hsa-let-7a-5p 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞增殖及凋亡

張曄琳 ，馬麗婭 ，彭旭暉 ，楊禾豐 ，佘 睿

（1）昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500;2）云南省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，云南 昆明 650500;3）永善縣人民醫(yī)院，云南 昭通 657300;4）昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓科，云南 昆明 650500）

牙周炎（Periodontitis）是指由菌斑生物膜引起的感染性牙周疾病，導(dǎo)致牙周支持組織破壞、牙周袋形成、牙槽骨吸收，最終牙齒松動脫落，是成年人失牙的重要原因之一[1]。牙周炎不僅危害人類口腔健康，還與心血管疾病[2]、糖尿病[3]等全身性疾病有關(guān)聯(lián)。牙周韌帶組織中存在的一類具有自我更新、多向分化潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞即牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下，可誘導(dǎo)分化成為牙周韌帶組織、骨組織、軟骨組織、脂肪組織等[4]。在炎癥條件下，PDLSCs 的生理功能受到了影響[5]。因此，探究PDLSCs 生理功能的調(diào)控機(jī)制是研究牙周炎致病機(jī)理的重要環(huán)節(jié)之一。

microRNA 是一類長度約為22nt 的短序列非編碼RNA，其發(fā)揮作用的方式主要是通過在細(xì)胞胞質(zhì)中與Argonaute 蛋白家族結(jié)合形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），該復(fù)合體通過降解和翻譯抑制兩條途徑作用于mRNA 介導(dǎo)基因沉默[6]。microRNA 參與了生物生長發(fā)育、細(xì)胞分化凋亡、腫瘤的形成轉(zhuǎn)移等，并可作為慢性牙周炎的潛在診斷生物標(biāo)志物，影響其發(fā)生發(fā)展[7]。其中，參與調(diào)控細(xì)胞生長分化的重要miRNA（let-7a）似乎同樣參與了牙周炎的進(jìn)展。然而，其在牙周炎中的具體作用尚未完全明確，研究表明在牙周炎患者的牙齦組織中l(wèi)et-7a 表達(dá)上調(diào)[8-9]，而let-7a-5p 在侵襲性牙周炎患者的唾液中下調(diào)[10]。因此，為了進(jìn)一步闡明let-7a-5p 參與牙周炎進(jìn)展的可能機(jī)制，本研究通過過表達(dá)/抑制PDLSCs 中l(wèi)et-7a-5p 的表達(dá)水平，探究其對PDLSCs 增殖及凋亡的影響，旨在為闡明其在牙周炎中的調(diào)控機(jī)制提供思路。

1 材料與方法

1.1 試劑及設(shè)備

α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、I 型膠原酶、0.25%胰蛋白酶、PBS、雙抗、riboFECT CP Transfection Kit（銳博生物，中國）、Cell Counting Kit-8（美侖生物，中國）、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（美侖生物，中國）、Cell-Light EdU Apollo488 In Vitro Kit（銳博生物，中國）、RNAiso for Small RNA（TaKaRa，日本）、PrimeScriptTM RT Master Mix（Perfect Real Time，Takara，日本）、TB Green? Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus，Takara，日本）、BCA 蛋白檢測試劑盒（Beyotime，中國）、細(xì)胞凋亡試劑盒（凱基，中國）、has-let-7a-5p mimics、mimics NC、inhibitor、inhibitor NC合成自中國銳博生物科技有限公司。

培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板（Corning，美國）、35 mm 激光共聚焦培養(yǎng)皿（NEST，中國）、潔凈操作臺（蘇凈凈化設(shè)備公司，中國）、離心機(jī)、QuantStudioTM Real-Time PCR System、酶標(biāo)儀、超低溫冰箱、二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，美國）、倒置相差顯微鏡（Leica，德國）、細(xì)胞計數(shù)儀（Countstar IC1000，中國）、TECHNE 梯度PCR 儀（TECHNE，英國）、Quawell Q3000 微量紫外分光光度計（QUAWELL，美國）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf，德國）、Agilent NovoCyte 流式細(xì)胞儀（Agilent Technologies，美國）、激光共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）。

本實驗獲昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：KYKQ2020MEC020）。在患者知情同意的情況下，于昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科收集因為正畸治療需要拔除的無疾病的年輕前磨牙，共15 顆。

1.2 研究方法

1.2.1 牙周膜干細(xì)胞的原代培養(yǎng)按照課題組前期研究方法分離培養(yǎng)牙周膜干細(xì)胞[11]。酶消法消化牙周膜組織塊，1 000 r/min 離心2 min，棄上清。將含有牙周膜組織塊的混懸液均勻接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，并加入1 mL 20%FBS 的α-MEM 培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%左右，胰酶消化，細(xì)胞傳代。

