固定化脂肪酶的創(chuàng)制及其在乙酸肉桂酯無(wú)溶劑制備中的應(yīng)用

陳金行 張逸 張軍濤 未本美 王宏勛 鄭明明，，3

（1.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，武漢 430023；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所，武漢 430062；3.湖州市菱湖新望化學(xué)有限公司，湖州 313018）

乙酸肉桂酯是一種存在于肉桂、荔枝、甜瓜等植物中的天然風(fēng)味物質(zhì)，具有果香、花香和茉莉香，是我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)》允許使用的香精香料［1］，被廣泛應(yīng)用于食品和化妝品中。乙酸肉桂酯主要通過(guò)天然提?。?］、化學(xué)法合成［3］和酶法合成［4］等手段制備。然而，植物中天然存在的乙酸肉桂酯含量低，提取工藝復(fù)雜，生產(chǎn)成本高；化學(xué)法合成通常需要在高溫、高壓等條件下進(jìn)行，導(dǎo)致高能耗、高污染，副產(chǎn)物難分離等問(wèn)題。酶法合成具有反應(yīng)條件溫和、專(zhuān)一性強(qiáng)、反應(yīng)效率高、綠色無(wú)污染等優(yōu)勢(shì)［5-6］。另外，酶法合成的產(chǎn)物被認(rèn)為是天然的，價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯，市場(chǎng)前景廣闊［7-8］。因此，利用酶法合成以乙酸肉桂酯為代表的風(fēng)味酯比植物提取和化學(xué)合成更具有技術(shù)優(yōu)勢(shì)和產(chǎn)業(yè)化前景。

目前，酶法合成主要以游離酶為主，但游離酶在外界刺激下易失活，難回收和重復(fù)利用［9］。已報(bào)道的固定化手段包括物理吸附、包埋法、共價(jià)連接等方法，可以一定程度上提高游離酶的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性［10-12］。其中，物理吸附法因其操作步驟簡(jiǎn)單、對(duì)酶活性影響小、成本低等優(yōu)勢(shì)被廣泛使用。如劉昱杉等［13］通過(guò)物理吸附成功將熒光假單胞菌脂肪酶固定在玻璃上，有效提高了脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性，并可使乙酸肉桂酯的酶法產(chǎn)率在18 h內(nèi)達(dá)99%。周美娟等［14］通過(guò)物理吸附將脂肪酶固定在脫脂棉上用于合成乙酸肉桂酯，在最佳條件下，肉桂醇與乙酸乙烯酯摩爾比為1∶2.16，反應(yīng)溫度為37℃，固定化酶添加量為15 mg，反應(yīng)12 h肉桂醇的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到92.0%。然而，物理吸附仍存在固定化酶易脫落、酶活性不穩(wěn)定的缺點(diǎn)，是亟待解決的瓶頸難題［15］。選擇合適的載體是脂肪酶物理吸附效果和活性穩(wěn)定性的關(guān)鍵，其中，有序介孔材料OMS（ordered mesoporous silicon）具有適當(dāng)?shù)目讖胶蛢?yōu)異的比表面積，近年來(lái)受到廣泛報(bào)道和應(yīng)用［16］。

已經(jīng)報(bào)道的乙酸肉桂酯酶法制備相關(guān)文獻(xiàn)中存在使用有機(jī)溶劑、催化效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、酶重復(fù)使用效果差等問(wèn)題［13-14］。使用有機(jī)溶劑雖然可以保持脂肪酶的催化穩(wěn)定性，但是在實(shí)際生產(chǎn)中不利于產(chǎn)物分離，增加生產(chǎn)成本。催化效率和酶的重復(fù)使用性與生產(chǎn)效益直接相關(guān)，良好的催化效率和重復(fù)使用性不僅可以縮短反應(yīng)的時(shí)長(zhǎng)還可以有效節(jié)省生產(chǎn)投入。目前，關(guān)于OMS介孔材料用于乙酸肉桂酯的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)將假絲酵母脂肪酶（Candida sp.lipase, CSL）固定在經(jīng)過(guò)疏水改性的OMS上，成功制備固定化脂肪酶（CSL@OMS-C8），用于無(wú)溶劑體系中催化乙酸乙烯酯與肉桂醇酯交換制備乙酸肉桂酯。對(duì)反應(yīng)溫度、底物摩爾比、脂肪酶添加量等關(guān)鍵反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，為乙酸肉桂酯的綠色高效合成和工業(yè)化生產(chǎn)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

