運動康復對心肌梗死大鼠心臟纖維化及心功能的影響

吳長勇，王 睿，保蘇麗，李銳潔，孫 煌，葉雨佳，徐 菲，彭云珠

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南 昆明 650032）

心血管疾病是全球人類死亡的主要原因之一[1]，位于我國城鄉(xiāng)居民疾病死亡構(gòu)成比首位，患病人數(shù)高達3.3 億，其中冠心病達1 139 萬，仍處于持續(xù)上升階段[2]。心肌梗死（myocardial infarction，MI）以高患病率、高住院率和高死亡率為特點，明顯增加了患者家庭和社會的經(jīng)濟與精神負擔。目前冠狀動脈介入治療仍是MI 最主要的治療手段，隨著醫(yī)療器械和診治水平提高，MI患者生存率不斷提高，但術(shù)后的管理尤為重要。目前國內(nèi)外指南均指出心臟康復是二級預防的重要指標[3-4]，且運動康復作為中心元素，是一種非藥物性和非創(chuàng)傷性的干預措施，通過減少活性氧產(chǎn)生及炎癥反應、增加梗死灶周圍血管生成，減少梗死面積和心臟纖維化，改善心功能，提高心血管疾病事件后的生存率[5]。研究表明，自噬是心血管疾病預后的重要調(diào)節(jié)機制，過度的自噬或自噬不足將導致心血管事件發(fā)生[6]。因此，本研究基于MI 大鼠模型，探究運動康復對心肌梗死大鼠心臟纖維化及心功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物選取3～4 個月、體重180～220 g 雄性SD 大鼠30 只，購于昆明醫(yī)科大學實驗動物學部[許可證號：SYXK（滇）K2020-0006]，其中構(gòu)建MI 模型中因心室顫動和氣胸死亡2 只；術(shù)后1 周內(nèi)因肺部感染死亡2 只；實驗過程中因MI 后心力衰竭死亡2 只，最終共納入24 只大鼠。分籠飼養(yǎng)（每籠3～4 只），保持恒定的12 h 光－暗周期，隨意進食和飲水。飼養(yǎng)1 周適應環(huán)境。本研究通過昆明醫(yī)科大學實驗動物中心及實驗倫理委員會批準（倫理批號：kmmu20221866）。

1.1.2 主要儀器設(shè)備大鼠輪轉(zhuǎn)式跑步機（YLS-15A，濟南益延科技發(fā)展有限公司）、超高分辨率小動物超聲成像系統(tǒng)（Vevo3100，F(xiàn)UJIFILM VisualSonics 公司）、小動物呼吸機（ALC-V8S，上海奧爾科特生物科技有限公司）、全息掃描顯微鏡（Pannoramic Confocal，丹吉爾3DHISTECH 公司）、透射電子顯微鏡（CM101，荷蘭Philips）。

1.1.3 主要試劑蘇木素（Sigma，H31316）、伊紅（Sigma，230251）、Masson 染色試劑盒（Solarbio，G1340）、Tunel 檢測試劑盒（ThermoFisher，C10617）。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建MI 模型建模前禁食4～6 h，戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔麻醉，固定，連接小動物呼吸機和心電監(jiān)護儀，呼吸機參數(shù)：潮氣量（3 mL/100 g）、呼吸頻率60～80 次/min、呼吸比2∶1。常規(guī)消毒鋪巾，開胸暴露心臟，6-0 絲線于左冠狀靜脈主干肺動脈圓錐下緣2～3 mm 處結(jié)扎LAD，建模成功的指標：肉眼可見結(jié)扎遠端心肌顏色變淺或變白，心電圖ST 段弓背向上抬高或T波倒置。探查胸腔無出血后逐層關(guān)胸。假手術(shù)組只穿針引線，余步驟同MI 組。大鼠自主呼吸恢復后撤離呼吸機，術(shù)后抗感染治療3 d。

1.2.2 實驗分組術(shù)后1 周大鼠處于穩(wěn)定期，隨機分為4 組：MI-E 組（n=6）、MI-Sed 組（n=7）、Sham-E 組（n=6）和Sham-Sed 組（n=5）。

1.2.3 運動方案參照既往研究與前期預實驗共同制定[5]：適應性運動1 周：10 m/min×10 min，20 min/d，5 d/周；正式運動4 周：每次開始前以10 m/min×10 min 為熱身運動，再以20 m/min×7 min 和15 m/min×3 min 交替運動3 組，40 min/d，5 d/周。不運動組全程不參與運動訓練。

1.2.4 左心室結(jié)構(gòu)與功能檢查運動訓練結(jié)束后1 d 行超聲心動圖檢查[7]。心前區(qū)褪毛，七氟烷吸入麻醉，固定，連接心電監(jiān)測，心率控制為350～400 次/min，用MX250 探頭，頻率為20 MHz于左室長軸切面M 型測量左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左心室前壁收縮末期和舒張末期厚度（AWTs，AWTd）和左心室后壁收縮末期和舒張末期厚度（PWTs，PWTd），所有測量值均至少從3 個代表性周期中進行，并取平均值。計算左心室射血分數(shù)（left ventricular eject fraction，LVEF）和短軸縮短率（fraction shortening，F(xiàn)S），其中LVEF%=（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100+[100-（LVEDD^2-LVESD^2）/LVEDD^2 ×100] × 0.15，F(xiàn)S%=（LVEDD-LVESD）/LVEDD ×100。

