雙歧桿菌三聯(lián)活菌對(duì)小鼠非酒精性脂肪肝模型中腸道微生物組的影響

李 春，周 瓊，梅 聰，黃潔杰，王毅鵬，周松蘭，鄭 倩，唐 哲

（昆明市延安醫(yī)院內(nèi)分泌科，云南 昆明 650051）

代謝紊亂，如非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和肥胖癥，是影響全球健康的重大問題，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)[1-2]。關(guān)于代謝性疾病的發(fā)生，越來越多的研究揭示了腸道微生物群對(duì)機(jī)體代謝紊亂的影響，這方面的研究引起了越來越多的興趣和關(guān)注[3-5]。腸道菌群是一個(gè)復(fù)雜的微生物群落和具有高度互動(dòng)的微生物集合，同宿主相互作用較為緊密[6]。腸道菌群在人類疾病的發(fā)展、預(yù)防和治療中的潛在作用日益顯現(xiàn)，尤其與肥胖和NAFLD 等代謝疾病的發(fā)展和改善密切相關(guān)[7-8]。腸道菌群的組成和變化可以直接影響宿主的生理穩(wěn)態(tài)[9]。此外，腸道微生物的代謝潛力和代謝產(chǎn)物已被確定為影響宿主免疫和代謝功能的重要因素[10]。鑒于腸道菌群及其代謝物在維持宿主生理機(jī)能和代謝穩(wěn)態(tài)的重要作用，靶向腸道微生物群是調(diào)控機(jī)體功能和代謝紊亂的潛在療法。

腸道菌群的組成受益生菌豐度的影響較大。益生菌可以降低腸道內(nèi)毒素的水平，使得腸道黏膜屏障穩(wěn)步提升，減弱身體的炎癥反應(yīng)[7-9]，因此益生菌制劑有預(yù)防并改善非酒精性脂肪肝的潛能。目前廣泛應(yīng)用的益生菌制劑主要有細(xì)菌與真菌，涵蓋腸球菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、布拉氏酵母菌等[11]。本研究利用高脂肪飲食（high fat diet，HFD）構(gòu)建NAFLD 小鼠模型，并探究了雙歧桿菌三聯(lián)活菌在小鼠NAFLD 模型中的療效和對(duì)腸道微生物組的影響。利用肝臟病理切片觀察到雙歧桿菌三聯(lián)活菌能改善NAFLD 模型中肝臟脂肪的累積和細(xì)胞肥大。通過宏基因組功能分析揭示，雙歧桿菌治療組具有最高比例的促進(jìn)脂質(zhì)代謝的腸道微生物，并且這些微生物可能參與了谷胱甘肽代謝、鞘脂代謝和嘌呤代謝等途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的脂肪代謝功能。

1 對(duì)象與方法

1.1 模型構(gòu)建

30 只6～8 周、15～20 g 雄性C57BL/6J 小鼠購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10），NAFLD 模型組（n=10）和雙歧桿菌組（n=10），分別使用普通飼料、高脂飼料（88%普通飼料+10%豬油+2%膽固醇）和高脂飼料聯(lián)合雙歧桿菌三聯(lián)活菌（4×1010CFU/d）飼養(yǎng)8 周，所有飼料均進(jìn)行高溫消毒滅菌處理。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～22℃，濕度50%～55%，明暗各12 h。各組小鼠飼養(yǎng)8 周后進(jìn)行麻醉并處死取材，組織分別保存于-80℃冰箱并使用4%多聚甲醛固定。本研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2023005）。

1.2 HE 染色

在研究時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，取小鼠肝臟，完成肝臟石蠟切片制備，經(jīng)HE 染色處理之后，光鏡下對(duì)肝脂肪變性、炎癥活動(dòng)狀況展開綜合評(píng)估，HE 切片用OLYMPUS 攝像系統(tǒng)進(jìn)行觀察和攝片。

1.3 ELISA 檢測(cè)

小鼠實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)取各組小鼠外周血，血液凝固后離心分離血清（3 000 r/min，5 min），使用丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（酶聯(lián)生物，ml095164）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALT 水平。

1.4 小鼠糞便樣本宏基因組檢測(cè)

在研究時(shí)間點(diǎn)結(jié)束時(shí)，收集各組小鼠糞便樣本，基因組DNA 抽提完成，用1%瓊脂糖凝膠對(duì)其進(jìn)行電泳檢測(cè)抽提。根據(jù)相應(yīng)測(cè)序區(qū)域，完成帶barcode 特異引物合成處理。通過正式試驗(yàn)條件完成所有樣本處理，依次反復(fù)進(jìn)行3 次，把1個(gè)樣本PCR 產(chǎn)物經(jīng)混合處理再用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR 產(chǎn)物回收用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒（AXYGEN 公司）切膠，Tris_HCl 洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。根據(jù)電泳對(duì)定量結(jié)果加以明確，QuantiFluor?-ST 藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega 公司）完成PCR 產(chǎn)物檢測(cè)定量，以各個(gè)樣本測(cè)序量具體要求，完成對(duì)應(yīng)比例混合。在目標(biāo)區(qū)域外端PCR 加入Illumina 官方接頭序列，凝膠回收試劑盒切膠完成PCR 產(chǎn)物回收，Tris-HCl緩沖液洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，氫氧化鈉變性，得到單鏈DNA 片段。Illumina 系統(tǒng)化學(xué)切割“熒光基團(tuán)”“終止基團(tuán)”，讓3’端粘性恢復(fù)，讓第2 個(gè)核苷酸再聚合，對(duì)所收集熒光信號(hào)詳細(xì)結(jié)果進(jìn)行相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)模板DNA 片段序列加以明確。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