南極假絲酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CALB）購(gòu)自諾維信公司。皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase, AYS）、洋蔥假單胞菌脂肪酶（Pseudomomas cepacian lipase, PS）、皺褶假絲酵母脂肪酶（Candida rugosa lipase, CRL）和豬胰腺脂肪酶（Porcine pancreas lipase, PPL）購(gòu)自Amano Enzyme 公司。假絲酵母脂肪酶（Candida sp.lipase,CSL）購(gòu)自開(kāi)泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司（北京）。肉桂醇、乙酸乙烯酯、正己烷、硅酸四乙酯（TEOS，98%）、1,3,5-三甲苯（TMB）和三甲氧基（辛基）硅烷（C8，97%）購(gòu)自阿拉丁試劑有限公司（上海）。三嵌段共聚物（聚（環(huán)氧乙烷）106-聚（環(huán)氧丙烷）70-聚（氧化乙烯）106）（Pluronic F127）購(gòu)自于上海元葉生物技術(shù)有限公司（上海）。三乙胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑（上海）。

1.2 方法

1.2.1 載體OMS和OMS-C8的制備 參考Li等［17］方法制備載體OMS和OMS-C8。

有序介孔硅（OMS）的制備：在20℃條件下，將1.0 g三嵌段共聚物Pluronic F127和2.5 g KCl溶解于100 mL 1.0 mol/L HCl溶液。隨后，加入1.2 g 1,3,5-三甲基苯（TMB），并攪拌1 h，再加入4.0 g硅酸四乙酯（TEOS），劇烈攪拌15 min后，將溶液靜置陳化48 h，然后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)釜中，200℃保持24 h，用乙醇洗滌，60℃過(guò)夜烘干。將上述干燥物進(jìn)行煅燒，煅燒程序?yàn)椋阂?℃/min的速率從環(huán)境溫度升高至550℃，保持該溫度6 h，然后以10℃/min的速度降低至環(huán)境溫度。收集最終產(chǎn)物，即為有序介孔硅（OMS），儲(chǔ)存以備后續(xù)使用。

通過(guò)硅烷偶聯(lián)劑（C8）與OMS表面羥基接枝改性制備OMS-C8：首先，將1.0 g OMS樣品、50 mm C8和15 μL三乙胺置于10 mL甲苯中，進(jìn)行超聲均勻分散。隨后，將混合物置于130℃高壓釜中20 h。最后，用乙醇洗滌3次，過(guò)濾，60℃干燥12 h，即可獲得OMS-C8。

1.2.2 脂肪酶的固定化 4℃條件下，將脂肪酶CSL充分溶解在磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 9）中，離心除去雜質(zhì)獲得脂肪酶溶液上清液。隨后，取0.1 g OMS-C8和10 mL脂肪酶溶液上清液混合，220 r/min搖動(dòng)40 min，離心收集殘留物，并用磷酸鹽緩沖液洗滌3次。最后，-70℃冷凍干燥24 h，即可獲得固定化酶CSL@OMS-C8。

1.2.3 OMS、OMS-C8和CSL@OMS-C8的表征 通過(guò)掃描電子顯微鏡（SU8010）觀察樣品的表面形貌，使用透射電子顯微鏡（TG2 20S-TWIN）觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。通過(guò)氮?dú)馕椒治鰞x（ASAP 2010）分析樣品的比表面積和孔徑分布。利用傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜儀分析樣品所含基團(tuán)變化以及固定化結(jié)果。使用接觸角測(cè)試儀（SDC-200S）測(cè)量材料親疏水性。

1.2.4 乙酸肉桂酯的酶法制備 在10 mL反應(yīng)瓶中，固定反應(yīng)體積為5 mL，調(diào)節(jié)加入乙酸乙烯酯和肉桂醇的量改變底物的摩爾比，加入催化劑濃度為1-10 g/L，在不同溫度下研究肉桂醇的轉(zhuǎn)化率。反應(yīng)過(guò)程中，每隔一定時(shí)間取樣20 μL溶于正己烷，通過(guò)0.22 μm PDVF過(guò)濾器過(guò)濾后進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。