1.2.5 心臟標本制備和保存摘取心臟，修剪殘余組織及清洗殘血，沿結(jié)扎線以下從心尖到心底垂直方向橫切（即沿左室短軸切面橫切）取部分組織于4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋固定，用于HE、Masson 和Tunel 染色；取心肌梗死與正常組織交界區(qū)于電鏡液保存，用于透射電鏡檢測。

1.2.6 組織學檢測石蠟脫水及包埋固定，HE染色拍照后用3DHISTECH/Case Viewer 圖像軟件觀察心肌細胞損傷；Masson 染色分析心肌纖維化水平，通過Image J 圖像處理軟件計算心肌梗死面積比即膠原容積分數(shù)（collage volume fraction，CVF），CVF%=（藍色膠原纖維面積/心肌切面總面積）× 100%，可表示心肌纖維化水平；Tunel 染色觀察心肌細胞凋亡，每張切片取3 個高倍鏡視野，計算細胞凋亡指數(shù)=（陽性凋亡心肌細胞核數(shù)/總細胞核數(shù)）× 100%，并取平均值。

1.2.7 自噬小體檢測將組織切成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，通過固定（2.5%戊二醛和1%鋨酸溶液）、脫水（乙醇梯度和丙酮）、浸透（100%丙酮∶樹脂）、包埋（Epon 812 樹脂）、烘箱聚合（37℃12 h，45℃ 12 h，60℃ 48 h）步驟制作成50～70 nm超薄切片，使用醋酸雙氧鈾染色15 min、檸檬酸鉛染色10 min 染色干燥后在透射電鏡下觀察自噬小體和心肌細胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。行方差性檢測，若方差齊（P>0.05）則采用ANOVA 單因素方差分析，LSD-t檢驗比較兩兩之間差異；若方差不齊（P<0.05），則采用近似檢驗DunnettT3 進行統(tǒng)計推斷，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 分析4 組大鼠超聲心動圖指標

與Sham 組比較，MI 組AWTd、AWTs、PWTd、PWTs、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 增大，以MI-Sed 組明顯（P<0.05）；MI-E 組與MI-Sed組比較，LVESD、LVEF 和FS 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；Sham-E 組與Sham-Sed 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 4 組大鼠超聲心動圖指標（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

表1 4 組大鼠超聲心動圖指標（）Tab.1 Parameters of echocardiography in four groups of rats（）

組間比較，aP <0.05；與MI-E組比較，*P <0.05；與MI-Sed組比較，#P <0.05。

2.2 HE 染色結(jié)果

Sham 組心肌細胞結(jié)構(gòu)完整和排列緊密有序，肌纖維方向走形一致，局部呈灶狀的炎性反應；MI 組出現(xiàn)不同程度的心肌細胞溶解，細胞結(jié)構(gòu)模糊和邊界不清，伴炎性細胞浸潤，成纖維細胞增生，而MI-E 組心肌細胞損傷程度較輕，見圖1。

圖1 心臟組織HE 染色（×400）Fig.1 HE staining of heart tissue（×400）

2.3 Masson 染色結(jié)果

Sham 組心肌細胞排列緊密有序，局部呈灶狀纖維化改變；MI 組大鼠心肌細胞排列嚴重紊亂，心肌纖維化程度明顯增加。CVF%在4 組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；其中MIE 組與MI-Sed 組、Sham-E 組與Sham-Sed 組相比較，CVF%降低（P<0.05），見圖2。

2.4 Tunel 染色結(jié)果

與Sham 相比，MI 組心肌細胞凋亡數(shù)量明顯增多（P<0.05）。而MI-E 組較MI-Sed 組心肌細胞凋亡數(shù)量減少（P<0.05）；Sham-E 組較Sham-Sed 組心肌細胞凋亡數(shù)量減少（P<0.05），見圖3和表2。

圖3 心臟組織Tunel 染色（×400）Fig.3 Tunel staining of heart tissue（×400）

表2 4 組大鼠細胞凋亡指數(shù)[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

表2 4 組大鼠細胞凋亡指數(shù)[（），%]Tab.2 A poptosis index in four groups of rats [（），%]

組間比較，aP <0.05；與MI-E組比較，*P <0.05；與MI-Sed組比較，#P <0.05；與Sham-E組比較，+P <0.05。

2.5 透射電鏡檢測結(jié)果

Sham 組心肌細胞形態(tài)正常，線粒體結(jié)構(gòu)完整，肌纖維束排列有序，視野下基本未見自噬小體。MI 組心肌細胞損傷嚴重，細胞結(jié)構(gòu)紊亂，線粒體嵴中斷、排列紊亂，肌纖維束疏松紊亂，間質(zhì)水腫，視野下可見自噬小體形成；而MI-E 組的自噬小體較MI-Sed 組稍多，見圖4。

