4.2 種子千粒重統(tǒng)計 取適量同批次種植、收獲的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子,利用METTLER TOLEDO AB204-N電子天平稱重,重復(fù)3次。

    1.2.4.3 種子尺寸測量 取適量同批次種植、收獲的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子,用體式顯微鏡觀察,利用Digimizer4.5.1軟件測量種子的長和寬,每個樣品測量約300粒種子,計算平均值,重復(fù)3次。

    1.2.4.4 種子粗脂肪含量測定 測定采用索氏抽提的方法,測定方法參照GB 5009.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品中脂肪的測定》,略有改動,取樣2.5 g,3個重復(fù)。

    1.2.5 核桃JrSnRK1α1.1與JrWRI1雙分子熒光互補試驗 作者前期以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板克隆獲得油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因全長[32]。為進一步探討核桃JrSnRK1α1.1是否與油脂合成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1相互作用,構(gòu)建熒光雙分子表達(dá)載體JrSnRK1α1.1-YFPC和JrWRI1-YFPN。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將JrSnRK1-YFPC和JrWRI1-YFPN共同轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞,以JrSnRK1-YFPC與YFPN共轉(zhuǎn)化作為對照,運用雙分子激光共聚焦電子顯微鏡觀察。

    2 結(jié)果

    2.1 核桃JrSnRK1α1.1基因的克隆

    依據(jù)GenBank登錄的核桃SnRK1蛋白激酶α亞基編碼基因(登錄號:LOC108985954)的CDS序列設(shè)計引物。以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板進行基因JrSnRK1α1.1 PCR擴增,獲得基因CDS全長為1 539 bp。將得到的基因進行測序、比對,其基因序列與參考基因(登錄號:LOC108985954)完全一致。可見核桃SnRK1蛋白激酶屬于非常保守的基因家族,擴增獲得的JrSnRK1α1.1即為目的基因。

    2.2 核桃JrSnRK1α1.1基因家族進化關(guān)系分析

    運用NCBI在線工具BLAST對核桃、桃、蘋果、草莓、番茄、煙草、大豆、芝麻、擬南芥等SnRK1蛋白激酶α亞基同源基因的蛋白質(zhì)序列進行搜索,構(gòu)建基因系統(tǒng)發(fā)育進化樹。結(jié)果(圖1)表明,核桃JrSnRK1α1.1與桃、蘋果、棗、草莓及中華薔薇的親緣關(guān)系較近,而與線蟲、酵母、水稻、黑麥的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    圖1 不同植物中SnRK1蛋白激酶α亞基蛋白進化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the proteins of α subunit in SnRK1 protein kinase from different plant species

    2.3 核桃種仁發(fā)育過程中JrSnRK1α1.1基因表達(dá)水平的變化

    本課題組前期研究表明,‘香玲’核桃自開花至60 d,果實快速膨大,種仁逐漸形成透明半流質(zhì)狀的內(nèi)含物;花后60 d至成熟期種仁內(nèi)含物逐漸增加,是油脂逐漸積累的階段。因此。自花后60 d進行核桃種仁取樣,每隔10 d取1次。測定核桃種仁JrSnRK1α1.1在花后60-130 d(成熟期)之間基因相對表達(dá)水平。結(jié)果(圖2)表明,核桃種仁中基因JrSnRK1α1.1自花后60-90 d相對表達(dá)量逐漸下降,這一時期果實大小基本定型,種仁逐漸呈白色、脆嫩,營養(yǎng)物質(zhì)迅速積累;JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)量在花后90-120 d逐漸上升,花后120-130 d又下降,這一階段核桃種仁不斷充實飽滿,種仁風(fēng)味由甜變香,核桃油脂含量快速增加。

    圖2 ‘香玲’核桃種仁不同生長階段JrSnRK1α1.1基因表達(dá)水平Fig.2 Expressions of the JrSnRK1α1.1 gene in different growth stages of ‘Xiangling’ walnut kernel