1.2.2 hsa-let-7a-5p 轉(zhuǎn)染以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于6 孔板中，待細(xì)胞融合至30%～50%時利用riboFECT CP Transfection Kit將50 nM miRNA mimic，50 nM miRNA mimic nc，100 nM miRNA inhibitor，100 nM miRNA inhibitor nc 轉(zhuǎn)染至PDLSCs 中，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)以便進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.3 RT-qPCR 測定轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染48 h 后利用RNAiso for Small RNA 提取miRNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計合成hsa-let-7a-5p 引物（合成自廣州銳博生物技術(shù)有限公司），RTqPCR 檢測基因表達(dá)，實驗結(jié)果用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，U6 作為內(nèi)參：forward primer（5′-3′）CTCGCT TCGGCAGCACA；reverse primer（5′-3′ ）AACGC TTCACGAATTTGCGT。

1.2.4 CCK-8 實驗以3×103個/孔的密度接種PDLSCs 于96 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換不含F(xiàn)BS 的α-MEM 培養(yǎng)基饑餓過夜。次日，按分組對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞培養(yǎng)0～7 d，每日同一時間，按10 μL/孔加入CCK-8 工作液，37℃避光孵育2 h，孵育結(jié)束后通過酶標(biāo)儀在波長為450 nm 處測定OD 值。

1.2.5 細(xì)胞周期以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后更換不含F(xiàn)BS 的α-MEM 培養(yǎng)基饑餓過夜。細(xì)胞融合至30%～50%時按分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h 后，收集細(xì)胞至離心管，PBS 洗滌，75%乙醇固定細(xì)胞4℃靜置過夜，固定完成后PBS 洗滌細(xì)胞，2 900 r/min離心5 min 沉淀細(xì)胞，每個樣品加入500 μL 染色工作液（按照說明書配置），避光、37℃下繼續(xù)孵育0.5 h。24 h 內(nèi)于流式細(xì)胞儀下將激發(fā)波長設(shè)置為488 nm 對紅色熒光及光散射情況進(jìn)行檢測。

1.2.6 EdU 實驗以1×105個/孔的密度接種PDLSCs 于激光共聚焦皿中，待細(xì)胞貼壁后，更換不含F(xiàn)BS 的α-MEM 培養(yǎng)基饑餓過夜。細(xì)胞融合至30%～50%時按分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h 后進(jìn)行EdU 標(biāo)記即按100 μL/孔更換50 μM EdU 培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。24 h 后棄舊培養(yǎng)基，并使用PBS洗滌細(xì)胞2 次，按50 μL/孔的劑量加入已配置好的細(xì)胞固定液，室溫下孵育30 min。配置2 mg/mL的甘氨酸對過量醛基進(jìn)行中和，PBS 洗滌細(xì)胞，含0.5% TritonX-100 的PBS 脫色搖床孵育，PBS洗滌細(xì)胞，按500 μL/孔加入1×Apollo 染色反應(yīng)液，避光室溫?fù)u床孵育30 min，0.5% TritonX-100 的PBS 清洗細(xì)胞3 次，DAPI 染色2 min，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，濕潤狀態(tài)下利用激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察采圖。

1.2.7 細(xì)胞凋亡接種PDLSCs 于6 孔板中，密度為1×105個/孔，待細(xì)胞生長融合至30%～50%時按分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h 后，無EDTA 胰酶消化，PBS 洗滌細(xì)胞2 次，每管依次加入500 μL Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC、5 μL Propidium Iodide 重懸細(xì)胞，混勻，室溫避光孵育15 min，1 h 內(nèi)于流式細(xì)胞儀下進(jìn)行檢測。

1.2.8 let-7a-5p 靶基因預(yù)測及功能分析通過TargetScan、miRDB、miRTarbase 3 個網(wǎng)站搜索let-7a-5p 的預(yù)測靶基因，取三者交集的靶基因進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析，得到let-7a-5p靶基因的相關(guān)細(xì)胞功能和信號通路，使用R language package gplots 繪制GO 和KEGG 富集氣泡圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析及作圖。選用Mean±SD對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述，采用獨立樣本t檢驗進(jìn)行單一變量2 組資料間比較，采用單因素方差分析進(jìn)行多組資料間比較，單因素方差分析有差異后選用tukey’s mutiple comparisons test 進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 let-7a-5p 轉(zhuǎn)染效率測定