1.2.5 產(chǎn)物分析檢測(cè) 氣相色譜柱為DB-5 HT，氮?dú)鉃檩d氣（分流比為50∶1）。升溫程序：50℃保持2 min，以15℃/min升溫至150℃，再以10℃/min升溫至240℃并保持1 min。進(jìn)樣器溫度和檢測(cè)器溫度為270℃。通過(guò)比較肉桂醇和乙酸肉桂酯的峰面積得到肉桂醇的轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 使用Origin 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）形式表示。用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用單因素方差分析確定數(shù)據(jù)組之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同字母表示P＜0.05水平下差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 脂肪酶的篩選

脂肪酶作為酯交換反應(yīng)的催化劑，在反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用，同一反應(yīng)條件下，對(duì)不同種類(lèi)脂肪酶進(jìn)行篩選是酶促反應(yīng)的常用手段［18-19］。固定反應(yīng)體積為5 mL，加入肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比為1∶5，反應(yīng)溫度為50℃，脂肪酶添加量為2 g/L的反應(yīng)條件下反應(yīng)3 h，比較6種不同的脂肪酶（包括CSL、PS、PPL、AYS、CALB和CRL）在無(wú)溶劑體系中催化制備乙酸肉桂酯的效果（圖1）?？梢钥闯?，反應(yīng)3 h后，6種脂肪酶在乙酸肉桂酯的制備中催化效果存在顯著性差異。脂肪酶CSL催化肉桂醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)63.8%，遠(yuǎn)高于脂肪酶CALB（17%）和脂肪酶PS、PPL、AYS、CRL（不超過(guò)10%）。表明在此反應(yīng)中脂肪酶CSL具有更好的催化效果，這與脂肪酶的選擇性催化有關(guān)［20］。因此，選擇脂肪酶CSL作為乙酸肉桂酯酶法制備的催化劑進(jìn)行下一步研究。

2.2 載體表征

運(yùn)用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡對(duì)載體材料和固定化酶進(jìn)行表征。結(jié)果顯示，負(fù)載材料OMS呈六角形結(jié)構(gòu)，直徑約為6微米（圖2-a）?？梢郧宄赜^察到材料表面有序、密集的孔結(jié)構(gòu)（圖2-b）。OMS材料的吸附等溫線是典型的介孔材料特征［21-22］，介孔孔徑為15 nm（圖2-c），這保證了脂肪酶能夠順利進(jìn)入材料孔道內(nèi)。另外，與未修飾的材料OMS相比，經(jīng)過(guò)疏水修飾的材料OMS-C8在孔徑和孔容上稍有下降（圖2-d），說(shuō)明C8修飾成功，但并未改變載體材料的原有形貌結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)固定化以后，材料CSL@OMS-C8的孔容急劇下降，這是因?yàn)橹久赋晒M(jìn)入材料的孔道并占據(jù)孔道［23］。

利用傅里葉變換紅外（FT-IR）光譜儀分析樣品所含基團(tuán)變化以及固定化（圖3），與OMS相比，材料OMS-C8在2 923和2 852 cm-1處有明顯的特征峰，這是由于C-H的對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)拉伸振動(dòng)所導(dǎo)致，表明C8被成功接枝到OMS材料上。在1 653和1 539 cm-1處的特征峰與N-H彎曲振動(dòng)相關(guān)，在CSL和CSL@OMS-C8的光譜中能找到相對(duì)應(yīng)的特征峰，表明脂肪酶CSL成功固定在OMS-C8上。

圖3 游離脂肪酶CSL、OMS、OMS-C8、CSL@OMS-C8的傅里葉紅外結(jié)果Fig.3 FT-IR spectra of the free lipase CSL, OMS,OMS-C8 and CSL@ OMS-C8

通過(guò)使用接觸角測(cè)試儀（SDC-200S）測(cè)量材料親疏水性（圖4），發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)C8疏水修飾，OMS材料的接觸角從20°增加到120°，表明C8修飾可有效改善OMS的疏水性，這與紅外結(jié)果相吻合。經(jīng)過(guò)疏水改性的材料更有利于打開(kāi)脂肪酶的“蓋子”結(jié)構(gòu)，暴露出催化活性位點(diǎn)，提高脂肪酶催化活性［24-25］。