連續(xù)變量數(shù)據(jù)顯示均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（SEM），體現(xiàn)均值抽樣分布的離散程度。3 組間的均值差異使用單因素 ANOVA 分析進(jìn)行比較，并進(jìn)行Tukey’s 事后檢驗(yàn)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析和制圖通過Graphpad Prism 7.0 進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 雙歧桿菌能改善小鼠NAFLD 發(fā)生

各組小鼠肝臟組織切片HE 染色情況，見圖1A。對(duì)照組的肝細(xì)胞大小正常，無脂肪浸潤(rùn)，未形成纖維組織。與對(duì)照組（正常飲食）小鼠相比，NAFLD 組（高脂飲食）小鼠肝臟脂肪累積增加，脂滴增多并且肝臟細(xì)胞肥大，胞漿脂肪出現(xiàn)大量空泡。雙歧桿菌組肝臟細(xì)胞內(nèi)脂滴積累明顯減少，細(xì)胞內(nèi)空泡現(xiàn)象明顯減少。ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NAFLD 組小鼠血中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）活性增加（P<0.000 1 ）；雙歧桿菌治療能降低NAFLD 小鼠血清的ALT 水平（P<0.000 1），見圖1B。

圖1 雙歧桿菌改善小鼠NAFLD 發(fā)生Fig.1 Bifidobacterium improves the NAFLD in the mouse model

2.2 宏基因組分析

各組小鼠糞便樣本鑒定微生物種類分布韋恩圖，見圖2。各組小鼠糞便分離樣本的腸道微生物種類豐富，相較于對(duì)照組和NAFLD 組，雙歧桿菌組小鼠的腸道菌群種類顯著增加，共鑒定出5 295 種不同菌種，其中4 745 種菌株被特異性地在雙歧桿菌組中被鑒定出。3 組小鼠共有的菌種類為348 種，見圖2。

圖2 各組小鼠糞便樣本鑒定微生物種類韋恩圖Fig.2 Venn diagram of microbial species identified from fecal samples of mice in each group

各組小鼠糞便樣本鑒定微生物種類豐度情況，見圖3。結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，NAFLD 組小鼠腸道Muribaculaceae和Helicobacteraceae豐度增加；相比NAFLD 組，雙歧桿菌組中Muribaculaceae和Akkermansiaceae豐度增加。相比對(duì)照組，NAFLD組小鼠腸道中Lachnospiraceae和Ruminococcaceae豐度降低；相比NAFLD 組，雙歧桿菌組中Lachnospiraceae和Helicobacteraceae豐度降低。同時(shí)，Bacteroidaceae在NAFLD 組中豐度降低，而與NAFLD 組相比其豐度在雙歧桿菌組中升高。

圖3 各組小鼠糞便樣本鑒定微生物種類豐度分布Fig.3 Abundance distribution of identified microbial species in fecal samples in each group

通過將宏基因組數(shù)據(jù)測(cè)序得到的基因片段所對(duì)應(yīng)的功能進(jìn)行分類，一共總結(jié)出六大類，見圖4。3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組別中大于40%的基因都與代謝有關(guān)，其中對(duì)照組中與代謝有關(guān)的基因片段最豐富，占比超過50%。此外在人類疾病相關(guān)的基因分析中，NAFLD 組所包含的基因片段比例在3 組中占比最多，見圖4。

圖4 各組小鼠糞便樣本宏基因組數(shù)據(jù)測(cè)序基因片段功能富集分析Fig.4 Functional enrichment analysis of gene fragments in the metagenomic data of fecal samples from mice in each group

基于基因富集相關(guān)的信號(hào)通路分析，通過LDA 效應(yīng)大?。↙EfSe）分析，確定了20 條代謝途徑，見圖5。其中，10 條在對(duì)照組低表達(dá)而在NAFLD 組和雙歧桿菌組高表達(dá)的代謝途徑包括甲烷代謝、硫代謝、硝基甲苯降解等。另有10 條代謝途徑呈現(xiàn)對(duì)照組高表達(dá)而在NAFLD 組和雙歧桿菌組低表達(dá)，包括?；撬岽x、阿卡波糖生物合成、異喹啉生物堿生物合成、鏈霉素生物合成、煙酸代謝等。此外，谷胱甘肽代謝和鞘脂代謝在NAFLD 組表達(dá)增加而在雙歧桿菌組表達(dá)降低；嘌呤代謝和玉米素生物合成在NAFLD 組表達(dá)降低而在雙歧桿菌組表達(dá)升高?？傮w而言，雙歧桿菌組腸道微生物代謝功能水平介于對(duì)照組和NAFLD組之間。