將let-7a-5p mimics、mimics nc、let-7a-5p inhibitor、inhibitor nc 轉(zhuǎn)染至PDLSCs 24 h 后，激光共聚焦顯微鏡下觀察到大量綠色熒光顆粒分布于PDLSCs 胞質(zhì)中，見圖1A。RT-qPCR 定量分析轉(zhuǎn)染效率結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h 后，let-7a-5p mimics 組的表達(dá)量為mimics nc 組的20.62 倍（P<0.01）。let-7a-5p inhibitor 組的表達(dá)量為inhibitor nc 組的0.23 倍（P<0.000 1），見圖1B。提示let-7a-5p 成功且有效轉(zhuǎn)染至PDLSCs。

圖1 let-7a-5p 轉(zhuǎn)染效率測定Fig.1 Transfection efficiency of let-7a-5p

2.2 let-7a-5p 抑制牙周膜干細(xì)胞增殖

將let-7a-5pmimics 及inhibitor 轉(zhuǎn)染進(jìn)PDLSCs后，通過CCK8、EdU、細(xì)胞周期實驗探究let-7a-5p 對PDLSCs 增殖能力的影響。CCK-8 實驗結(jié)果顯示，第3～7 天，let-7a-5p mimics 組的增殖能力明顯低于mimics nc 組（第3 天P<0.001，第4～7 天P<0.000 1），見圖2A；而在第7 天時，let-7a-5p inhibitor 組細(xì)胞增殖水平高于inhibitor nc 組（P<0.05），見圖2B。EdU 實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48 h 后，mimics 組細(xì)胞增殖比例低于mimics nc 組（P<0.05），見圖2C；inhibitor 組細(xì)胞增殖比例高于inhibitor nc 組（P<0.01），見圖2D。細(xì)胞周期實驗中，mimics 組的S 期+G2/M 期比例低于mimics nc 組，見圖2E；inhibitor 組的S 期+G2/M期比例高于inhibitor nc 組，見圖2F。綜上結(jié)果提示let-7a-5p 抑制牙周膜干細(xì)胞增殖。

圖2 let-7a-5p 抑制牙周膜干細(xì)胞增殖Fig.2 let-7a-5p inhibits periodontal ligament stem cell proliferation

2.3 let-7a-5p 促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，在let-7a-5p 轉(zhuǎn)染PDLSCs 48 h 后，與let-7a-5p mimics nc 組相比，let-7a-5p mimics 組細(xì)胞凋亡率增高，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖3A。與let-7a-5p inhibitor nc 組相比，let-7a-5p inhibitor 組細(xì)胞凋亡率降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖3B。表明let-7a-5p 促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞凋亡。

2.4 let-7a-5p 靶基因預(yù)測及功能分析

利用TargetScan、miRDB、miRTarbase 預(yù)測let-7a-5p 的靶基因后取三者交集，得到157 個靶基因，見圖4A，將這157 個靶基因進(jìn)行GO 功能注釋，得到其主要參與蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的調(diào)控、細(xì)胞周期等，見圖4B。對靶基因進(jìn)行KEGG 信號通路富集分析，得到富集度最高的信號通路為PI3K-Akt 通路，表明let-7a-5p 的靶基因可能激活該通路影響細(xì)胞的代謝、增殖、凋亡，見圖4C。

圖4 let-7a-5p 靶基因及功能預(yù)測Fig.4 let-7a-5p target gene and function prediction

3 討論

牙周炎在世界范圍內(nèi)患病率高達(dá)45%至50%[12]，目前尚未找到根治手段，傳統(tǒng)療法僅能控制炎癥進(jìn)展，難以實現(xiàn)受損牙周組織再生[13]。探究牙周炎發(fā)病機(jī)制，尋找治愈方法一直以來都是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。本研究聚焦于健康者與牙周炎患者口腔中表達(dá)水平具有差異的miRNA let-7a-5p 對PDLSCs 生理功能的影響，從miRNA 調(diào)控牙周組織中干細(xì)胞的角度探究牙周病的發(fā)病機(jī)制。