    2.4 核桃JrSnRK1α1.1基因轉(zhuǎn)化擬南芥及超表達(dá)植株的篩選

    將含有重組質(zhì)粒pBI121-JrSnRK1α1.1的農(nóng)桿菌侵染野生型擬南芥花序,獲得超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1的陽性植株J-1、J-2和J-3。轉(zhuǎn)基因植株J-1、J-2和J-3與野生型擬南芥WT植株生長差異不顯著(圖3)。以WT為對照,提取轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA,進行核桃JrSnRK1α1.1基因PCR擴增,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖4-A)顯示,3個植株均含有目的條帶。以18S作為內(nèi)參基因,對轉(zhuǎn)基因擬南芥JrSnRK1α1.1基因相對表達(dá)水平進行熒光定量分析,JrSnRK1α1.1在植株J-2中相對表達(dá)量較高,其次為J-3,在J-1中表達(dá)較弱(圖4-B)。

    圖3 野生型擬南芥(WT)和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(J-1、J-2和J-3)幼苗表型Fig.3 Seedling phenotype of wild-type(WT)and transgenic Arabidopsis thaliana lines(J-1, J-2 and J-3)

    2.5 超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子表型及粗脂肪含量

    將超表達(dá)JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因植株J-1、J-2和J-3進行純化,獲得T3代純合型株系,在數(shù)碼顯微鏡下觀察種子表型(圖5)。與野生型WT相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥株系J-1、J-2和J-3種子表現(xiàn)為癟小、表皮皺縮,其中株系J-1、J-2和J-3癟小種子占比分別為43.69%、60.80%和45.87%,高于野生型WT(8.43%),差異顯著(圖6-A);轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子千粒重比野生型降低27.95%-29.32%(圖6-B),種子平均粒長和粒寬均顯著變?。▓D6-C, D),種子的長寬比顯著增大(圖6-E)。可見核桃JrSnRK1α1.1影響了擬南芥種子的發(fā)育。進一步對種子粗脂肪含量進行測定,結(jié)果(圖6-F)表明,與野生型WT相比,轉(zhuǎn)基因擬南芥株系J-1、J-2、J-3粗脂肪含量分別下降了9.66%、23.86%和17.61%,差異顯著;可見核桃JrSnRK1α1.1負(fù)調(diào)控種子油脂的合成和積累。

    2.6 核桃JrSnRK1α1.1與核桃油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互作

    作者前期以‘香玲’核桃種仁cDNA為模板克隆獲得油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1基因全長,對其結(jié)構(gòu)特征、生物學(xué)特性進行了分析。為進一步探討核桃JrSnRK1α1.1是否與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1相互作用,構(gòu)建重組表達(dá)載體,共同轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞,進行雙分子熒光互補試驗(圖7)。在YFP光照下,對照J(rèn)rSnRK1α1.1-YFPC和YFPN共轉(zhuǎn)化的煙草表皮細(xì)胞沒有綠色熒光,而JrSnRK1α1.1-YFPC和JrWRI1-YFPN共轉(zhuǎn)化煙草表皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)有明亮的綠色熒光,表明核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1能夠相互作用。

    圖7 核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1雙分子熒光互補Fig.7 Bimolecular fluorescence complementation of walnut JrSnRK1α1.1 with JrWRI1, a key transcription factor for lipid synthesis(Scale bar=10 μm)