圖5 生物信息學(xué)分析宏基因組富集的代謝功能熱圖分析Fig.5 Heatmap summary of the bioinformatics analysis of metabolic functions in the metagenomic data

3 討論

已有證據(jù)顯示雙歧桿菌對(duì)機(jī)體的代謝調(diào)控與代謝性疾病的發(fā)展有顯著的關(guān)聯(lián)性。Qian 等[12]發(fā)現(xiàn)雙歧桿菌可以在小鼠模型中緩解2 型糖尿病，這與雙歧桿菌的代謝基因組和腸道微生物群調(diào)節(jié)能力有關(guān)。Fang 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌介導(dǎo)色氨酸代謝，可通過腸皮軸改善特應(yīng)性皮炎。這些研究揭示了示雙歧桿菌改善代謝疾病的潛能。NAFLD 是一種常見的代謝疾病，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，已成為醫(yī)療保健系統(tǒng)的主要負(fù)擔(dān)之一[14]。然而，雙歧桿菌對(duì)NAFLD 的潛在療效和在NAFLD 模型中對(duì)腸道微生物組成的影響尚不明確。

在此項(xiàng)研究中，通過高脂飲食建立的小鼠NAFLD 模型中顯示，雙歧桿菌對(duì)NAFLD 造成的肝臟細(xì)胞脂肪積累及肝臟功能損傷有明顯的改善作用。另外腸道微生物宏基因組研究的結(jié)果揭示了雙歧桿菌可以誘導(dǎo)腸道微生物菌群組成和功能的改變，特別是與機(jī)體代謝功能相關(guān)的菌種豐度的變化。本研究結(jié)果顯示高脂飲食增加小鼠腸道Muribaculaceae和Helicobacteraceae豐度。而相比NAFLD 組，雙歧桿菌組中Lachnospiraceae和Helicobacteraceae豐度降低，揭示了NAFLD 模型中腸道微生物菌落的變化和栓歧桿菌對(duì)腸道微生物菌落的影響。Zeng 等[15]研究報(bào)道了Lachnospiraceae在高脂飲食小鼠腸道中的豐度的升高，且與腸道炎癥息息相關(guān)。Yuan 等[16]研究報(bào)道Helicobacteraceae在高脂飲食小鼠腸道中豐度增加，并且與肝臟脂肪量呈正相關(guān)關(guān)系。因此，雙歧桿菌所引起的Lachnospiraceae和Helicobacteraceae豐度降低可能對(duì)NAFLD 導(dǎo)致的肝臟脂肪損傷起到保護(hù)作用。另外，Bacteroidaceae是一類具有產(chǎn)生酸性代謝物能力的微生物，研究表明其可以保護(hù)肝損傷的發(fā)生[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)益生菌雙歧桿菌治療后Bacteroidaceae在小鼠腸道中的豐度增加。另外，Do 等[19]研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌可以通過提高腸道通透性和改善炎癥細(xì)胞因子來改善NAFLD 所造成的肝臟纖維化。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致，都揭示了雙歧桿菌在NAFLD 模型中對(duì)肝臟損傷的保護(hù)作用。本研究的結(jié)果進(jìn)一步揭示了雙歧桿菌可能通過降低腸道微生物中不利菌群的比例并增加有益菌群的比例，從而對(duì)NAFLD 產(chǎn)生保護(hù)作用。

最近的一些研究顯示，多糖干預(yù)可能是一種有效改善代謝相關(guān)疾病的方法，調(diào)節(jié)與糖代謝相關(guān)的特定細(xì)菌可以對(duì)NAFLD 在內(nèi)的代謝性疾病產(chǎn)生治療效果[20-21]。麥冬多糖可以增加腸道乳酸桿菌的數(shù)量，并顯著改善NAFLD 小鼠的腸道微生物菌落失調(diào)[22]。靈芝多糖可以降低腸道內(nèi)厚壁門菌的豐度并增加桿菌門微生物的比例，從而改善高脂飲食小鼠的脂肪代謝[23]。這些結(jié)果暗示了改變腸道微生物組成和桿菌比例可以調(diào)控脂質(zhì)代謝。本研究結(jié)果顯示，腸道微生物組分析中谷胱甘肽代謝和鞘脂代謝相關(guān)功能在NAFLD 組增加而在雙歧桿菌組中降低；嘌呤代謝和玉米素生物合成相關(guān)功能在NAFLD 組降低而在雙歧桿菌組增強(qiáng)?？傮w而言，雙歧桿菌組腸道微生物代謝功能水平介于對(duì)照組和NAFLD 組之間。這些結(jié)果與微生物不同代謝產(chǎn)物可參與調(diào)節(jié)腸易激綜合征、肥胖癥和NAFLD 等代謝疾病的研究結(jié)果相一致[24-26]。本研究在小鼠模型中揭示了雙歧桿菌可調(diào)控腸道微生物群組成和其代謝功能，改善NAFLD 癥狀，為利用腸道微生物療法改善和治療NAFLD 提供了理論基礎(chǔ)。