細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染是外源基因進(jìn)入真核細(xì)胞的重要研究方法之一。本研究通過轉(zhuǎn)染試劑包裹let-7a-5p mimics/inhibitor，使其順利進(jìn)入細(xì)胞，實現(xiàn)了let-7a-5p 表達(dá)水平的上調(diào)和抑制。此種方法將模仿成熟miRNA 雙鏈體的mimics 和可與成熟miRNA 形成不可逆結(jié)合的inhibitor 遞送至胞質(zhì)，即實現(xiàn)了miRNA 表達(dá)水平的調(diào)控[14-16]。省去了構(gòu)建質(zhì)粒等載體的繁瑣操作，也未采用慢病毒，無需擔(dān)憂病毒防護(hù)。

miRNA 是一類非編碼RNA，可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，let-7 家族屬于其中的一大類，多項研究提出let-7 可作為腫瘤抑制因子[17]。作為細(xì)胞增殖途徑的主要調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂功能的多個基因可被let-7 直接或間接抑制[18]。例如let-7a-5p 在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其可調(diào)控TGF-β1/ TGFBR1/pSmad3 通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[19]。let-7a 還可通過靶向aurora-B 抑制骨肉瘤細(xì)胞生長[20]。let-7a 亦可通過下調(diào)USP32 表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[21]。在非腫瘤細(xì)胞中例如人哮喘氣道平滑肌細(xì)胞，let-7a 可抑制其增殖而促進(jìn)凋亡[22]。然而let-7a-5p 對PDLSCs增殖能力的影響卻鮮有報道，本研究初步證實了let-7a-5p 抑制PDLSCs 增殖，這與以往let-7a-5p 對細(xì)胞功能影響的研究結(jié)果一致。

本研究通過CCK-8、細(xì)胞周期、EdU 實驗檢測了let-7a-5p 對PDLSCs 增殖的影響。CCK-8實驗發(fā)現(xiàn)自第3～4 天起各組細(xì)胞增殖水平出現(xiàn)明顯差異，EdU 及細(xì)胞周期實驗在細(xì)胞干預(yù)早期（48 h）即可觀察到。這歸因于3 種實驗的檢測原理不同，CCK-8 實驗是通過線粒體內(nèi)脫氫酶將WST-8 還原成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，其顏色的深淺與正在進(jìn)行代謝活動的細(xì)胞數(shù)量成正比[23]，能間接檢測細(xì)胞總體增殖效果。然而，EdU 實驗是在DNA 合成過程中用可被熒光探針標(biāo)記的核苷酸類似物EdU 替代胸腺嘧啶參與DNA合成，反應(yīng)細(xì)胞增殖情況[24]。細(xì)胞周期實驗是通過檢測DNA 含量以此計算處于有絲分裂各個時期的細(xì)胞百分比來測定增殖率[25]。EdU 和細(xì)胞周期實驗的檢測對象均為正在進(jìn)行DNA 合成的細(xì)胞，因此在時間和空間上早于檢測細(xì)胞代謝產(chǎn)物的CCK-8 實驗。

細(xì)胞凋亡是一種不引起炎癥反應(yīng)的程序性細(xì)胞死亡，可參與到維持免疫系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)中，異常的細(xì)胞凋亡亦會影響疾病的發(fā)展[26]。半乳糖凝集素-1 可抑制LPS 誘導(dǎo)的PDLSCs 自噬和凋亡，促進(jìn)牙周組織再生[27]。既往多項研究表明，let-7a可促進(jìn)多種癌癥細(xì)胞凋亡。例如let-7a-5p 可以通過降低BZW2 的表達(dá)來抑制肝癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。Let-7a 靶向EZH2 抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[29]。而在本研究中得到let-7a-5p 促進(jìn)PDLSCs 凋亡的結(jié)果，與以往研究一致。

本研究中還對let-7a-5p 靶基因及其相關(guān)細(xì)胞功能、信號通路富集進(jìn)行了生物學(xué)信息分析。GO 功能注釋以及KEGG 通路分析二者結(jié)合來看，let-7a-5p 靶基因與PI3K-Akt 通路關(guān)系密切。PI3K-Akt 通路與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)[30]，亦有研究表明，可通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt 信號通路對牙周炎進(jìn)行治療[31]。因此在后續(xù)的實驗探究中本課題組將以PI3K-Akt 信號通路為研究對象進(jìn)行相關(guān)試驗，探究let-7a-5p 影響PDLSCs 生理功能的具體機(jī)制。

綜上所述，本研究證實了let-7a-5p 抑制PDLSCs 增殖，促進(jìn)其凋亡。為miRNA 調(diào)控牙周炎的發(fā)展增加了理論基礎(chǔ)，也為利用干細(xì)胞療法治療牙周炎提供了借鑒意義。當(dāng)然，本研究僅局限于let-7a-5p 對PDLSCs 增殖、凋亡的影響，為了更完善地闡釋其對牙周炎的調(diào)控作用，還需進(jìn)一步探究let-7a-5p 對PDLSCs 其它生理功能的影響和炎癥條件下let-7a-5p 對PDLSCs 的影響。