3 討論

本實驗通過制作大鼠MI 模型，運動訓練5 周發(fā)現(xiàn)，與Sham 組比較，MI-E 組和MI-Sed 組大鼠AWT、PWT、LVEF 和FS 降低，LVEDD 和LVESD 升高，差異具有統(tǒng)計學意義，提示MI 后大鼠左心室結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生改變。但實驗也發(fā)現(xiàn)MI-E 組大鼠左室壁厚度和收縮功能較MI-Sed 組有所改善，表明運動在一定程度上能改善MI 大鼠的左心室功能，見表1。

MI 后心肌細胞發(fā)生一系列病理生理反應，包括炎癥反應、缺血再灌注損傷和活性氧增加、心肌細胞再生與增殖、線粒體與能量代謝、神經(jīng)激素激活、左心室?guī)缀螛?gòu)型改變、心肌肥厚以及心肌纖維化形成，其中主要表現(xiàn)為左心室重塑[8]。左心室重塑是指心臟通過調(diào)節(jié)心室大小、形狀和功能對機械、激素的不良適應。目前，雖然通過血運重建、抗動脈粥樣硬化、抗心力衰竭以及增加微循環(huán)供血治療的同時具有改善心肌纖維化和調(diào)控心肌細胞的生長的作用，但不具有特異性和持續(xù)性。MI 后的不良重塑是發(fā)病率和死亡率的重要決定因素，導致了心臟傳導系統(tǒng)異常、順應性降低及心功能障礙，導致心律失常、心力衰竭甚至死亡，明顯降低了生存率。

3.1 運動減少心肌細胞凋亡及梗死面積，改善心臟纖維化和泵血功能

運動是一種非藥物性和非創(chuàng)傷性的干預措施，作為心臟康復的中心元素，有益于降低心血管疾病的再住院率及死亡率，提高心血管疾病事件后的生存率。本實驗發(fā)現(xiàn)與Sham 組相比較，MI 組CVF%和細胞凋亡指數(shù)明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義，這表明MI 后大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡明顯增加，但運動訓練5 周后MI-E 組的心肌細胞損傷程度、CVF%和細胞凋亡指數(shù)低于MI-Sed 組，而LVEF 和FS 高于MI-Sed 組，差異具有統(tǒng)計學意義，見圖2 和表2。Lai 等[9]研究表明游泳運動可降低TNF-ɑ水平、caspase-3 活化，增強BCL-2 蛋白表達，減少心肌細胞凋亡數(shù)量，改善心肌損傷和梗死面積。間歇性有氧運動4 周可降低Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維表達，抑制心肌間質(zhì)膠原沉積，明顯降低MI 大鼠的LVSP 和CVF%，明顯提高±dp/dt 和LVEDP，改善左心室的心臟纖維化及心功能[10-11]。Li 等[5]研究發(fā)現(xiàn)MI 大鼠分別通過有氧、抗阻和振動運動訓練8 周后，LVIDd 和LVIDs 較對照組明顯降低，而LVEF 明顯升高，其中抗阻運動訓練改善左心室結(jié)構(gòu)與功能效果更明顯，以上研究表明運動可改善MI 后左心室重塑，進一步改善心功能。

3.2 運動減少心肌細胞超微結(jié)構(gòu)損傷，誘導心臟自噬發(fā)揮保護作用

本研究也發(fā)現(xiàn)運動訓練可減少MI 大鼠心肌細胞和線粒體損傷，適度誘導自噬水平發(fā)揮心臟保護作用，見圖4。研究表明，運動可雙向、動態(tài)調(diào)節(jié)心臟自噬水平及通量，清除損傷的線粒體，增加心肌細胞能量代謝，抑制心臟纖維化并改善心功能，發(fā)揮心臟保護作用[12-13]。MI 大鼠通過跑臺、抗阻等運動訓練的研究表明，運動可上調(diào)自噬，增強抗氧化能力，抑制氧化應激，改善心功能[5]。此外，急性運動可激活心肌細胞自噬，上調(diào)自噬水平，保護心臟免受有害的刺激[14]；長期運動可適當改變心臟自噬及其蛋白水平，延緩心臟病理性重塑，改善左心室結(jié)構(gòu)與功能[15-16]。

總之，本實驗基于心肌梗死大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練可改善左心室室壁厚度及心腔大小，減輕心肌細胞和線粒體損傷，降低膠原容積分數(shù)和心肌細胞凋亡程度，改善左心室收縮功能。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)運動可誘導心肌梗死后的心臟自噬發(fā)揮心臟保護作用。但本實驗局限于心肌梗死大鼠心臟組織學檢測，后續(xù)仍需深入探究運動調(diào)控左心室重塑的病理生理作用及相關(guān)分子機制，并結(jié)合臨床心臟康復模式，為運動康復提供一定的理論依據(jù)，這也是本課題組未來研究的重要方向。