圖4 OMS（A）和OMS-C8（B）的疏水測(cè)定Fig.4 Hydrophobic measurement for OMS（A）and OMS-C8（B）

2.3 底物摩爾比對(duì)酯化反應(yīng)的影響

固定反應(yīng)體積為5 mL，CSL@OMS-C8的濃度為2 g/L，反應(yīng)溫度為50℃條件下，反應(yīng)3 h，考察不同肉桂醇和乙酸乙烯酯摩爾比對(duì)乙酸肉桂酯產(chǎn)率的影響（圖5-a）。結(jié)果表明，當(dāng)肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比由1∶1逐漸增大至1∶5時(shí)，肉桂醇的轉(zhuǎn)化率由23.5%上升至99.5%；繼續(xù)增大底物摩爾比至1∶10后，肉桂醇的轉(zhuǎn)化率沒(méi)有繼續(xù)增加，反應(yīng)平衡時(shí)間縮短。這可能是由于其他條件保持不變，增加反應(yīng)底物導(dǎo)致反應(yīng)平衡向正反應(yīng)方向移動(dòng)［26］。為了獲得較多的產(chǎn)物且同時(shí)保持高效性，選擇肉桂醇與乙酸乙烯酯的摩爾比為1∶5進(jìn)行后續(xù)的研究。

圖5 不同反應(yīng)條件對(duì)乙酸肉桂酯合成的影響以及最優(yōu)條件下固定化酶和游離酶對(duì)比Fig.5 Effects of different reaction conditions on the synthesis of cinnamyl acetate and comparison of immobilized and free enzymes under optimal conditions

2.4 溫度對(duì)酯化反應(yīng)的影響

反應(yīng)溫度不僅對(duì)反應(yīng)速率和反應(yīng)平衡時(shí)間有影響，還會(huì)對(duì)酶活性產(chǎn)生影響，因此，在30-70℃范圍內(nèi)研究溫度對(duì)反應(yīng)的影響。保持其他反應(yīng)條件不變，在不同溫度下（30-70℃）反應(yīng)3 h，考察溫度對(duì)肉桂醇轉(zhuǎn)化率的影響（圖5-b），結(jié)果表明，不斷升高溫度，反應(yīng)3 h，肉桂醇的最終轉(zhuǎn)化率呈先上升再下降的趨勢(shì)。當(dāng)溫度由30℃升高至50℃，乙酸肉桂酯的產(chǎn)率從91.9%升高至99.5%。繼續(xù)升高溫度至70℃，肉桂醇的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而降低至72.9%。說(shuō)明適當(dāng)提高溫度有助于提高脂肪酶活性，持續(xù)升高溫度，高溫下脂肪酶活性會(huì)部分喪失［27］。綜合考慮50℃為最佳反應(yīng)溫度。

2.5 脂肪酶添加量對(duì)酯化反應(yīng)的影響

保持其他條件不變，改變固定化脂肪酶添加量為1-10 g/L反應(yīng)3 h，研究固定化脂肪酶添加量對(duì)肉桂醇轉(zhuǎn)化率的影響（圖5-c），結(jié)果表明，當(dāng)催化劑添加量從1 g/L增加至2 g/L,反應(yīng)3 h肉桂醇的最終轉(zhuǎn)化率由原來(lái)的84.8%升高至99.5%。繼續(xù)增加催化劑添加量為3、5、7和10 g/L，反應(yīng)達(dá)到平衡的時(shí)間不斷提前，當(dāng)添加劑的量為10 g/L時(shí)，0.5 h反應(yīng)就能達(dá)到平衡。說(shuō)明增加催化劑的添加量，脂肪酶催化活性位點(diǎn)也隨之增加，活性位點(diǎn)與底物之間的接觸增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率上升和平衡時(shí)間縮短［28］。綜合考慮，以2 g/L作為固定化脂肪酶實(shí)際添加量，反應(yīng)時(shí)間為2 h。