    3 討論

    SnRK1蛋白激酶是植物碳代謝和生長發(fā)育中的重要調(diào)控樞紐。SnRK1蛋白激酶廣泛存在于高等植物中,調(diào)節(jié)植物體內(nèi)光合碳代謝和能量平衡[12-13,18,33]。SnRK1蛋白激酶在轉(zhuǎn)錄水平上對蔗糖合酶和α-淀粉酶進行調(diào)節(jié),調(diào)控碳水化合物代謝[11,34]。SnRK1蛋白激酶影響豌豆種子的發(fā)育,反義表達(dá)SnRK1的豌豆種子出現(xiàn)許多成熟缺陷,表現(xiàn)為糖轉(zhuǎn)變成儲存物的數(shù)量減少、球蛋白含量較低、多數(shù)種子的子葉外觀、形狀、勻稱性改變及早熟現(xiàn)象[35]。本研究中,超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1轉(zhuǎn)基因擬南芥種子與野生型相比,種子出現(xiàn)癟小、表皮皺縮的現(xiàn)象,并且轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子千粒重明顯降低,種子的平均粒長和粒寬均顯著變小。因此,核桃JrSnRK1α1.1也影響了種子的發(fā)育進程。但JrSnRK1α1.1是否通過調(diào)節(jié)碳水化合物的代謝影響了種子的發(fā)育?以及對光合碳代謝的調(diào)控機制如何?這些問題亟需進一步探討。

    SnRK1蛋白激酶參與調(diào)控油脂的合成與積累。油料種子以貯存油脂為主,光合作用產(chǎn)生的可溶性糖是油脂合成的物質(zhì)基礎(chǔ)[8],隨著人們對SnRK1蛋白激酶研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)酵母Snf1不僅調(diào)節(jié)碳代謝,還調(diào)控油脂的合成與積累[26-27]。但目前對植物SnRK1蛋白激酶在油脂合成與積累方面的研究較少,僅在擬南芥中有所發(fā)現(xiàn),擬南芥KIN10通過磷酸化油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子WRI1使其降解,從而降低種子油脂含量[28];進一步研究表明具有活性的KIN10下調(diào)WRI1的表達(dá),并通過促進細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶8(CDK8)的降解來抑制油脂的合成[36]。本研究中,超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1擬南芥株系與野生型擬南芥WT相比,種子中油脂含量顯著下降,分別比WT下降9.66%、23.86%和17.61%,這與擬南芥中KIN10的功能相似[28]。

    核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互作調(diào)控油脂的合成與積累。油脂是核桃種仁的主要成分,也是核桃品質(zhì)形成的關(guān)鍵因子。近年來,核桃果實油脂合成相關(guān)研究取得一些進展,張通[37]對山核桃果實種仁油脂合成相關(guān)基因的表達(dá)分析中發(fā)現(xiàn)了油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子WRI1,張楠[38]利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了核桃胚脂肪積累期脂肪代謝通路中關(guān)鍵基因的表達(dá)模式,為進一步研究相關(guān)基因的功能及調(diào)控機制提供了基礎(chǔ)。本課題組前期從‘香玲’核桃種仁中分離得到核桃JrWRI1基因[32],為進一步研究核桃油脂的形成奠定了基礎(chǔ)。在本研究中,核桃JrSnRK1α1.1影響種子的發(fā)育,負(fù)調(diào)控種子油脂的合成與積累,且熒光雙分子試驗表明核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1能夠相互作用,這為改變核桃種仁油脂的含量提供了新的思路,也為利用分子手段加快核桃新品種的選育提供一定的參考,但其調(diào)控機制仍不清楚。木本油料樹種核桃JrSnRK1α1.1如何調(diào)控油脂的合成與積累過程,是否通過JrWRI1基因?qū)颂曳N仁油脂的合成及積累進行調(diào)控?以及是否存在其他調(diào)控途徑?其作用機制是否與擬南芥同源基因KIN10一致,還是其具有自己的特異性?目前仍不清楚,需進一步探討與研究。

    4 結(jié)論

    超表達(dá)核桃JrSnRK1α1.1對擬南芥植株生長發(fā)育影響不明顯,對種子的發(fā)育影響顯著,轉(zhuǎn)基因擬南芥株系種子表現(xiàn)為癟小、表皮皺縮,千粒重、種子粒長和粒寬均顯著變小。核桃JrSnRK1α1.1與油脂合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子JrWRI1互相作用,負(fù)調(diào)控種子油脂的合成與積累。

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