在最優(yōu)條件下游離酶與固定化酶3 h內(nèi)催化效果如圖5-d所示?？梢院苊黠@看到，脂肪酶經(jīng)過(guò)固定化處理以后，催化效果得到很大程度提高。固定化脂肪酶在2 h反應(yīng)達(dá)到平衡，轉(zhuǎn)化率為96.6%，而游離酶3 h的轉(zhuǎn)化率僅為81.7%，并且固定化酶催化效率達(dá)到1 159.2 mmol/（g·h），是游離酶（653.6 mmol/（g·h））的1.7倍?？赡苁且?yàn)楣潭ɑ牧螼MS為脂肪酶提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定催化環(huán)境有關(guān)。并且，經(jīng)過(guò)C8疏水修飾可以促進(jìn)脂肪酶穩(wěn)定催化環(huán)境有關(guān)。并且，經(jīng)過(guò)化效果得到很大程度提高［29］。結(jié)果表明，固定化酶催化活性較游離酶大幅提升。

2.6 固定化酶重復(fù)使用性評(píng)價(jià)

重復(fù)使用性是評(píng)價(jià)固定化酶穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，也是判斷其產(chǎn)業(yè)應(yīng)用前景的依據(jù)。圖6為最優(yōu)條件下固定化脂肪酶循環(huán)使用結(jié)果，盡管CRL@OMS-C8在重復(fù)使用時(shí)催化活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)，但5次循環(huán)使用后CRL@OMS-C8仍能保持80%以上的催化活性，表明基于疏水改性修飾的OMS材料可以有效提高脂肪酶的活性穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，因此，大幅降低酶法制備乙酸肉桂酯的成本，表明CRL@OMS-C8在風(fēng)味酯酶法制備的產(chǎn)業(yè)化潛力。

圖6 固定化脂肪酶CSL@OMS-C8循環(huán)使用結(jié)果Fig.6 Reusability of CSL@OMS-C8

3 討論

本文提出一種基于有序介孔材料制備固定化酶用于綠色高效制備乙酸肉桂酯的新方法，肉桂醇轉(zhuǎn)化率在2 h達(dá)到96.6%，催化效率達(dá)到1 159.2 mmol/（g·h），是游離酶的1.7倍。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)固定化后脂肪酶催化活性有顯著提升，這歸因于疏水載體材料有利于打開(kāi)脂肪酶“蓋子”結(jié)構(gòu)，暴露出活性位點(diǎn)。

姚俠等［4］使用Novozym 435商品化脂肪酶作為催化劑合成乙酸肉桂酯，反應(yīng)3 h肉桂醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%；劉昱杉等［13］將脂肪酶PFL固定在玻璃上催化乙酸乙烯酯與肉桂醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，反應(yīng)18 h肉桂醇的轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到99%；周美娟等［14］使用脫脂棉成功固定脂肪酶PCL用于乙酸肉桂酯的合成，反應(yīng)12 h最高轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.0%。本研究使用自制CSL@OMS-C8在更短的時(shí)間達(dá)到同一水平轉(zhuǎn)化率（2 h，96.6%）。此外，OMS硅載體具有良好的重復(fù)使用性和更高的熱穩(wěn)定性，特別是在惡劣條件下（即高溫、強(qiáng)酸性/堿性反應(yīng)）。最后，硅是經(jīng)中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)允許用于食品加工的材料，這意味著疏水有序介孔SiO2載體固定化脂肪酶有望用于食品領(lǐng)域的工業(yè)加工。

為進(jìn)一步提高固定化酶的重復(fù)使用次數(shù)，擬采用“場(chǎng)酶結(jié)合”的方式進(jìn)行改進(jìn)，即將超聲、微波等技術(shù)與固定化脂肪酶相結(jié)合，旨在通過(guò)不同的處理方式降低反應(yīng)過(guò)程中對(duì)脂肪酶的傷害，提升固定化酶的可重復(fù)使用能力并獲得更高效的制備方法［30-31］。另外，也可將固定化酶與連續(xù)流反應(yīng)器相結(jié)合，構(gòu)建新型高效的連續(xù)流酶反應(yīng)體系［32］。固定化脂肪酶與連續(xù)流反應(yīng)器相結(jié)合可以有效解決脂肪酶回收困難的問(wèn)題，推動(dòng)固定化酶制備乙酸肉桂酯工業(yè)化制備的產(chǎn)業(yè)化。

4 結(jié)論

使用辛基（C8）疏水改性的有序介孔二氧化硅（OMS）固定化脂肪酶。固定化脂肪酶CSL@OMS-C8在無(wú)溶劑生產(chǎn)乙酸肉桂酯中催化效果顯著，是極具工業(yè)化應(yīng)用潛力的催化劑。